金银花品种基因多态性鉴定技术研究
http://www.100md.com
前卫药学杂志
金银花品种基因多态性鉴定技术研究
于燕莉 黄贤荣 赵燕 易敏 石俊英
(军区总医院 济南250031)
摘要本文采用RAPD标记与POD分析方法对金银花两品系进行了分析，试图从DNA分子水平上为两品系的鉴别提供依据，实验结果表明：RAPD技术可有效地用于金银花两品种的分类与鉴别，POD图谱亦有一定的差异。
关键词 金银花；RAPD；POD
金银花(忍冬)Lonicera japonica Tunb是山东的道地药材〔1〕，又名“东银花”、“济银花”，产量大、质量好，是国内药材市场上的畅销产品。金银花具有清热解毒，凉散风热之功。常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热。山东金银花主产于临沂地区平邑县，主流产品有大毛花忍冬与鸡爪花忍冬两种裁培品系，两者的药材品质、产量存在一定差异，但其药材性状，原植物形态十分近似。现代分子生物学研究发现，中药材的生物资源—“物种”的多样性是由于其基因组成多态性的结果，而基因多态性可在分子水平上进行检测，他比在生物形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记，随机扩增的DNA多态性(RAPD)技术，具有不需特异探针及已知目的基因序列，所需DNA量少，简便有效等特点[2]。本文采用RAPD标记与同工酶分析方法对金银花两品系的DNA指纹图谱和过氧化物同工酶图谱进行分析，试图从分子水平上为两品系的中药材鉴别提供依据。
, 百拇医药
1材料与仪器
1.1实验材料
本实验选用山东临沂地区平邑县栽培金银花(Lonicera japonica Tunb)品系，从多年生群体中各随机选取大毛花金银花、鸡爪花金银花为试材。原植物标本存山东中医药大学中药学院标本园。
1.2实验仪器
PCR仪：PTC—150型(购自美国)；紫外透射反射仪：WD—9403型(北京六一仪器厂)；引物：10-mer(购自奥大利亚)；Taq酶：购自美国PE公司；电泳仪：DYY-Ⅲ稳流稳压电泳仪(北京六一仪器厂)。
2 RAPD分析
2.1样品DNA的提取
取各样品嫩叶50mg，置研钵中，加液氮少许研磨成匀浆状，移入eppendorf管中，再加入100ml预热至60℃的CTAB提取缓冲液(2%CTAB，14mol/L NaCl，02%巯基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris，p80)，于60℃保温30min，用等体积的氯仿/异戊醇(29∶1)提取两次，9000rpm离心10min，将水相移入新离心管中，加入2/3体积的冷异丙醇混匀，于4000rpm离心6min，弃上去清液，用06ml缓冲液(70%乙醇，10mmol/L乙酸钠)悬浮，9000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀置冰箱中冷冻干燥后，用50μl TE液悬浮，加1/10体积的乙酸钠溶液(p52)，95%乙醇沉淀DNA，1400rpm离心5min，弃去上清液，用70%乙醇洗沉淀，净化台中自然干燥，用超纯水溶解后，置-20℃冰箱中保存备用。
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2.2 PCR反应条件与电泳分析扩增反应液总体积15μl，其中含buffer(缓冲液)15μl，3mmol/L MgCI2 15μl，4种核苷酸(dATP，dGTP，dTTP)各250μl/L随机引物15ng，样品DNA50ng，TaqDNA聚合酶(Promega Inc)1 unit。反应程序如下：第一个循环在95℃变性5min，35℃退火2min，72℃延伸3min；后44个循环于94℃10S，38℃10S，72℃50S，最后于72℃保温5min，25℃退火5S。取扩增产物7～12μl在1×TBE缓冲液1%琼脂糖凝胶中上样，电泳3～4，溴化乙锭染色，紫外灯下观察和照相。
3 POD分析
3.1 样品液制备
取大毛花与鸡爪花忍冬茎尖嫩芽，加适量电极缓冲液，冰浴研磨成匀浆，冷冻离心3000rpmin)15min，上清液加等体积蔗糖液混匀，备点样用。整个过程保持样品不超过4℃。
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3.2电泳操作电泳按文献方法进行〔3〕。胶板用醋酸联苯胺显色，按公式计算样品谱带泳动率，并照相留存。
