小鼠牙胚cDNA文库的构建
作者：顾淑萍 史俊南 郝建军 费俭 王丽珍 刘正 肖明振 吴补领
单位：顾淑萍 史俊南 肖明振 吴补领(第四军医大学口腔医学院口腔内科 710032)；郝建军 王丽珍 刘正(上海第二医科大学口腔医学院)；费俭(上海中国科学院细胞 生物学研究所)
关键词：cDNA文库；小鼠；牙胚；信使RNA；聚合酶链反应
实用口腔医学杂志000203 〔摘要〕 目的：构建具足够库容量的小鼠牙胚cDNA文库。方法： 先提取小鼠牙胚mRNA并反转录成cDNA,经LD PCR扩增后，将双链cDNA 克隆到λTripleX中，包装噬菌体，以XL-l blue为受菌体滴定、扩增文库，用已知的牙胚 基质蛋白基因引物作PCR鉴定文库。结果：500 μl文库的库容量为1 .3×106 pfu，重组率为72%，从文库中克隆到已知的5种牙胚基蛋白基因。结 论：构建的文库具较好的库容量和重组率及较大的插入片段。构建具足够库容量的小鼠牙胚cDNA文库。方法： 先提取小鼠牙胚mRNA并反转录成cDNA,经LD PCR扩增后，将双链cDNA 克隆到λTripleX中，包装噬菌体，以XL-l blue为受菌体滴定、扩增文库，用已知的牙胚 基质蛋白基因引物作PCR鉴定文库。结果：500 μl文库的库容量为1 .3×106 pfu，重组率为72%，从文库中克隆到已知的5种牙胚基蛋白基因。结 论：构建的文库具较好的库容量和重组率及较大的插入片段。
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中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0093-03
Construction of cDNA library of mouse dental germ
Gu Shuping,Shi Junnan,Hao Jianjun
(Stomatological college,Fourth Mi lilary Medical University,Xi'an 710032)
〔Abstract〕Objective:To establish a cDNA library of mouse dental ger m.Method:Extraction of mRNA of mouse dental germ and synth esis of cDNA were conducted with reverse DNA polymerase.Then the ds cDNA was lig ated to TripleX and the recombinant bacteriophage was packaged.The cDNA library was titered and amplified with XL-l blue as receptor bacterium and identified w ith 5 pairs of primers of genes of mouse dental germ matrix proteins by PCR.Result:The titer of the unamplified library was 1.3×106 pfu ,and the percentage of recombinant clones was 72%.And all the five known genes w ere contained in the library,the size of the fragment was 670～1900 bp.Conclusion:The established cDNA library has high titer ,recombinant prcentage and large insert fragments of genes.
, 百拇医药
Key words cDNA library; Mouse;Tooth germ;Messenger RNA;Polymerase chain reaction
牙胚是外胚层和外胚间充质经过相互诱导发育而来，在一系列的相互作用过程中，调控 牙胚分化的基因被激活，随后釉质和牙本质基质蛋白基因开放，最终导致牙齿的成熟。牙胚 发育中开放的调控和结构基因是该组织发育的关键和源泉，对于这些基因的结构和功能的研 究无疑有重要的生物学意义〔1〕。本研究采用PCR方法，构建小鼠牙胚的cDNA文库， 为筛选与牙齿发育有关的新基因打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
取3～7 d龄昆明小鼠(B6D2F1)的第一、第二磨牙牙胚，速冻于液氮并保存。
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1.2 小鼠总RNA提取
