碘化二甲基粉防己碱和二氢
http://www.100md.com
前卫药学杂志
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
碘化二甲基粉防己碱和二氢-β-刺桐啶碱对骨骼肌细胞烟碱诱发电流抑制作用的比较
刘卫 董克 李立君 刘振伟 俞惠琴 赵志春 刘传缋
(88医院 泰安271000)
以往的研究表明，碘化二甲基粉防己碱(汉肌松)和二氢-β-刺桐啶碱(dHβE)在整体上都有明显的肌松或抗胆碱作用。现认为dHβE是竞争性抗胆碱药[1]，而汉肌松抗胆碱作用的动力学性质尚不明确。对它们在细胞和分子水平的研究国内未见报道，不清楚它们在烟碱受体上的作用位点。我们用膜片箝全细胞记录技术比较了汉肌松和dHβE对培养的骨骼肌细胞烟碱诱发电流的作用，并分析了各自的作用位点，现报告如下：
1 材料和方法
1.1 试剂、仪器和动物碘化二甲基粉防己碱(汉肌松)由俞惠琴主任药师惠赠；二氢-β-刺桐啶碱(dHβE)为Sigma公司产品。细胞孵育箱为Baxer公司产品；相差显微镜为Olympus产品；AxonPatc-1D放大器，TL-1AD转换板，Clampex 5.5.1版DK、Fetcex 5.5.1版DK、Clampfit 6.0版采样和分析软件均为Axon Instrument公司产品；PPS-2空气压力给药系统为Medical System Corp产品。新生Wistar大鼠由军事医学科学院动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 骨骼肌细胞培养〔2〕取当天新生的Wistar大鼠，75%乙醇消毒后处死，立即在无菌条件下取其后肢股肌，在0℃的p7.3的磷酸缓冲液中剪碎，在含0.25%胰酶的缓冲液中于37℃通氧消化30分钟，离心，弃去消化液，加入饲养液(含DMEM 90%，马血清10%及微量ITS)，吹打，200目筛过滤，滤液在37℃ 10%CO2培养箱中培养5～10天有肌球形成后用于实验。
1.3 全细胞记录膜片箝记录装置由倒置相差显微镜、记录电极、微操纵器、前置放大器、示波器、放大器、AD转换板及相关的计算机软件组成。将培养的骨骼肌细胞浸于2ml细胞外液(含10.25，10.NaCl 0.82%，KCl 0.04%，MgCl2 0.02%，EPES 0.24%，葡萄糖 0.20%，最后加入CaCl2 0.03%)中。在倒置相差显微镜下，通过微操纵仪将充满细胞内液(含KCl 2.36%，EPES 0.24%，EGTA 0.38%，ATP 0.11%)的玻璃微电极(尖端直径1μm)压向肌球表面，并通过示波器显示封接测试脉冲观察电极电阻变化，当脉冲所代表的电流值突然下降时表明电极已接触细胞，这时立即给玻璃微电极施以负压，使电极与细胞膜形成贴附式封接，从示波器读取电流计算封接电阻约为2～5GΩ。在此基础上继续施加负压或1.5V 10ms电击打破细胞膜，使细胞内环境与电极相通，形成全细胞记录并施加钳制电压。
, 百拇医药
1.4 给药方法给药装置由氮气、气体压力系统、微操纵器和给药电极组成。将充满药液的给药电极置于与记录细胞同一平面，距离1～2个肌球的位置上，调节给药压力使喷出的药液覆盖记录细胞。将3根给药电极毛胚捆绑在一起并拉制成型，用于观察不同药物或不同剂量对同一细胞的作用。
1.5 数据采集和分析去极化诱发电流经AD转换板和放大器输入计算机记录在Clampex 5.5.1版，细胞自发活动和烟碱诱发电流记录在Fetcex 5.5.1版。用Clampfit 6.0版测量电流幅度，用双指数曲线拟合电流失敏过程得到受体失敏速率常数τ。数据分析用Origin 5.0版，经标准化的电流幅度及失敏速率常数取平均值用x±s表示，用单因素方差分析比较不同药物、不同浓度或不同钳制电压下药物对烟碱电流抑制率的差异，用自身对照t检验分析药物对烟碱受体失敏速率常数τ的影响。
2 结果
2.1 骨骼肌细胞的自发活动、去极化诱发电流、烟碱诱发电流把形成全细胞记录的细胞膜电位钳制在-70mV，能观察到明显的细胞自发活动(图1)。给予一系列去极化刺激的同时记录诱发电流(图2)，可见明显的钠、钾离子电流。向细胞喷射80μM烟碱1s，能诱发2～4nA的内向电流(图3)。向同一肌球按顺序喷射40、80、160μM烟碱1s，间隔3分钟，可见烟碱诱发电流幅度不断增大(表1)，表明烟碱诱发电流有量效关系。
, http://www.100md.com
2.2 汉肌松和dHβE对烟碱诱发电流的抑制作用向细胞喷射80μM烟碱1s后，间隔3分钟向同一细胞喷射含20、40、80μM汉肌松或含10、20、40μM dβE的80μM烟碱1s，可见烟碱诱发电流幅度逐步减小(表2)。以加药后对加药前电流幅度的抑制率为指标做图(图4)，表明汉肌松和dHβE抑制烟碱电流的作用有浓度依赖性。
2.3 汉肌松和dHβE对烟碱受体失敏的影响80μM烟碱持续给药30s覆盖诱发电流达峰和衰减到基线的全过程，其衰减过程反映了烟碱受体的失敏，这一过程用双指数曲线拟合得到2个时间常数，即慢失敏时间常数τs＝BF(13.3±3.7)s和快失敏时间常数τf=BF(1.5±0.41)s(n=6)。加入40μM汉肌松或20μM dβE与烟碱混合给药30s，观察它们对烟碱受体失敏的影响(图5)，可见汉肌松使烟碱受体的τs明显减小BF(P<0.05＝，而dHβE对烟碱受体失敏没有显著影响，提示汉肌松作用位点不在烟碱识别位点，而dHβE作用在烟碱识别位点。