4结果与讨论
4.1随机选用了10-mer Opcron primer 35个，对2个金银花品种的DNA进行PCR扩增后，产生RAPD标记的随机引物及序列为：OPJ14—CACCCGGATG；OPJ16—CTGCTTAGGG；OPJ20—AAGCGGCCTC。
4.2 使用35个随机引物进行扩增实验，结果有3个引物扩增出谱带，参见引物扩增图。大毛花忍冬共扩增DNA谱带24条：OPJ14—9条、OPJ16—9条、OPJ20—6条)；鸡爪花忍冬共扩增DNA谱带26条：OPJ14—8条、OPJ16—11条、OPJ20—7条)。研究结果表明，RAPD技术可有效地用于中药材的分类与鉴别。
4.3 同工酶分析结果表明，大毛花忍冬与鸡爪花忍冬的过氧化物同工酶谱带数目和位置均有所差异。同工酶的结构差异主要来源于基因差异，并能稳定地遗传给后代，因此利用它可以鉴别诸多遗传变异〔4〕。
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4.4 DNA分子由G、A、C、T 4种碱基构成，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，不同的物种其遗传性不同，便表现在4种碱基排列顺序的变化之中，这就是生物的遗传多样性(genetic diversity)。由于DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和生物体发育阶段及器官差异的影响，每一个体的任一细胞均含有相同的遗传信息，因此，DNA分子遗传标记(DNA molecular geneticmarker)进行物种鉴别更为准确可靠。本文采用RAPD技术对金银花两个品系从分子水平上进行了遗传标记研究，为金银花的种质资源描述、评价及鉴定提供了依据。
致谢：RAPD分析得到山东大学夏光敏教授、向凤宁副教授的指导。
参 考 文 献
1 李家实主编中药鉴定学，上海：科学技术出版社，1998：355
2 Williams JGK，et alNucl Acids Res1990，18：36531
3 石俊英，冯双全，宋广运山东鬼针草属种子的PAGE分析，中国药学杂志，1992，27(12)：717)
4 张志良，吴光耀植物生物化学技术和方法，北京：农业出版社，1986：92, 百拇医药
于燕莉 黄贤荣 赵燕 易敏 石俊英
(军区总医院 济南250031)
摘要本文采用RAPD标记与POD分析方法对金银花两品系进行了分析，试图从DNA分子水平上为两品系的鉴别提供依据，实验结果表明：RAPD技术可有效地用于金银花两品种的分类与鉴别，POD图谱亦有一定的差异。
关键词 金银花；RAPD；POD
金银花(忍冬)Lonicera japonica Tunb是山东的道地药材〔1〕，又名“东银花”、“济银花”，产量大、质量好，是国内药材市场上的畅销产品。金银花具有清热解毒，凉散风热之功。常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热。山东金银花主产于临沂地区平邑县，主流产品有大毛花忍冬与鸡爪花忍冬两种裁培品系，两者的药材品质、产量存在一定差异，但其药材性状，原植物形态十分近似。现代分子生物学研究发现，中药材的生物资源—“物种”的多样性是由于其基因组成多态性的结果，而基因多态性可在分子水平上进行检测，他比在生物形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记，随机扩增的DNA多态性(RAPD)技术，具有不需特异探针及已知目的基因序列，所需DNA量少，简便有效等特点[2]。本文采用RAPD标记与同工酶分析方法对金银花两品系的DNA指纹图谱和过氧化物同工酶图谱进行分析，试图从分子水平上为两品系的中药材鉴别提供依据。
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1材料与仪器
1.1实验材料
本实验选用山东临沂地区平邑县栽培金银花(Lonicera japonica Tunb)品系，从多年生群体中各随机选取大毛花金银花、鸡爪花金银花为试材。原植物标本存山东中医药大学中药学院标本园。
1.2实验仪器
PCR仪：PTC—150型(购自美国)；紫外透射反射仪：WD—9403型(北京六一仪器厂)；引物：10-mer(购自奥大利亚)；Taq酶：购自美国PE公司；电泳仪：DYY-Ⅲ稳流稳压电泳仪(北京六一仪器厂)。
2 RAPD分析
