当前位置: 首页 > 医学版 > 期刊论文 > 其它各类 > 各类论文2
编号:10373821
高效液相色谱
http://www.100md.com 前卫药学杂志
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//
高效液相色谱//

     高效液相色谱-间接光度检测法测定乙基西梭霉素的药物动力学

    袁 成 王景祥 贾 暖[1] 高 卫 梁 竹 薛作英[2] 刘树芬 刘书盈

    (军区总医院 济南250031)

    乙基西梭霉素(奈替米星,netilmicin,)是新一代半合成氨基苷类抗生素其主要特点是对耐药菌有独特的疗效[1,2],但由于氨基苷类抗生素固有的毒副作用,进行其体内药物浓度监测和测定其药物动力学是非常重要和有意义的。由于氨基苷类药物的结构特征,其体内药物含量测定方法目前报道的有微生物法、高效液相色谱-柱前或柱后衍生化法及荧光偏振免疫法[3-5],而不能用常规的高效液相-紫外检测法;另外,由于乙基西梭霉素在我国上市和生产较晚,关于其详尽系统的药物动力学报道很少,给临床合理应用该药带来不便。根据高效液相色谱-间接光度检测[HPLC-IDP(indirect photomation determination)]的理论[6,7],在流动相中加入具有紫外响应的烟酰胺为检测剂,庚烷磺酸钠为反离子,药物和烟酰胺与庚烷磺酸钠形成的离子对复合物竞争固定相有限结合容量,从而使检测剂的浓度随流动相的迁移不断发生改变,导致背景信号发生变化而产生色谱响应,实现用紫外检测器直接检测的目的。我们测定了数种氨基苷类药物的体液浓度,结果良好。本文报告体液中乙基西梭霉素的含量测定,及其在动物体内和在各种不同患者体内的药物动力学。
, 百拇医药
    1 材料与方法

    1.1 仪器与药品 HPLC系统(510双泵、7725六通进样阀和490E紫外检测器)和Baseline 810色谱工作站(Waters公司);色谱柱与预柱(中科院大连化物所);AT-130色谱柱保温器(天津金洲科学仪器公司);硫酸乙基西梭霉素对照品及注射液(青岛第二制药厂);庚烷磺酸钠(东京化成工业珠式会社,AR);烟酰胺(上海试剂二厂,AR);全胃肠外营养合剂为本院普外科按医嘱配制;甲醇为色谱纯,其余试剂为分析纯。Wistar大鼠(山东医科大学实验动物中心)。

    1.2色谱条件的选择1.2.1 烟酰胺浓度 烟酰胺是流动相中不影响分离度的因素,因此单独选择.由于本法是采用加入在紫外区有响应的检测剂作为背景信号,通过背景信号的变化达到间接检测供试物的目的,因此流动相中加入检测剂烟酰胺的浓度直接影响药物的出峰与否和噪音的大小,浓度太大,药物峰无法出现,浓度太小背景吸收易受干扰,噪音增大,影响测定准确性。实验结果见图1。选择0.5mmol/L为添加浓度。
, 百拇医药
    1.2.2 流动相中其他组分 磷酸含量影响药物和烟酰胺与庚烷磺酸钠的结合程度;庚烷磺酸钠的含量决定药物的结合程度而影响药物的保留时间和峰的正负。采用序贯单纯形法[8]确定流动相中各组分分配比:目标函数为色谱峰分离度,决策变量数n=4,甲醇为变量1,乙腈为变量2,庚烷磺酸钠为变量3,磷酸为变量4,最后加水(因变量)至1L,由5个点组成单纯形。经过32次压缩收缩找到最佳配比点:甲醇-乙腈-水(27:18:55),除烟酰胺外含庚烷磺酸钠5mmol/L和磷酸0.05mol/L,流速1mL/min。