按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书提取总RNA。从液氮中取出牙胚，称1 g敲碎，迅 速置研钵中，加液氮研成粉末，转至匀浆器中，待液氮挥发完全，加10 ml TripureTM Isolation Reagent充分匀浆，加2 ml氯仿混匀，作用5～10 min，离心取上清，加5 ml 已丙醇混匀置10 min，离心收集沉淀，φ=75%乙醇洗涤收集沉淀凉干，用515 μl DEPC水溶 解RNA，取10 μl作紫外定量分析，确定RNA浓度，取5 μl作琼脂糖凝胶电泳分析，确定RNA 是否降解。
1.3 小鼠PolyA+mRNA提取
按Promega 公司试剂盒说明书提取PolyA+mRNA。将上述提取的500 μl总RNA在65 ℃ 水溶中解聚10 min，加3 μl Biotinylated-Oligodt、13 μl 20×SSC室温孵育10 min， 将此退火的Oligodt-mRNA杂交产物加于含SA-PMP的柱上，经4次洗涤后，用洗脱液洗下Pol yA+mRNA，经乙醇沉淀洗涤后，用5 μl DEPC水溶解mRNA，取2 μl作琼脂糖凝胶电泳，确 定mRNA的分子大小及初步定量。
, 百拇医药
1.4 cDNA的合成
按Clontech PT3000-2 kit说明书进行。取3 μl mRNA作模板、1 μl Smart Oligonucleat ide、1 μl CDS/3’Primer、20 μl MMLV反转录酶合成第一链；取2 μl第一链cDNA作模板 、2 μl 5’PCR Primer、2 μl CDS/3’Primer、2 μl 50×Advantage Klen Taq Polymer ase Mix合成第二链。在第二链合成时，cDNA∶RNA杂交链上的RNA经Rnase H酶解，在DNA Po lymerase的催化下将RNA置换成DNA。取5 μl作电泳确定双链cDNA的大小，其余经末端补平 、加衔接头、磷酸化，过cDNA size fractionation column以去除分子量小于400 bp的cDNA 片段。
1.5 cDNA的克隆与鉴定
, 百拇医药 将75 ng的cDNA与500 ng的λTripleX Arms连接，按Boehringer Mannheim公司的DNA Pacji ng kit包装噬菌体，并以XL-l blue作受体菌滴定文库的滴度和重组率，并扩增文库。取1 μl扩增库作模板，用5组已知的牙本质和釉质基质蛋白基因(DSP，DMP1，Amelogenin,Amelo blastin,Tuftelin)引物进行PCR初步鉴定文库。
2 结 果
2.1 小鼠牙胚总RNA和mRNA的提取(图1)
图1 提取的小鼠牙胚总 图2 LD PCR扩增的小鼠牙胚
RNA和mRNA 带1.总 cDNA 带1.cDNA:分子量介于
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RNA:28S:18S为1.5左右。 0.5～4 kb之间的拖带，其中
带2.mRNA：分子量介于0.5 可见明显条带。带2.Marker:
～8 kb之间的拖带。 λDNA经Pst1酶切。
抽提的总RNA无明显降解，mRNA在介于0.5～8 kb之间有拖带。
2.2 LD PCR扩增小鼠牙胚cDNA(图2)
LD PCR产物介于0.5～4 kb之间，其中可见明显条带。双链cDNA经过分段分离后小片段cDNA 被去除掉。
2.3 滴定未扩增库和重组克隆的百分比(图3)
500 μl未扩增库共有1.3×106 pfu，重组克隆的百分比为72%。
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图3 未扩增库的滴度和重组克隆的百分比①来扩增库的滴度：1.3×106 pfu ②重组克隆百分比：72%，蓝斑为非重组噬斑，白斑为重组噬斑
2.4 滴定扩增库
扩增库的滴度为3×109 pfu/ml。
2.5 用PCR初筛扩增文库(图4)
用PCR方法分别扩增了5个已知的牙本质和釉质基质蛋白cDNA片段，均可扩增出预期的特异条 带，片段长度范围670～1 900 bp。
图4 PCR初筛扩增文库结果
带1.带9.Marker:λDNA经Pst1酶切
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带2.Tuftelin扩增产物，1.1 kb处有条带
带3.DMP1扩增产物,1.8 kb处粗条带
带4.DSP扩增产物,1.4 kb处有条带
带5.阳性对照：1.1 kb的Tuftelin
带6.Ameloblastin扩增产物,1.2 kb处有条带
带7.Amelogenin扩增产物，670 bp处有条带
带8.空白对照
3 讨 论
牙齿的发育和细胞的分化是釉上皮和牙乳头向质之间一系列相互诱导的结果，釉上皮的内釉 细胞分化为成2釉细胞，牙乳头中出现了成牙本质细胞，两种牙胚特异的细胞分别分泌釉质 和 牙本质基质蛋白。这些蛋白发挥支架和成核作用，启动了牙齿的矿化，最终形成有功能的牙 齿〔1〕。在上述一系列生物变化过程中，涉及到许多基因的开放和表达，对这些基 因结构和功能的认识，是人们揭示牙齿发育的必由之路。
