BN52021对大鼠任意皮瓣炎症反应影响的实验研究
作者：徐启飞 付妍婕 张爱兵 熊明根 邢新
单位：徐启飞 付妍婕 张爱兵(海军杭州疗养院，浙江 杭州 310002)；熊明根 邢新(第一军医大学珠江医院)
关键词：任意皮瓣；血小板激活因子；血小板激活因子受体拮 抗剂(BN52021)；免疫组化
海军医学杂志000205 摘要 目的：通过对皮瓣组织中毛细血管内皮细胞表面的ICAM- 1表达量的观察，反映皮瓣局部的炎症反应程度、白细胞浸润情况，了解血小板激活因子受 体拮抗剂BN52021对皮瓣局部的炎症反应的拮抗作用和血小板激活因子(PAF)对鼠任意皮瓣成 活能力的影响。方法：使用BN52021对皮瓣局部进行处理，然后于术 后3、6、9 h将皮瓣取下，分区段进行免疫组化检查；并于7 d后观察皮瓣存活面积。结果：与对照组相比，BN52021处理组皮瓣中的血管内皮细胞表面ICAM-1的表 达明显减少；术后7 d皮瓣成活面积，处理组明显大于对照组，P<0.001。结论：在鼠背部任意皮瓣移植时，BN52021可以降低皮瓣局部 的白细胞浸润程度，抑制炎症反应，提高皮瓣的成活能力。
, 百拇医药
中图分类号 R622.1 文献标识码 A 文章编号 1009-0754 (2000)02-0109-03
Experimental Studies on the Effects of BN52021 on Inflammatory Reaction of Rat Random Flaps
XU Qi-fei, FU Yan-jie, ZHANG Ai-bing, et al
Navy Hangzhou Sanatorium, Hangzhou 310002
Abstract Objective: Platelet-activating factor ( PAF) is an extremely potent lipid-inflammatory mediator. The purpose of this study was to evaluate its possible effect on flap inflammatory reaction and investigat e the mechanism of platelet-activating factor antagonism in the surviva l of ran dom flaps, using a SD rat dorsi random flap model. Methods: A lipophilic platelet-activating factor receptor antagonist (BN52021) was adm inistered in a single dose to treat flaps by a local percutaneous injection rout e 30 min prior to the operation. 3、6 and 9 h after the transplantation, full-t hi ckness flap hiopsies were collected sequentially and analyzed immunohistochemi cally for ICAM-1 expression. Results: The platelet-act i vating factor receptor antagonist was found to attenuate ICAM-1 expression s igni ficantly in the treated flaps. During transplantation, pla telet-activating factor antagonist is able to diminish, directly or indirectly, the accumulation of acute inflammatory cells in random flaps.
, 百拇医药
Key words random flap; PAF; BN52021; immunohistochemi stry