    1.2.3 其他色谱条件 固定相为Spherisorb C18,粒径10μm,柱规格4.6mm×250mm;检测波长268nm;检测灵敏度0.05AUFS;柱温(40±1)℃。1.3 生物样品处理方法 血清与胆汁:精取血清或胆汁样品0.5mL,精密加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液0.1mL,振荡混匀,精取乙酸乙酯-氯仿(4:1)混合液5mL萃取,精密量取有机层4mL,于50℃水浴中用氮气流吹干,精密量取流动相0.1mL溶解后进样15μL。尿样:精密量取尿样品5mL,精密加入5%的三氯乙酸溶液5mL,混匀后离心,取上清液10μL进样。组织与粪便:取组织或粪便样品适量,加0.5mL生理盐水充分匀浆,后处理方法同血清。
, http://www.100md.com
    1.4 制备标准工作曲线与方法质控 取空白动物血清、胆汁、尿、组织和粪便,培植系列浓度标准品样品,以浓度c对峰高响应值H进行线性回归,得工作曲线方程血清与胆汁:c=0.5837-3.25×10-6H,γ=0.998(范围0.5~10mg/L);尿:c=0.7262-4.78×10-5H,γ=0.996(范围1~20mg/L);组织与粪便:c=0.9234-3.25×10-5H,γ=0.996(范围0.2~10mg/L)。各种样品回收率均大于90%,日内及日间RSD均小于5%,最低检测限在血清、组织和尿中分别为10,10和50μg/L。

    1.5 大鼠体内药物代谢动力学

    1.5.1 蛋白结合率 Wistar大鼠,♀♂兼用,体重200~300g。9只大鼠分3组,分别iv乙基西梭霉素20,40和50mg/kg,给药后0.5h取股动脉血,用磷酸缓冲液平衡透析法在0℃透析48h后测定血浆蛋白结合率。
, http://www.100md.com
    1.5.2 血药药物动力学 大鼠72只,随机分成3组,注射剂量同上,于给药后00,0,0.5,1,2,4,8,12H取股动脉血(每组每点3只),分别取血清测定浓度,计算药物动力学。

    1.5.3 组织分布 取大鼠♀♂各半,iv乙基西梭霉素40mg/kg,于给药后1h和8h处死(每点5只),取各有关组织测定。

    1.5.4 取大鼠5只,iv乙基西梭霉素40mg/kg,于给药后0~4,4~8,8~12,12~24h收集粪、尿,测定药物浓度。另取5只大鼠,乙醚麻醉后行胆管插管术,待清醒后iv乙基西梭霉素40mg/kg,同上时间段收集胆汁测定。

    1.6患者体内药物动力学

    本实验中所有实验对象均签署知情同意书,中途退出实验者和自行改变用药剂量、途径或品种的,均未予以统计。
, 百拇医药
    1.6.1 老年呼吸系统感染患者 住院患者15例,男性10例,女性5例,年龄50~72(59±12)a,体重(52±13)kg,其中支气管炎4例,大叶性肺炎5例,上呼吸道炎症2例,混合性肺炎4例。肝功能正常,除心脑血管及高血压外无其他病史。肾功能:血清肌苷清除率(ClCr)70~90mL/min,血清尿素氮(BUN)6~9mmol/L,血清肌苷(Cr)105~135μmol/L。用药前1wk内未服用其他药物。随机分成im组(7例)和iv gtt组(8例),均为给硫酸乙基西梭霉素5mg/kg qd,d1给药即为单剂量,连续给药7d为多剂量。分别于d1和d7给药后0.25,0.5,1,2,4,8,12,24h和d2、d4用药前取上肢静脉血2mL按上述方法处理后进样。单剂量给药后在相同时间收集患者痰液,稀释1倍后用三氯醋酸沉淀蛋白,离心,取上清夜进样。

    1.6.2 肾功能受损患者 12例,其中呼吸系统感染5例,尿路感染3例,皮肤软组织感染3例,败血症1例,均无肝脏疾病和肝功能障碍,但有心脑血管及高血压病史。按ClCr、BUN和Cr水平分为肾功能正常组和受损(轻中度)组:ClCr>90 mL/min、BUN<6.5 mmol/L、Cr<110μmol/L 为正常组,共5例;ClCr在30~90 mL/min、BUN在6.5~21.5mmol/L、Cr在110~440μmol/L为肾功能受损组,共7例。用药前1wk内未服用其他药物。患者早餐后iv gtt乙基西梭霉素5mg/kg,给药时间1.5h。给药完毕后同1.6.1项下时间取血,同时收集患者自给药起0~2,2~4,4~8,8~12和12~24h的尿,混匀后记录总尿量。按上述方法处理后进样。
, http://www.100md.com
    1.6.3 全胃肠外营养(TPN)患者 均为本院住院病人,其中TPN组7例肠瘘病人,均为男性,年龄24~54(43±14)a,体重40~61(52±9)kg,营养状况一般,等热量、等氮量TPN全量3d后给NTM;对照组7例病人,男5例,女2例,其中胆囊炎2例,肠瘘3例,胆石症2例,年龄22~52(44±11)a,体重46~67(55±11)kg,正常饮食,营养状况一般。两组病人均无肝肾疾病或功能障碍,受试前后查Cr、BUN、血钾和血糖均未见异常。病人iv gtt乙基西梭霉素5mg/kg(5%葡萄糖注射液250mL稀释),给药时间约1.5h。