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80年代后期兴起的人类基因组计划(human genome project)〔2〕是当前国际生物学 、医学领域内一项最引人注目的工程，其目标是要从整体上阐明人类遗传信息的组成(全部D NA序列)和表达(约10万个人类基因的结构、功能及其表达调控方式)，为人类遗传多样性的 研究提供基本数据，揭示约5 000种人类单基因遗传病和若干严重危害人类健康的多因素、 多基因病(如冠心病、高血压、糖尿病、癌症、自身免疫性疾病等)的致病基因或疾病易感基 因，并建立对各种基因病新的诊断和防治方法，从而推动整个生物科学基础和应用性研究的 发展。目前世界各国正在克隆与牙齿发育相关的新基因，有些研究已初步揭示了某些遗传性 疾病的候选基因，如牙本质涎磷蛋白可能是牙本质发育不全的致病基因，釉基质丝氨酸蛋白 酶、成釉蛋白是釉质发育不全的致病基因〔3〕。
目前要克隆某组织中的新基因的主要途径仍是构建该组织的cDNA文库，通过核酸或抗体 筛选出目的新基因。根据文献报道目前已构建了如下组织的cDNA文库：3～4周大鼠切牙未矿 化部分的牙髓组织〔4〕，新生小鼠(19 d)磨牙牙胚〔5〕和人年轻(14 岁)第3 磨牙牙乳头〔6〕。本研究致力于在中国建立一个库容量大、重组率高的小鼠牙胚cDN A文库。
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构建cDNA文库，获得高质量的PolyA+mRNA至关重要，本组选择3～8 d新生小鼠磨牙牙胚， 因为此期牙胚的成釉细胞和成牙本质细胞均已分化，并开始分泌基质，表达牙齿发育过程中 的大多数基因，又可避免牙胚形成硬组织过多，影响抽提组织RNA的质量。本实验所用的试 剂盒抽提mRNA直接、快速，结果表明提取的PolyA+mRNA质量好、得率高。
另外本组采用 的建库试剂盒较经典的建库方法有许多优点：首先，合成cDNA后进行PCR，可以显著提高组 织中低丰度的mRNA的拷贝数，大大增加了筛出以往经典方法无法找到的新基因的机率；其次 ，载体噬菌体λTriplEX有三个不同翻译起始点，每种翻译方式都相差一个碱基，这样必有 一个起始点表达的蛋白与天然蛋白的读框一致，为通过抗体筛选基因提供了方便；第三，该 方法简便易行，较经典建库方法明显提高了效率。从已取得的结果来看，小鼠牙胚的cDNA文 库经过已知基因PCR验证，可以扩增出670～1 900 kb已知的基因片段，具有较好的库容量(1 .3×106 pfu)和较大的插入片段。目前作者正在筛选该文库，为获取与牙齿发育相关的新 基因而努力。
, 百拇医药
(本实验得到中国科学院上海细胞生物学研究所的麻孙恺，蔡国强，刘昭平，李昌麟， 赵忠孝老师，第四军医大学口腔医学院江为民，马秦，徐蓬同学的帮助，在此深表谢意)
本课题由国家自然科学基金资助 编号：39700160 39800155)
参考文献
1，Butler WT,Ritchie H.The nature and functional significance of dentin ex tracellular matrix proteins.Int J Dev Biol,1995,39:169
2，陈竺,王亚新 主编.分子生物学与疾病.上海:百家出版社,1994.68
3，Wright JT,Hall KI,Yamauchi M.The enamel protein in human amelogenesis imperfec ta.Arch Oral Biol,1997,42:149
, 百拇医药
4，Matsuki Y,Nakashima M,Amizuka N, et al.A compilation of partial sequences of randomly selected cDNA clones from the rat incisor.J Dent Res,1995,74(1):307
5，MacDougall M,Simmons D,Luan X, et al.Dentin phosphoprotein and dentin sial oprotein are cleavage products expressed from a single transcript coded by a gen e on human chromosome 4. J Biol Chem,1997,272:835
6，Hirst KL,Simmons D,Feng J, et al.Elucidation of the sequence and the genom ic organization of the human dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP1)gene:Ex clusion of the locus from a causative role in the pathogenesis of dentinogenesis imperfecta type Ⅱ.Genomics,1997,42:38
(收稿：1999-04-07), http://www.100md.com