舰艇人员烧伤是一种常见病，皮瓣移植是十分重要的治疗手段，寻找促进皮瓣成活能力 的因素具有很重要的意义。血小板激活因子(platelet-activating factor，以下简称PAF) ，是一种极其强烈的炎性介质[1]，主要通过结合于特异性受体起作用[2] 。在皮瓣移植过程中，皮瓣组织中的PAF浓度升高，直接影响组织的成活能力。PAF特异性 受体拮抗剂(antagonist)可以成功地减轻组织器官的炎症反应，改善血流动力学状况[ 1，3]，从而促进皮瓣的成活。应用免疫组化技术检测ICAM-1表达量的变化来间接反 映皮瓣局部炎症反应的程度，具有方便、直观、可靠的特点，为监测皮瓣局部组织炎症反应 提供了一种新手段。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
1.1.1 实验动物：大白鼠。
1.1.2 实验材料：1%戊巴比妥钠、BN52021(Sigma公司产品)、100 mM甘露醇+22.4 mM氯化 钠 液、10%甲醛溶液、外科小手术器械、PBS液、3%双氧水、抗ICAM-1单克隆抗体(一抗)、生物 素化IgG(b-SAM IgG)、Streptavidin-HRP(DAKO公司产品)、0.05%DAB液、苏木素。
1.2 方法
1.2.1 实验分组
1.2.1.1 BN52021对皮瓣炎症反应影响组
SD大鼠72只，体重250～300 g，雌雄不限，随机分为2组：处理组和对照组，每组再分为3 小 组，分别为：3 h组、6 h组、9 h组。设计一蒂部在头端的长宽比例为4：1(6.0 cm×1.5 cm )的任 意皮瓣(图1)，处理组在术前0.5 h给予[BN52021 0.5 mg+100 mM甘露醇+22.4 mM氯化钠] [4]2 ml皮下注射；对照组只给予[100 mM甘露醇+22.4 mM氯化钠]2 ml皮下注射。然 后于术后3、6、9 h取标本，将皮瓣分为近、中、远三部分进行免疫组化病理检查 。
, 百拇医药
图1 鼠背部任意皮瓣设计图
1.2.1.2 BN52021对鼠任意皮瓣成活能力影响组
SD大鼠30只，体重250～300 g，雌雄不限，随机分为2组：处理组和对照组，每组15只。其 中，处理组在术前30 min皮瓣局部皮下注射[BN52021 0.5 mg+100 mM甘露醇+22.4 mM 氯化钠] [4]2 ml/只，对照组只给予皮瓣局部皮下注射[100 mM甘露醇+22.4 mM氯化钠]2 ml/只。
1.2.2 免疫组化染色方法(LSAB法)：LSAB法具体步骤是：石蜡包埋→切片→3%双氧水抑制内源性过氧化物酶→微波抗原修复，95 ℃，10 min→PBS洗，加抗ICAM-1单克隆抗体(一抗)→生物素化IgG(b-SAM IgG，二抗)→ 链霉 亲和素-HRP复合物(Streptavidin-HRP)→0.05%DAB+0.03%H2O2，显色→苏木素衬染→ 常规树脂封片。
, 百拇医药
1.2.3 图象处理：Auto cad 14图象处理系统。
1.2.4 统计学处理方法：t-test。
2 结 果
2.1 处理组皮瓣各区段中的血管内皮细胞表面ICAM-1的表达较对照组皮瓣相对应区段 中的血管内皮细胞表面ICAM-1的表达明显减少。
2.2 使用血小板激活因子特异性受体拮抗剂BN52021对皮瓣局部进行处理后，皮瓣成活能力 (面积)明显大于对照组，P<0.001(见表1、图2)。
表1 BN52021对鼠皮瓣成活面积的影响(
±s) 组 别
n
, http://www.100md.com
成活率
处理组
15
0.598±0.041
对照组
15
0.318±0.017
P<0.001
图2 BN52021对鼠任意皮瓣成活能力的影响
3 讨 论
3.1 寻找促进皮瓣成活能力的因素，始终是整形重建外科的一项重要课题。皮瓣移植是整 形重建外科的一个十分重要的手段，而任意皮瓣又是临床上最为常用的皮瓣，一般来讲，任 意皮瓣成活的长宽比例为1：1～2，在面部可以达到1：3～4，但是，这一比例远远不能满足 临床治疗的需要。本实验的目的是：观察PAF受体拮抗剂BN52021是否能够减轻缺血皮瓣组织 的炎症反应，进而改善皮瓣局部的血流动力学状况，从而促进皮瓣的成活，推断血小板激活 因子在皮瓣移植中的作用。
, http://www.100md.com
3.2 血小板激活因子(platelet-activating factor，以下简称PAF)，是一种极其强烈的 炎性介质[1]，主要通过结合于特异性受体起作用。PAF通过激活循环中的白细胞 ，使白细胞趋化、聚集和脱颗粒同时释放许多其他炎性介质如：5-HT、白三烯、前列腺素、 自由基和血管活性肠肽等，造成细胞损害、血管通透性增加、炎性细胞浸润、血浆浓缩及 组织水肿[2，3]。