    1.6.4 不同给药方案的血药浓度及肾功能改变 本院14例住院患者,均为一般感染,年龄21~57(38±10)a,体重55~79(63±8)kg,肝肾等主要脏器检查无异常,用药前1wk内未服用其他药物。随机分成bid组(7例)和qd组(7例),均为每天iv gtt硫酸乙基西梭霉素5mg/kg,在连续用药d5时,于给药后1h及下次给药前取上肢静脉血测定,同时在给药前和d5给药后测定Cr和BUN。
, http://www.100md.com
    1.6.5 头孢拉定对药物动力学的影响 患者14例,男9女5,年龄28~45(36±9)a,体重56~81(65±15)kg,其中呼吸系统感染8例,尿路感染4例,皮肤软组织感染1例,败血症1例,均无肝脏疾病和肝功能障碍,用药前1wk内未服用其他药物。随机分成乙基西梭霉素组(7例,早餐后iv gtt乙基西梭霉素5mg/kg)和乙基西梭霉素+头孢拉定组(7例,乙基西梭霉素给药同前组,同时口服头孢拉定片10mg/kg qid)。分别在给药完毕后同1.6.1项下时间取血样、1.6.2项下时间段取尿样测定。

    1.7 数据处理 采用Baseline 810色谱工作站计算浓度,用3P87药物动力学程序拟合处理数据,用AIC值判断房室拟合程度。

    2 结 果

    2.1 HPLC-IPD法 色谱图见图2。
, http://www.100md.com
    

    2.2 大鼠体内药物代谢动力学 大鼠在20,40和50mg/kg时的平均血浆蛋白结合率分别为6.8%±1.9%,14.5%±4.72和17.4%±4.77%。动力学符合一室模型,有关药动学参数见表1。该药在肝、脾、肾和肺中浓度最高,而在脂肪和脑中最低,结果见表2。给药后24h在尿中排出的原形药物累积量相当于给药量的74.7%±8.5%,胆汁中4.84%±0.8%,且均于前8h排出了总排泄量的80%以上,结果见表3。

    

    2.3 老年呼吸系统感染患者 药动学表现为二室模型,im吸收较快,im和iv gtt给药时消除半衰期均在3.5h左右,比报道的正常人值(2~2.5h)高;连续给药7d后体内药动学参数无明显改变(P>0.05);但有轻微蓄积(蓄积因子3%)。痰液中药物浓度大大低于相应血药浓度,且与之无相关性(r=0.786)。具体结果见表4。
, 百拇医药
    2.4 肾功能受损患者 药动学表现为二室模型,肾功正常组和受损组消除半衰期分别为3.0h和5.8h;给药12h后血清药物浓度分别为1.4mg/L和4.3mg/L,24h后前者测不出,后者仍高达1.6mg/L。尿液中原形药物回收率高,两组8h以前均保持10mg/L以上,对尿路感染有重要意义,但受损组0~24h总回收率明显低于正常组。具体结果见表5,6。

    2.5 全胃肠外营养(TPN)患者 用药完成后血清浓度已达峰值,但cmaxTPN组低于对照组(P>0.05);至5h时TPN组开始高于对照组,12h时明显高出(P<0.05),说明TPN组消除速度明显下降,结果见表7。24h内尿药浓度及肾排出率TPN组低于对照组但无明显差异(P>0.05),肾原型药物排出率分别为(52±13)%和(63±15)%,与血清药物浓度变化一致,结果见表8。 患者体内的动力学在TPN组和对照组均符合二室开放模型。与对照组相比,TPN组中央室(血)消除速率常数k减小不明显,但表观分布容积和稳态分布容积显著增加(P<0.05);t1/2β亦明显增加(P<0.05),可与肾清除率的下降相对应。有关药物动力学参数见表9。
, http://www.100md.com
    2.6 不同给药方案的血药浓度及肾功能改变 连续用药5d后,乙基西梭霉素qd给药时峰浓度(20±3.5mg/L)明显高于bid时(8.9±1.2mg/L) (P<0.01),但谷浓度无明显差别(P>0.05);qd给药时,Cr和BUN均未有明显变化(P>0.05),但bid给药时,Cr明显升高(P<0.01),BUN无明显改变。