2.1样品DNA的提取
取各样品嫩叶50mg，置研钵中，加液氮少许研磨成匀浆状，移入eppendorf管中，再加入100ml预热至60℃的CTAB提取缓冲液(2%CTAB，14mol/L NaCl，02%巯基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris，p80)，于60℃保温30min，用等体积的氯仿/异戊醇(29∶1)提取两次，9000rpm离心10min，将水相移入新离心管中，加入2/3体积的冷异丙醇混匀，于4000rpm离心6min，弃上去清液，用06ml缓冲液(70%乙醇，10mmol/L乙酸钠)悬浮，9000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀置冰箱中冷冻干燥后，用50μl TE液悬浮，加1/10体积的乙酸钠溶液(p52)，95%乙醇沉淀DNA，1400rpm离心5min，弃去上清液，用70%乙醇洗沉淀，净化台中自然干燥，用超纯水溶解后，置-20℃冰箱中保存备用。
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2.2 PCR反应条件与电泳分析扩增反应液总体积15μl，其中含buffer(缓冲液)15μl，3mmol/L MgCI2 15μl，4种核苷酸(dATP，dGTP，dTTP)各250μl/L随机引物15ng，样品DNA50ng，TaqDNA聚合酶(Promega Inc)1 unit。反应程序如下：第一个循环在95℃变性5min，35℃退火2min，72℃延伸3min；后44个循环于94℃10S，38℃10S，72℃50S，最后于72℃保温5min，25℃退火5S。取扩增产物7～12μl在1×TBE缓冲液1%琼脂糖凝胶中上样，电泳3～4，溴化乙锭染色，紫外灯下观察和照相。
3 POD分析
3.1 样品液制备
取大毛花与鸡爪花忍冬茎尖嫩芽，加适量电极缓冲液，冰浴研磨成匀浆，冷冻离心3000rpmin)15min，上清液加等体积蔗糖液混匀，备点样用。整个过程保持样品不超过4℃。
, 百拇医药
3.2电泳操作电泳按文献方法进行〔3〕。胶板用醋酸联苯胺显色，按公式计算样品谱带泳动率，并照相留存。
4结果与讨论
4.1随机选用了10-mer Opcron primer 35个，对2个金银花品种的DNA进行PCR扩增后，产生RAPD标记的随机引物及序列为：OPJ14—CACCCGGATG；OPJ16—CTGCTTAGGG；OPJ20—AAGCGGCCTC。
4.2 使用35个随机引物进行扩增实验，结果有3个引物扩增出谱带，参见引物扩增图。大毛花忍冬共扩增DNA谱带24条：OPJ14—9条、OPJ16—9条、OPJ20—6条)；鸡爪花忍冬共扩增DNA谱带26条：OPJ14—8条、OPJ16—11条、OPJ20—7条)。研究结果表明，RAPD技术可有效地用于中药材的分类与鉴别。
4.3 同工酶分析结果表明，大毛花忍冬与鸡爪花忍冬的过氧化物同工酶谱带数目和位置均有所差异。同工酶的结构差异主要来源于基因差异，并能稳定地遗传给后代，因此利用它可以鉴别诸多遗传变异〔4〕。
, http://www.100md.com
4.4 DNA分子由G、A、C、T 4种碱基构成，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，不同的物种其遗传性不同，便表现在4种碱基排列顺序的变化之中，这就是生物的遗传多样性(genetic diversity)。由于DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和生物体发育阶段及器官差异的影响，每一个体的任一细胞均含有相同的遗传信息，因此，DNA分子遗传标记(DNA molecular geneticmarker)进行物种鉴别更为准确可靠。本文采用RAPD技术对金银花两个品系从分子水平上进行了遗传标记研究，为金银花的种质资源描述、评价及鉴定提供了依据。
致谢：RAPD分析得到山东大学夏光敏教授、向凤宁副教授的指导。
参 考 文 献
1 李家实主编中药鉴定学，上海：科学技术出版社，1998：355
2 Williams JGK，et alNucl Acids Res1990，18：36531
3 石俊英，冯双全，宋广运山东鬼针草属种子的PAGE分析，中国药学杂志，1992，27(12)：717)
4 张志良，吴光耀植物生物化学技术和方法，北京：农业出版社，1986：92, 百拇医药