3.3 在超长任意皮瓣移植过程中，组织缺血缺氧(尤其是中段和末段)不可避免，导致皮瓣 组织中的PAF浓度升高[5]，激活了白细胞、淋巴细胞，导致皮瓣局部血管通透性 增加、水肿、血流阻力增加、炎性细胞浸润，严重影响缺血组织的成活能力。使用铟标记的 自体白细胞回输或检测皮瓣局部的髓过氧化物酶活性等方法监测组织局部的炎症反应程度， 实验条件的建立和控制均较困难[1，5]。应用免疫组化技术检测ICAM-1表达量的 变化来间接反映皮瓣局部炎症反应的程度，具有方便、直观、可靠特点，为监测皮瓣局部组 织炎症反应提供了一种新手段。
, http://www.100md.com
3.4 循环中的白细胞趋化聚集到炎症部位或组织损伤部位，是一个高度协调和精细调控的 过程，而且大都发生在毛细血管后微静脉。循环中的白细胞到炎症部位的过程离不开白细胞 与血管内皮细胞的牢固粘附(firm adhesion)， 白细胞与血管内皮细胞的牢固粘附是炎症反 应的关键步骤[4]。缺血再灌注损伤所致的白细胞粘附和浸润主要依赖白细胞上的 CD11b/CD18内皮细胞上的ICAM-1之间的相互作用。ICAM-1基本上表达在白细胞、淋巴细胞、 成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞表面，已知PAF是一种极强烈的活化因子，可使ICAM-1表 达增加，促进白细胞与毛细血管后微静脉内皮细胞间的坚固粘附，造成白细胞的炎性浸润， 一般认为：血液中游离型的ICAM-1水平的高低，可以反映粘附型的ICAM-1水平；而粘附型的 ICAM-1水平高低可以反映组织炎症反应的程度[6]。
3.5 本实验中使用BN52021局部处理的皮瓣组织辣根过氧化物酶染色反应明显低于对照组， 表明：PAF受体拮抗剂可以阻断PAF所中介的一系列炎症反应，减少ICAM-1的表达，减轻皮瓣 局部的白细胞浸润程度，可以成功地减轻皮瓣组织的炎症反应[2，4]。本研究将 炎症反应对皮瓣成活能力的影响引入皮瓣成活机制，加深了整形重建外科领域对PAF在皮瓣 成活作用中的认识，进一步丰富了相关皮瓣成活机制，对临床实践有一定的指导意义。
, http://www.100md.com
3.6 任意皮瓣移植过程中，皮瓣局部的PAF水平增高，导致一系列炎症反应，严重影响皮瓣 局部的血流动力学，影响皮瓣的成活。本实验中，使用单一剂量的BN52021处理皮瓣局部， 阻断了由PAF中介的病理生理反应，可明显地提高皮瓣的成活能力。
参考文献
1，Mitchell A， Stotland MA, Kerrigan CL. The role of platelet-activat ing factor in musculocutaneous flap reperfusion. Plast Reconstr Surg, 1997，99( 7):1989
2，殷 明，方之扬.血小板激活因子前体Lyso-PA的生物测定法及在烫伤大鼠渗出液 中的含量改变.第二军医大学学报，1988，9(6)：522
3，殷 明，方之扬.血小板激活因子.生理学进展，1989，20(3)：261
, 百拇医药
4，Riera M, Torras J, Herrero I et al. Neutrophils accentu ate renal cold ischemia-reperfusion injury. J Pharmacology and Experimental The rapeutics， 1997, 280:786
5，Canale P, Squadrito F, Altavilla D et al. TCV-309, a no vel platelet activating factor antagonist, inhibits leukocyte accumulation and p rotects against splanchnic artery occlusion shock. Agents Actions， 1994，42 (3～4):128
6，Julian P, Neil G. Leukocyte-endothelial cell interactions: molecular mechanisms and implications in gastrointestinal disease. Gastroenterology, 1 998, 114:1066