    2.7 头孢拉定对药物动力学的影响 合用头孢拉定后,乙基西梭霉素的消除半衰期明显延长,体内药物浓度明显升高,并且24h尿中原形药物回收率明显下降(P<0.01),并且在单用组与合用组中药物消除半衰期与Clcr、BUN和Cr均具有相关性,相关系数分别为-0.81,0.85,0.85和-0.84,0.79,0.88。结果见表10,11。

    3 讨 论

, http://www.100md.com     2.1 HPLC-IPD法 HPLC-IPD方法是在流动相中添加具有检测响应的检测剂来完成响应低或无响应化合物分离检测的一种有效方法,与HPLC柱前、后衍生化相比,具有操作简便、灵敏度高及线性关系良好等特点.本实验曾采用异烟肼、烟酸作为检测剂,结果前者不能与乙基西梭霉素很好分离,后者则与庚烷磺酸钠溶剂峰重叠,选择烟酰胺可达到很好的分离,且能使硫酸乙基西梭霉素负峰完全表现.实验中血清样品处理方法曾采用乙腈沉淀蛋白法和萃取法,结果表明前者低量对蛋白沉淀不完全,高量使样品稀释使给药长时间(如10h后)血药浓度峰受噪音干扰严重,精密度变差;后者则操作烦琐;虽使样品得以浓缩,但回收率并不比现在好。

    2.2 大鼠体内药物代谢动力学 实验结果表明,乙基西梭霉素iv后分布较快,但在脂肪和脑中分布很少,这应是由于氨基苷类药物的极性结构所致[9],该药在肝肾的高分布提示应用该药尤其是大剂量应用时,应注意肝肾功能检查;该药在睾丸和子宫中也有较高分布,提示对生殖过程的影响。在尿中排泄原形药物达到给药量的70%以上,表明其对泌尿系感染的临床意义,但也应注意对肾脏功能的影响;由于该药的大分子量极性结构,故在胆汁中有较高分布,但粪中含量很低。
, http://www.100md.com
    2.3 老年呼吸系统感染患者 由于乙基西梭霉素主要以原形通过肾小球滤过排出,而老年患者肾功能的自然退化导致这个过程减慢,半衰期延长,提示老年患者应用该药时应注意肾功能检查和血药浓度监测尤其在长期用药时有轻微蓄积,更应注意。痰中药物浓度并不与血药浓度相关,提示监测痰中浓度的重要性,以保证靶器官的有效浓度。

    2.4 肾功能受损患者 实验结果提示乙基西梭霉素在肾功能受损患者的消除半衰期大大延长,24h给药一次患者体内仍有蓄积,这部分患者应避免应用该药,必须应用时应进行监测,必要时应减少给药剂量。结果与国外报道一致[10]

    2.5 全胃肠外营养(TPN)患者 乙基西梭霉素主要经肾脏以原型排泄,故尿量的多少直接影响到其排除速率,但实验中TPN组和对照组尿量并无显著差别,单剂量静滴NTM 5mg/kg后,TPN组t1/2β却比对照组明显延长,TPN剂主要含葡萄糖(约20%)、脂肪乳、氨基酸和多肽、电解质、维生素及少量胰岛素[11],这些胰岛素及由于高糖刺激产生的内源性胰岛素避免产生高渗糖性利尿作用,同时,高蛋白的摄入也避免了尿量的增加,使TPN组尿量并未比对照组增加,这在实验前后血糖测定并未发生异常也可以得到说明;TPN组半衰期的延长应是由于大剂量剂的输入导致药物在中央室(血)的分布增加,使Vc和Vdss明显增大,而k21下降,中央室(血)消除速率变慢。实验结果提示临床在施行TPN的病人应用NTM时,临床每12h给药一次可能引起药物在病人体内的蓄积,故应注意肾功能的检查和血药浓度监测,必要时应减少给药量。
, 百拇医药
    由于现在肠瘘病人给与TPN成为常规,故实验中选择对照组病人时,几乎只能在非肠瘘病人中选择,导致对照组病人疾病状态与TPN组有较大差异,对上述结果的差异有一定影响,这是实验分组时无法尽人意之处,但病人其他状况基本特别是肝、肾功能和营养状况相似,故对实验结果不应有决定性影响。

