刚地弓形虫种株研究进展
史俊岩综述 王海鹏审校
关键词：弓形虫 表型 基因型 分类
弓形虫是寄生于人和哺乳动物组织细胞内的广泛性分布的机会性致病原虫。弓形虫对人类危害严重，先天感染弓形虫可造成畸胎、死胎等，在免疫缺陷和免疫抑制病人合并感染弓形虫可导致脑炎的发生[1、2]。由于在临床上弓形虫病的症状表现多样[1、3]，给诊断治疗及预防等带来许多的不便，因此必须寻找有效的预防与治疗措施。而对弓形虫株的鉴定和分类问题就成为一个十分必要的前提工作。
目前，对弓形虫株的分类还没有一个客观的定论，只是根据弓形虫对动物模型鼠的致病力大小将弓形虫不同分离株分为强毒株和弱毒株[4、5、6]。随着分子生物学和遗传学的发展，弓形虫已从研究其表型发展到研究其基因型。从基因水平解决弓形虫株的分类及弓形虫病预防等一些实际问题，在临床上具有十分重要的意义。现就弓形虫种株的研究概况作以综述。
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1 表型研究1.1 抗原分析 一般认为，世界上只有刚地弓形虫一个种，一个血清型。各虫株间的区别主要在于速殖子对实验宿主或培养细胞的毒力大小。但是毒力是原虫与宿主双方斗争制约所反应出的综合表现，不能代表原虫本身的生物学特性，因此缺乏一定的准确性[7]。通过不同实验方法对弓形虫抗原进行分析研究，旨在发现虫株间的内在联系，从血清学方面对弓形虫株间的区别给以鉴定。
Suggs等(1968)通过对4株弓形虫速殖子的抗原分析比较后，提出虫株间抗原存在差异[8]。Handman等(1980)应用免疫印迹技术对弓形虫RH、C56和C57不同毒力株的膜抗原进行研究，3株弓形虫的血清识别相同的膜抗原。实验结果支持弓形虫只有一个种而分不同毒力株的观点[9]。随着研究的深入，Lunde(1983)、Kaster(1984)和Ware(1987)等对弓形虫抗原研究结果认为虫株间抗原确实存在质与量的区别[10、11、12]。不同研究表明，不仅株间抗原存在差异，同一虫株不同发育阶段抗原也存在差异[13、14、15]。但是这些差异在株间变化较大，规律不明显，不能根据已检测出的抗原差异进行抗原分型。直到1989年，于恩庶通过免疫印迹技术和显凝实验将我国5株弓形虫按抗原差异分为4种抗原型[15]。这种分型方法不一定适合所有的弓形虫株，需要进一步加以研究。
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在这些工作的基础上，沈继龙(1990)、姜昌斌(1993)、陈彩华(1993)和杨惠珍(1995)等用不同的实验方法也证实了弓形虫株抗原差异性[7、17、18、19]。Walfgang(1993)通过对强毒株和弱毒株抗原研究表明，强毒株抗原相似，弱毒株抗原有差异，符合强毒株来自于一个单克隆世系的观点[16]。Parmley(1994)等4个抗P22表面抗原的单克隆抗体对25株不同毒力株抗原进行分析。根据抗原抗体反应结果将25株弓形虫分为三个类群、强毒株属于一个类群，弱毒株属于两个不同的类群[20]。
从以上研究看，不同弓形虫株间抗原确实存在一定差异。虽然抗原的差异能间接的反映遗传物质的差异，但作为遗传物质的产物，抗原可以在转录、翻译及蛋白质合成等多个环节上发生差异，从而导致表型的不同。因此从抗原的差异对弓形虫株进行鉴定和分类还需要加以研究和证实。
1.2 同工酶分析 Dared(1988)对7株毒力不同的弓形虫株进行同工酶分析。根据2个不同的同工酶谱将7株弓形虫分为Z1、Z2和Z3等三个类群[21]。1992年，他扩大了实验材料的数量，对35株不同宿主来源的弓形虫株进行分析，将35株弓形虫分离株按照6个不同的同工酶谱分为Z1—Z5等5个类群，虫株的致病力与同工酶谱间存在一定联系，大多数虫株属于Z1—Z3等3个类群[22]。通过Darde及其他学者的同工酶分析说明，这种方法能结合虫株的致病力、生物学特性等进行虫株分类[23，24]。但弓形虫株的鉴定根据虫株对鼠的致病力及宿主来源不是可靠的方法，而且同工酶技术包含的分子结构的信息比较少，不能充分反映整个基因组的特性。
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总之，同工酶分析和抗原分析均具有局限性，从表型差异不能完全确定基因型的差异，因此有必要从基因水平来研究虫株的差异，利用更先进的分子生物学技术对虫株加以鉴定。