(收稿：1999-08-10), http://www.100md.com
单位：徐启飞 付妍婕 张爱兵(海军杭州疗养院，浙江 杭州 310002)；熊明根 邢新(第一军医大学珠江医院)
关键词：任意皮瓣；血小板激活因子；血小板激活因子受体拮 抗剂(BN52021)；免疫组化
海军医学杂志000205 摘要 目的：通过对皮瓣组织中毛细血管内皮细胞表面的ICAM- 1表达量的观察，反映皮瓣局部的炎症反应程度、白细胞浸润情况，了解血小板激活因子受 体拮抗剂BN52021对皮瓣局部的炎症反应的拮抗作用和血小板激活因子(PAF)对鼠任意皮瓣成 活能力的影响。方法：使用BN52021对皮瓣局部进行处理，然后于术 后3、6、9 h将皮瓣取下，分区段进行免疫组化检查；并于7 d后观察皮瓣存活面积。结果：与对照组相比，BN52021处理组皮瓣中的血管内皮细胞表面ICAM-1的表 达明显减少；术后7 d皮瓣成活面积，处理组明显大于对照组，P<0.001。结论：在鼠背部任意皮瓣移植时，BN52021可以降低皮瓣局部 的白细胞浸润程度，抑制炎症反应，提高皮瓣的成活能力。
, 百拇医药
中图分类号 R622.1 文献标识码 A 文章编号 1009-0754 (2000)02-0109-03
Experimental Studies on the Effects of BN52021 on Inflammatory Reaction of Rat Random Flaps
XU Qi-fei, FU Yan-jie, ZHANG Ai-bing, et al
Navy Hangzhou Sanatorium, Hangzhou 310002
Abstract Objective: Platelet-activating factor ( PAF) is an extremely potent lipid-inflammatory mediator. The purpose of this study was to evaluate its possible effect on flap inflammatory reaction and investigat e the mechanism of platelet-activating factor antagonism in the surviva l of ran dom flaps, using a SD rat dorsi random flap model. Methods: A lipophilic platelet-activating factor receptor antagonist (BN52021) was adm inistered in a single dose to treat flaps by a local percutaneous injection rout e 30 min prior to the operation. 3、6 and 9 h after the transplantation, full-t hi ckness flap hiopsies were collected sequentially and analyzed immunohistochemi cally for ICAM-1 expression. Results: The platelet-act i vating factor receptor antagonist was found to attenuate ICAM-1 expression s igni ficantly in the treated flaps. During transplantation, pla telet-activating factor antagonist is able to diminish, directly or indirectly, the accumulation of acute inflammatory cells in random flaps.
, 百拇医药
Key words random flap; PAF; BN52021; immunohistochemi stry