单位：顾淑萍 史俊南 肖明振 吴补领(第四军医大学口腔医学院口腔内科 710032)；郝建军 王丽珍 刘正(上海第二医科大学口腔医学院)；费俭(上海中国科学院细胞 生物学研究所)
关键词：cDNA文库；小鼠；牙胚；信使RNA；聚合酶链反应
实用口腔医学杂志000203 〔摘要〕 目的：构建具足够库容量的小鼠牙胚cDNA文库。方法： 先提取小鼠牙胚mRNA并反转录成cDNA,经LD PCR扩增后，将双链cDNA 克隆到λTripleX中，包装噬菌体，以XL-l blue为受菌体滴定、扩增文库，用已知的牙胚 基质蛋白基因引物作PCR鉴定文库。结果：500 μl文库的库容量为1 .3×106 pfu，重组率为72%，从文库中克隆到已知的5种牙胚基蛋白基因。结 论：构建的文库具较好的库容量和重组率及较大的插入片段。构建具足够库容量的小鼠牙胚cDNA文库。方法： 先提取小鼠牙胚mRNA并反转录成cDNA,经LD PCR扩增后，将双链cDNA 克隆到λTripleX中，包装噬菌体，以XL-l blue为受菌体滴定、扩增文库，用已知的牙胚 基质蛋白基因引物作PCR鉴定文库。结果：500 μl文库的库容量为1 .3×106 pfu，重组率为72%，从文库中克隆到已知的5种牙胚基蛋白基因。结 论：构建的文库具较好的库容量和重组率及较大的插入片段。
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中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0093-03
Construction of cDNA library of mouse dental germ
Gu Shuping,Shi Junnan,Hao Jianjun
(Stomatological college,Fourth Mi lilary Medical University,Xi'an 710032)
〔Abstract〕Objective:To establish a cDNA library of mouse dental ger m.Method:Extraction of mRNA of mouse dental germ and synth esis of cDNA were conducted with reverse DNA polymerase.Then the ds cDNA was lig ated to TripleX and the recombinant bacteriophage was packaged.The cDNA library was titered and amplified with XL-l blue as receptor bacterium and identified w ith 5 pairs of primers of genes of mouse dental germ matrix proteins by PCR.Result:The titer of the unamplified library was 1.3×106 pfu ,and the percentage of recombinant clones was 72%.And all the five known genes w ere contained in the library,the size of the fragment was 670～1900 bp.Conclusion:The established cDNA library has high titer ,recombinant prcentage and large insert fragments of genes.
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Key words cDNA library; Mouse;Tooth germ;Messenger RNA;Polymerase chain reaction
牙胚是外胚层和外胚间充质经过相互诱导发育而来，在一系列的相互作用过程中，调控 牙胚分化的基因被激活，随后釉质和牙本质基质蛋白基因开放，最终导致牙齿的成熟。牙胚 发育中开放的调控和结构基因是该组织发育的关键和源泉，对于这些基因的结构和功能的研 究无疑有重要的生物学意义〔1〕。本研究采用PCR方法，构建小鼠牙胚的cDNA文库， 为筛选与牙齿发育有关的新基因打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
取3～7 d龄昆明小鼠(B6D2F1)的第一、第二磨牙牙胚，速冻于液氮并保存。
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1.2 小鼠总RNA提取