2 基因型分析2.1 限制性酶切片段长度多态性分析(RFLPs) Cristina(1991)用限制性内切酶对10株不同来源的弓形虫株的RFLP进行分析，结果发现10株弓形虫基因之间存在差异，这种差异和虫株的致病力没有相关性[25]。Sibley(1992)通过对弓形虫ME49和C株杂交产生的19个子代进行RFLP分析，说明了弓形虫株基因遗传的稳定性，这对于虫株的鉴定和分类有指导意义[26]。同一年，Sibley对来自不同宿主及地理位置的28株弓形虫基因组DNA进行限制性酶切，用单拷贝探针杂交，强毒株有相同的图谱，弱毒株有不相同的图谱。他根据实验结果提出：强毒株来自于一个单克隆世系，虫株的基因型同宿主或地理位置没有明显的相关性[27]。Cristina(1995)对14株弓形虫进行限制酶切分析，根据虫株间基因相似性将14株弓形虫分为强毒株和弱毒株两大株群[28]。
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从这些结果看，酶谱分析因直接分析遗传物质DNA，能检测基因之间的差异，比传统的抗原分析和同工酶分析更能准确反映种株亲缘关系。但由于实验过程中酶选择的不同及虫株来源数量限制，不能检测虫株间微细差异，尚具有一定的局限性。
2.2 PCR+酶切分析 Brindley(1993)和Danidk(1994)等通过对PCR扩增产物的酶切分析，均发现不同株间有不同的等位基因[29、37]。Parmley(1994)对25株不同来源的弓形虫株在SAG1、850和P22三个基因位点进行扩增产物的RFLP分析，通过实验结果将25株弓形虫按照基因差异大小分为A、B、C三种基因型，其中A属于强毒株，B、C均属于弱毒株[20]。Sibley(1995)对来自欧洲和北美的106个弓形虫分离株的PCR扩增产物进行RFLP分析，根据基因相似性将106个虫株分为三个细胞系，极少数虫株属于混合型。这个结果扩展了sibley于1992年提出的强毒株来自于一个单克隆世系的观点，并且指出基因型控制了弓形虫株的致病机理，而与宿主和地理位置无关[30]。
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2.3 脉冲场凝胶电泳分析(PFGE) Candolfi(1989)首次用PFGE技术的弓形虫不同株进行染色体分析，发现各虫株间染色体差异不大[31]。Sibley(1992)也用PFGE技术分析了3株弓形虫的染色体，构建了弓形虫的分子核型。3株弓形虫在第三和第五条染色体上大约有15%的差异，其余均相似。他认为弓形虫种内遗传比较稳定[32]。
但是分子核型只反映染色体数目和大小，不能指出基因序列的同源性，无法清楚其真实的遗传背景。
2.4 随机扩增多态性DNA(RAPD) 随机扩增多态性DNA技术是1990年发展的一种新技术，它不需要知道待扩增产物的碱基序列，利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。通过对PCR产物的检测可以看到基因组DNA在某些区域的多态性，在生物学分类上有重要价值[33、34]。
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陈观今(1993)等运用3种随机引物对弓形虫基因组DNA进行扩增，所得扩增产物的带型数目与强弱均不一致，说明弓形虫基因组DNA序列中的碱基数目与拷贝存在差异，可以根据扩增产物带型的差异对虫株加以鉴定[35]。Johson(1995)选用7个随机引物扩增11株弓形虫基因组DNA，通过扩增产物的带型及运用定量分析，将11株弓形虫分为强毒株和弱毒株两群，也支持Sibley(1992)提出的强毒株来自于一个单克隆世系的观点[36]。
综上所述，不同的分析方法对弓形虫株的鉴定和分类的结果各有不同，普遍认为将弓形虫株分为强毒株和弱毒株两群，但也有人认为弓形虫株来自于3个细胞系。因此需要在分子生物学水平进一步对弓形虫株进行研究和探讨，对弓形虫株的鉴定和分类给出一个完美的客观的令人信服的最终标准，从而为弓形虫病的临床诊断及治疗与弓形虫疫苗的研究开辟广阔前景。
作者单位：中国医科大学寄生虫学教研室(110011)
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参考文献
1.程玉芝等.弓形虫病的临床诊断.中国寄生虫病防治杂志，1990，3(2)：157～158.