舰艇人员烧伤是一种常见病，皮瓣移植是十分重要的治疗手段，寻找促进皮瓣成活能力 的因素具有很重要的意义。血小板激活因子(platelet-activating factor，以下简称PAF) ，是一种极其强烈的炎性介质[1]，主要通过结合于特异性受体起作用[2] 。在皮瓣移植过程中，皮瓣组织中的PAF浓度升高，直接影响组织的成活能力。PAF特异性 受体拮抗剂(antagonist)可以成功地减轻组织器官的炎症反应，改善血流动力学状况[ 1，3]，从而促进皮瓣的成活。应用免疫组化技术检测ICAM-1表达量的变化来间接反 映皮瓣局部炎症反应的程度，具有方便、直观、可靠的特点，为监测皮瓣局部组织炎症反应 提供了一种新手段。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
1.1.1 实验动物：大白鼠。
1.1.2 实验材料：1%戊巴比妥钠、BN52021(Sigma公司产品)、100 mM甘露醇+22.4 mM氯化 钠 液、10%甲醛溶液、外科小手术器械、PBS液、3%双氧水、抗ICAM-1单克隆抗体(一抗)、生物 素化IgG(b-SAM IgG)、Streptavidin-HRP(DAKO公司产品)、0.05%DAB液、苏木素。
1.2 方法
1.2.1 实验分组
1.2.1.1 BN52021对皮瓣炎症反应影响组
SD大鼠72只，体重250～300 g，雌雄不限，随机分为2组：处理组和对照组，每组再分为3 小 组，分别为：3 h组、6 h组、9 h组。设计一蒂部在头端的长宽比例为4：1(6.0 cm×1.5 cm )的任 意皮瓣(图1)，处理组在术前0.5 h给予[BN52021 0.5 mg+100 mM甘露醇+22.4 mM氯化钠] [4]2 ml皮下注射；对照组只给予[100 mM甘露醇+22.4 mM氯化钠]2 ml皮下注射。然 后于术后3、6、9 h取标本，将皮瓣分为近、中、远三部分进行免疫组化病理检查 。
, 百拇医药
图1 鼠背部任意皮瓣设计图
1.2.1.2 BN52021对鼠任意皮瓣成活能力影响组
SD大鼠30只，体重250～300 g，雌雄不限，随机分为2组：处理组和对照组，每组15只。其 中，处理组在术前30 min皮瓣局部皮下注射[BN52021 0.5 mg+100 mM甘露醇+22.4 mM 氯化钠] [4]2 ml/只，对照组只给予皮瓣局部皮下注射[100 mM甘露醇+22.4 mM氯化钠]2 ml/只。
1.2.2 免疫组化染色方法(LSAB法)：LSAB法具体步骤是：石蜡包埋→切片→3%双氧水抑制内源性过氧化物酶→微波抗原修复，95 ℃，10 min→PBS洗，加抗ICAM-1单克隆抗体(一抗)→生物素化IgG(b-SAM IgG，二抗)→ 链霉 亲和素-HRP复合物(Streptavidin-HRP)→0.05%DAB+0.03%H2O2，显色→苏木素衬染→ 常规树脂封片。
, 百拇医药
1.2.3 图象处理：Auto cad 14图象处理系统。
1.2.4 统计学处理方法：t-test。
2 结 果
2.1 处理组皮瓣各区段中的血管内皮细胞表面ICAM-1的表达较对照组皮瓣相对应区段 中的血管内皮细胞表面ICAM-1的表达明显减少。
2.2 使用血小板激活因子特异性受体拮抗剂BN52021对皮瓣局部进行处理后，皮瓣成活能力 (面积)明显大于对照组，P<0.001(见表1、图2)。
表1 BN52021对鼠皮瓣成活面积的影响(
±s) 组 别n
, http://www.100md.com
成活率
处理组
15
0.598±0.041
对照组
15
0.318±0.017
P<0.001
图2 BN52021对鼠任意皮瓣成活能力的影响
3 讨 论
3.1 寻找促进皮瓣成活能力的因素，始终是整形重建外科的一项重要课题。皮瓣移植是整 形重建外科的一个十分重要的手段，而任意皮瓣又是临床上最为常用的皮瓣，一般来讲，任 意皮瓣成活的长宽比例为1：1～2，在面部可以达到1：3～4，但是，这一比例远远不能满足 临床治疗的需要。本实验的目的是：观察PAF受体拮抗剂BN52021是否能够减轻缺血皮瓣组织 的炎症反应，进而改善皮瓣局部的血流动力学状况，从而促进皮瓣的成活，推断血小板激活 因子在皮瓣移植中的作用。
, http://www.100md.com
3.2 血小板激活因子(platelet-activating factor，以下简称PAF)，是一种极其强烈的 炎性介质[1]，主要通过结合于特异性受体起作用。PAF通过激活循环中的白细胞 ，使白细胞趋化、聚集和脱颗粒同时释放许多其他炎性介质如：5-HT、白三烯、前列腺素、 自由基和血管活性肠肽等，造成细胞损害、血管通透性增加、炎性细胞浸润、血浆浓缩及 组织水肿[2，3]。