按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书提取总RNA。从液氮中取出牙胚，称1 g敲碎，迅 速置研钵中，加液氮研成粉末，转至匀浆器中，待液氮挥发完全，加10 ml TripureTM Isolation Reagent充分匀浆，加2 ml氯仿混匀，作用5～10 min，离心取上清，加5 ml 已丙醇混匀置10 min，离心收集沉淀，φ=75%乙醇洗涤收集沉淀凉干，用515 μl DEPC水溶 解RNA，取10 μl作紫外定量分析，确定RNA浓度，取5 μl作琼脂糖凝胶电泳分析，确定RNA 是否降解。
1.3 小鼠PolyA+mRNA提取
按Promega 公司试剂盒说明书提取PolyA+mRNA。将上述提取的500 μl总RNA在65 ℃ 水溶中解聚10 min，加3 μl Biotinylated-Oligodt、13 μl 20×SSC室温孵育10 min， 将此退火的Oligodt-mRNA杂交产物加于含SA-PMP的柱上，经4次洗涤后，用洗脱液洗下Pol yA+mRNA，经乙醇沉淀洗涤后，用5 μl DEPC水溶解mRNA，取2 μl作琼脂糖凝胶电泳，确 定mRNA的分子大小及初步定量。
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1.4 cDNA的合成
按Clontech PT3000-2 kit说明书进行。取3 μl mRNA作模板、1 μl Smart Oligonucleat ide、1 μl CDS/3’Primer、20 μl MMLV反转录酶合成第一链；取2 μl第一链cDNA作模板 、2 μl 5’PCR Primer、2 μl CDS/3’Primer、2 μl 50×Advantage Klen Taq Polymer ase Mix合成第二链。在第二链合成时，cDNA∶RNA杂交链上的RNA经Rnase H酶解，在DNA Po lymerase的催化下将RNA置换成DNA。取5 μl作电泳确定双链cDNA的大小，其余经末端补平 、加衔接头、磷酸化，过cDNA size fractionation column以去除分子量小于400 bp的cDNA 片段。
1.5 cDNA的克隆与鉴定
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2 结 果
2.1 小鼠牙胚总RNA和mRNA的提取(图1)
图1 提取的小鼠牙胚总 图2 LD PCR扩增的小鼠牙胚
RNA和mRNA 带1.总 cDNA 带1.cDNA:分子量介于
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RNA:28S:18S为1.5左右。 0.5～4 kb之间的拖带，其中
带2.mRNA：分子量介于0.5 可见明显条带。带2.Marker:
～8 kb之间的拖带。 λDNA经Pst1酶切。
抽提的总RNA无明显降解，mRNA在介于0.5～8 kb之间有拖带。
2.2 LD PCR扩增小鼠牙胚cDNA(图2)
LD PCR产物介于0.5～4 kb之间，其中可见明显条带。双链cDNA经过分段分离后小片段cDNA 被去除掉。
2.3 滴定未扩增库和重组克隆的百分比(图3)
500 μl未扩增库共有1.3×106 pfu，重组克隆的百分比为72%。
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图3 未扩增库的滴度和重组克隆的百分比①来扩增库的滴度：1.3×106 pfu ②重组克隆百分比：72%，蓝斑为非重组噬斑，白斑为重组噬斑
2.4 滴定扩增库
扩增库的滴度为3×109 pfu/ml。
2.5 用PCR初筛扩增文库(图4)
用PCR方法分别扩增了5个已知的牙本质和釉质基质蛋白cDNA片段，均可扩增出预期的特异条 带，片段长度范围670～1 900 bp。
图4 PCR初筛扩增文库结果
带1.带9.Marker:λDNA经Pst1酶切
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带2.Tuftelin扩增产物，1.1 kb处有条带
带3.DMP1扩增产物,1.8 kb处粗条带
带4.DSP扩增产物,1.4 kb处有条带
带5.阳性对照：1.1 kb的Tuftelin
带6.Ameloblastin扩增产物,1.2 kb处有条带
带7.Amelogenin扩增产物，670 bp处有条带
带8.空白对照
3 讨 论
牙齿的发育和细胞的分化是釉上皮和牙乳头向质之间一系列相互诱导的结果，釉上皮的内釉 细胞分化为成2釉细胞，牙乳头中出现了成牙本质细胞，两种牙胚特异的细胞分别分泌釉质 和 牙本质基质蛋白。这些蛋白发挥支架和成核作用，启动了牙齿的矿化，最终形成有功能的牙 齿〔1〕。在上述一系列生物变化过程中，涉及到许多基因的开放和表达，对这些基 因结构和功能的认识，是人们揭示牙齿发育的必由之路。