, http://www.100md.com
2.4 汉肌松和dHβE作用的非电压依赖性 给药1s观察40μMdHβE在-30、-50、-70、-90mV钳制电压时对烟碱诱发电流抑制率的差异，均未见明显改变(表3，图6)，即汉肌松和dHβE的抑制作用没有电压依赖性，提示它们不作用在烟碱受体离子通道。
3.讨论
根据烟碱受体拮抗剂的作用机理和作用位点不同，可将其分为两大类〔3〕：一类是作用于受体的烟碱识别位点上，由于烟碱受体是变构蛋白，而此时拮抗剂是将受体固定于不能被激动剂激活的状态，故称为非变构拮抗剂，如经典的竞争性拮抗剂；另一类是作用于激动剂识别位点以外的部位，如离子通道上、通道以外或其它部位，因为能导致烟碱受体变构，统称为变构拮抗剂，而它们的作用位点称为变构调节位点。传统的实验方法如受体结合实验或功能拮抗实验能根据动力学性质区分竞争性与非竞争性拮抗剂，但不能进一步指出其作用位点。如今，由于膜片钳技术的应用，使在分子水平上进一步探讨烟碱受体拮抗剂的作用位点成为可能。
, 百拇医药
烟碱受体上存在着多个变构调节位点，由于它们使受体变构而使受体处于对激动剂不敏感状态即失敏状态，所以变构拮抗剂能加速受体失敏〔4〕。如果变构拮抗剂的作用部位在烟碱受体通道内部，那末随着膜电压增加将会有更多的药物分子顺电压梯度进入通道阻断通道电流，因而表现出电压依赖性。已经证实，局部麻醉药对肌肉型烟碱受体的阻断是作用于这一部位〔5〕。另一个变构调节位点位于通道外，位于细胞膜外侧受体和膜脂质界面上，其电生理特点是没有电压依赖性，某些甾体物质对烟碱受体的阻断是作用于这一部位〔6〕。有研究指出，细胞膜内也有烟碱受体的变构调节位点〔7〕。通过用膜片箝技术分析各种抗胆碱药在烟碱受体上的作用位点，成功地解释了三环哌酯〔3〕、苯环壬酯〔8〕等药物阻断神经元烟碱受体的作用。汉肌松和dHβE都是来源于生物碱的抗胆碱药，前者价廉易得，曾广泛用于临床，是我国特有的肌松药；后者因价格较高，不适于临床使用，但在骨骼肌作用的动力学机制清楚〔9〕，是常用的研究工具药。不影响烟碱受体失敏的结果表明，dHβE作用于烟碱识别位点，这可解释它的竞争性拮抗作用。汉肌松加速受体失敏但没有电压依赖性，表明它是变构拮抗剂但不作用于受体离子通道，是有特色的抗胆碱药。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Damaji MI，Welc SP,Martin BRIn vivo parmacological effects of diydro-betaerytroidine，a nicotinic antagonist，in micePsycoparmacology(Berl)，1995，117(1)：67—73
2何湘平，等适用于膜片箝研究的新生大鼠骨骼肌细胞培养中国应用生理学杂志1995；11(1)：83—86
3郑建全，等抗胆碱能药物作用的分子机制见：巴得年，周宏灏主编，分子药理学，黑龙江科学技术出版社，1999：116—24
4 Clement Lena，Jean-Pierre CangeuxAllosteric modulations of nicotinic acetylcoline receptorTINS，1993，16(5)：181—86
, http://www.100md.com
5 Forman SA，Miller KWMolecular sites of anestetic action in postsynaptic nicotinic membranesTiPS，1989，10(11)：447—52
6 Blanton Mp，Xie Y，Dangott LJ，et alTe steroid promegestone is a noncompetitive antagonist of te Torpedo nicotinic acetylcoline receptor tat interacts wit te lipidprotein interfaceMolecular Parmacology，1999，55：269—78
7 Nabekara J，Murata O，Isibasi ，et alUse-dependent Suppreion of te nicotinic acetylcoline receptor response by te PAMP in te rat Locus Coeruleus neruonsJournal of Neurocemistry，1998，70：865—70
8 刘卫，等苯环壬酯对培养交感神经节烟碱诱发电流的抑制作用见：北京药学会，99北京地区药学学术年会获奖论文，1999：42—48
9 Watling KJ，Kebabian JW，Neumeyer JLIn：Te RBI andbook of receptor claification and signal transduction，Researc Biocemicals LP，USA，1995：4, http://www.100md.com