3.3 在超长任意皮瓣移植过程中，组织缺血缺氧(尤其是中段和末段)不可避免，导致皮瓣 组织中的PAF浓度升高[5]，激活了白细胞、淋巴细胞，导致皮瓣局部血管通透性 增加、水肿、血流阻力增加、炎性细胞浸润，严重影响缺血组织的成活能力。使用铟标记的 自体白细胞回输或检测皮瓣局部的髓过氧化物酶活性等方法监测组织局部的炎症反应程度， 实验条件的建立和控制均较困难[1，5]。应用免疫组化技术检测ICAM-1表达量的 变化来间接反映皮瓣局部炎症反应的程度，具有方便、直观、可靠特点，为监测皮瓣局部组 织炎症反应提供了一种新手段。
, http://www.100md.com
3.4 循环中的白细胞趋化聚集到炎症部位或组织损伤部位，是一个高度协调和精细调控的 过程，而且大都发生在毛细血管后微静脉。循环中的白细胞到炎症部位的过程离不开白细胞 与血管内皮细胞的牢固粘附(firm adhesion)， 白细胞与血管内皮细胞的牢固粘附是炎症反 应的关键步骤[4]。缺血再灌注损伤所致的白细胞粘附和浸润主要依赖白细胞上的 CD11b/CD18内皮细胞上的ICAM-1之间的相互作用。ICAM-1基本上表达在白细胞、淋巴细胞、 成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞表面，已知PAF是一种极强烈的活化因子，可使ICAM-1表 达增加，促进白细胞与毛细血管后微静脉内皮细胞间的坚固粘附，造成白细胞的炎性浸润， 一般认为：血液中游离型的ICAM-1水平的高低，可以反映粘附型的ICAM-1水平；而粘附型的 ICAM-1水平高低可以反映组织炎症反应的程度[6]。
3.5 本实验中使用BN52021局部处理的皮瓣组织辣根过氧化物酶染色反应明显低于对照组， 表明：PAF受体拮抗剂可以阻断PAF所中介的一系列炎症反应，减少ICAM-1的表达，减轻皮瓣 局部的白细胞浸润程度，可以成功地减轻皮瓣组织的炎症反应[2，4]。本研究将 炎症反应对皮瓣成活能力的影响引入皮瓣成活机制，加深了整形重建外科领域对PAF在皮瓣 成活作用中的认识，进一步丰富了相关皮瓣成活机制，对临床实践有一定的指导意义。
, http://www.100md.com
3.6 任意皮瓣移植过程中，皮瓣局部的PAF水平增高，导致一系列炎症反应，严重影响皮瓣 局部的血流动力学，影响皮瓣的成活。本实验中，使用单一剂量的BN52021处理皮瓣局部， 阻断了由PAF中介的病理生理反应，可明显地提高皮瓣的成活能力。
参考文献
1，Mitchell A， Stotland MA, Kerrigan CL. The role of platelet-activat ing factor in musculocutaneous flap reperfusion. Plast Reconstr Surg, 1997，99( 7):1989
2，殷 明，方之扬.血小板激活因子前体Lyso-PA的生物测定法及在烫伤大鼠渗出液 中的含量改变.第二军医大学学报，1988，9(6)：522
3，殷 明，方之扬.血小板激活因子.生理学进展，1989，20(3)：261
, 百拇医药
4，Riera M, Torras J, Herrero I et al. Neutrophils accentu ate renal cold ischemia-reperfusion injury. J Pharmacology and Experimental The rapeutics， 1997, 280:786
5，Canale P, Squadrito F, Altavilla D et al. TCV-309, a no vel platelet activating factor antagonist, inhibits leukocyte accumulation and p rotects against splanchnic artery occlusion shock. Agents Actions， 1994，42 (3～4):128
6，Julian P, Neil G. Leukocyte-endothelial cell interactions: molecular mechanisms and implications in gastrointestinal disease. Gastroenterology, 1 998, 114:1066
(收稿：1999-08-10), http://www.100md.com