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80年代后期兴起的人类基因组计划(human genome project)〔2〕是当前国际生物学 、医学领域内一项最引人注目的工程，其目标是要从整体上阐明人类遗传信息的组成(全部D NA序列)和表达(约10万个人类基因的结构、功能及其表达调控方式)，为人类遗传多样性的 研究提供基本数据，揭示约5 000种人类单基因遗传病和若干严重危害人类健康的多因素、 多基因病(如冠心病、高血压、糖尿病、癌症、自身免疫性疾病等)的致病基因或疾病易感基 因，并建立对各种基因病新的诊断和防治方法，从而推动整个生物科学基础和应用性研究的 发展。目前世界各国正在克隆与牙齿发育相关的新基因，有些研究已初步揭示了某些遗传性 疾病的候选基因，如牙本质涎磷蛋白可能是牙本质发育不全的致病基因，釉基质丝氨酸蛋白 酶、成釉蛋白是釉质发育不全的致病基因〔3〕。
目前要克隆某组织中的新基因的主要途径仍是构建该组织的cDNA文库，通过核酸或抗体 筛选出目的新基因。根据文献报道目前已构建了如下组织的cDNA文库：3～4周大鼠切牙未矿 化部分的牙髓组织〔4〕，新生小鼠(19 d)磨牙牙胚〔5〕和人年轻(14 岁)第3 磨牙牙乳头〔6〕。本研究致力于在中国建立一个库容量大、重组率高的小鼠牙胚cDN A文库。
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构建cDNA文库，获得高质量的PolyA+mRNA至关重要，本组选择3～8 d新生小鼠磨牙牙胚， 因为此期牙胚的成釉细胞和成牙本质细胞均已分化，并开始分泌基质，表达牙齿发育过程中 的大多数基因，又可避免牙胚形成硬组织过多，影响抽提组织RNA的质量。本实验所用的试 剂盒抽提mRNA直接、快速，结果表明提取的PolyA+mRNA质量好、得率高。
另外本组采用 的建库试剂盒较经典的建库方法有许多优点：首先，合成cDNA后进行PCR，可以显著提高组 织中低丰度的mRNA的拷贝数，大大增加了筛出以往经典方法无法找到的新基因的机率；其次 ，载体噬菌体λTriplEX有三个不同翻译起始点，每种翻译方式都相差一个碱基，这样必有 一个起始点表达的蛋白与天然蛋白的读框一致，为通过抗体筛选基因提供了方便；第三，该 方法简便易行，较经典建库方法明显提高了效率。从已取得的结果来看，小鼠牙胚的cDNA文 库经过已知基因PCR验证，可以扩增出670～1 900 kb已知的基因片段，具有较好的库容量(1 .3×106 pfu)和较大的插入片段。目前作者正在筛选该文库，为获取与牙齿发育相关的新 基因而努力。
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(本实验得到中国科学院上海细胞生物学研究所的麻孙恺，蔡国强，刘昭平，李昌麟， 赵忠孝老师，第四军医大学口腔医学院江为民，马秦，徐蓬同学的帮助，在此深表谢意)
本课题由国家自然科学基金资助 编号：39700160 39800155)
参考文献
1，Butler WT,Ritchie H.The nature and functional significance of dentin ex tracellular matrix proteins.Int J Dev Biol,1995,39:169
2，陈竺,王亚新 主编.分子生物学与疾病.上海:百家出版社,1994.68
3，Wright JT,Hall KI,Yamauchi M.The enamel protein in human amelogenesis imperfec ta.Arch Oral Biol,1997,42:149
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4，Matsuki Y,Nakashima M,Amizuka N, et al.A compilation of partial sequences of randomly selected cDNA clones from the rat incisor.J Dent Res,1995,74(1):307
5，MacDougall M,Simmons D,Luan X, et al.Dentin phosphoprotein and dentin sial oprotein are cleavage products expressed from a single transcript coded by a gen e on human chromosome 4. J Biol Chem,1997,272:835
6，Hirst KL,Simmons D,Feng J, et al.Elucidation of the sequence and the genom ic organization of the human dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP1)gene:Ex clusion of the locus from a causative role in the pathogenesis of dentinogenesis imperfecta type Ⅱ.Genomics,1997,42:38
(收稿：1999-04-07), http://www.100md.com