    2.6 不同给药方案的血药浓度及肾功能改变 现在研究发现氨基苷类抗生素属于浓度依赖性抗生素,对微生物的作用取决于浓度的大小,现在临床一般按bid给药,虽然延长了药物与微生物接触的时间,但并不能保证较高的体液浓度,但是耳肾功能的损害则取决于谷浓度的大小和接触时间[12,13]。本实验也表明,在日剂量相同时,bid给药方案对肾功能的影响大于qd方案。由于氨基苷类药物具有较强的后效应[14,15],不必始终保持较高血药浓度,增加给药间隔时间,既可以保证疗效,又能降低耳肾损害。应大力提倡氨基苷类药物的qd给药方案。

    2.7 头孢拉定对药物动力学的影响 由于β-内酰胺(包括头孢类)药物与氨基苷类药物合用具有协同作用,在临床合用非常普遍,由于两种药物均主要通过肾小球滤过和肾小管的分泌以原形排出[16],相互竞争载体,出现排泄的竞争性抑制,故在两种药物合用时应适当降低剂量或增加给药间隔时间,本实验的结果也充分说明头孢拉定可以降低乙基西梭霉素的排泄速率。本实验还观察到,乙基西梭霉素的消除半衰期与患者的Clcr、BUN和Cr均具有相关性,进一步说明了肾功能对该药物排泄的意义。
, http://www.100md.com
    参 考 文 献

    1 Gagio N, Rennie R, Kiss I, et al. Bilnded investigator comparison of ticarcillin clavulanic acid netilmicin – metronidazole as prophylaxis in surgery for acute chlecystitis. Curr Ther Res,1989, 45(3): 460

    2 Roscioni C, Pennelli GM, Monaco G. Indications of netilmicion and tobramycin for urinary tract infections. Farm Clin, 1988, 27(2—3): 31

    3 Tawa R, Hirose S, Fujiaoto T. Determination of the aminoglycoside antibiotics sisomicin and netilmicin dride blood spots on filter discs, by high performance liquid chromatography with pre-column derivatization and fluorimetric detection. J Chromatogr Biomed Appl, 1989, 490(5): 125
, http://www.100md.com
    4 Blaser J. Interface-area-to-volume ridio of intertitial fluid humans determined by pharmacokinetic analysis of netilicin in small and large skin blisters. Antimirob Agents Chemother, 1991, 35(5): 837

    5 林炳承,邹雄,韩培祯. 高效液相色谱在生命科学中的应用. 济南:山东科学技术出版社,1996:385

    6周玮,刘文英,安登魁.高效液相色谱间接光度检测法及其应用.国外医学药学分册, 1994, 2(2):269

    7 邹汉法,张玉奎,卢佩章. 离子对高效液相色谱法. 郑州:河南科学技术出版社,1994:197
, 百拇医药
    8 丁养军,尤进茂.序贯单纯形法确定高效液相色谱流动相各组分的最佳配比.色谱,1995, 13(6):477

    9 谢明智. 药物的吸收、分布和排泄. 见:宋振玉主编. 药物代谢研究意义、方法、应用. 北京:人民卫生出版社,1990:9

    10 Matzke GR, Milikin SP, Kovarik JM. Variability in pharmacokinetics values for gentamicin to bramycin and netilmicin in patient with renal insufficiency. Clin Pharm, 1989, 8(11): 800

    11 Gu SN, Li AH,Han JM.TPN in abdominal surgical patients. Med J PLA, 1984, 9(5):364
, http://www.100md.com
    12 郑法雷,陈兰英. 氨基苷类抗生素1日1次给药法. 中国医院药学杂志, 1990, 10(1): 20

    13 戴自英. 实用抗菌药物学. 上海: 上海科学技术出版社, 1992: 174

    14 Craig WA, Elbert SC. Killing and regrowth of bacteria in vitro: a review. Scand J Infect Dis, 1991,41(6):433

    15 Spivey JM. The postantibiotic effect. Clin Pharm, 1992,11(10):865

    16 徐叔云主编. 临床药理学. 北京: 人民卫生出版社, 1995: 92, 百拇医药