2.夏爱娣等.弓形虫的分子生物学研究.中国人兽共患病杂志，1994，10(1)：51.
3.沈继龙等.弓形体抗原研究的进展.中国人兽共患病杂志，1993，9(1)：48.
4.Rikvam A，et al.Virulent strains of Toxoplasma gondii and host response in mice.Nature.1976，261：508.
5.Suzuki Y et al.Differences in virulent and develepment of encephalitis during chronic infection vary with the strain of Toxoplasma gondii.J of Infect Dis.1989，159：790.
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6.Walfgang Bohne VG et al.Differentiation between Muse-Virulent and Avirulent strains of Toxoplasma gordii by a monoclonal recogmizinga a 27 kD antigen.J of Clin Microldogy.1993，31：164.
7.沈继龙等.细胞因子在弓形虫病治疗中的应用.中国人兽共患病杂志，1990，6(3)：50.
8.Sugys M et al.Comparative antigens study of Besnoitia jellisoni.Bpanqmenis and five Toxoplasma gondii isolates.J of Immunology，1968，101：166.
9.Handman.Detection and characterization of membrane antigens of Toxoplasma gondii.J of Immunology，1980，124：2578.
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10.Lunde MN.Antigentic different between endozoites and cytozoites of Toxoplasma gondii，J of parasitology，1983，69：806.
11.Kasper LH.Identification of stage-specific sporozoites antigens of Toxoplasma gondii by monoclonal antibedies.J of Immunology，198/，132：443.
12.Ware PL.Strain-specific antigens of Toxoplasma gondii.Infection and Immun ity，1987，55：778.
13.Kasper LH.Recognition and Chara cteriziation of stage-specific oocyst/sporozoite of Toxoplasma gondii by human anti-serum.J of clincal Investigation，1985，175：1570.
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14.Omata Y.Antigentic different between endozoites and cytozoites of Toxoplasma gondii by monoclonal antibodies.parasitology Research，1989，15：189.
15.于恩庶等.弓形体抗原分型的研究.中国人兽共患病杂志，1989，5(1)：11～13.
16.Kasper LH.An unexpected response of vaccination with a purified majer membrane eachyzoite antigen(p30)of Toxoplasma gondii.J of Immunology，1995，134：3426.
17.姜昌斌等.应有聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹技术分析弓形虫蛋白质与抗原的研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1993，11(1)：38.
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18.陈彩华等.弓形虫速殖子抗原组分析及其免疫反应性的比较研究.中国寄生虫病防治杂志， 1993，6(3)：198.
19.杨惠珍等.弓形虫人源、畜源分离株的生化特性研究.中国人兽共患病杂志，1995，11(3)：16.
20.Parmly SF.Two alleles of the gene encoding surface antigen p22 in 25 strains of Toxoplasmas gondii.J of Molecular Biologie，1994，80：293.
21.Darde ML et al.Toxoplasma gondii：Etude ultrastrusture des formations kystiq ues observees en cutture de fibrob-lastes humains.J of Infect Dis，1989，159：790.
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22.Darde ML et al.Isoenzymic characterization of seen strains of Toxoplasma gondii by isodetrofocusing in poly-acrylamidegels.American J of Trop Med Hyg，1988，39：551.
23.—，—，and Pestre-alexanden M.Isoenzyme analysis of 35 Toxoplasma gondii isdates and the biological and epidemiological implications.J of parasitology，1992，78(5)：785.
24.—，—，and —.Analyse isoenzymatique de souches clonees de Toxoplasma gondii.Parasitelogy Research，1990，78：367.
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25.Cristina N et al.A family of repeated sequences in Toxoplasma godii.Cloning.sequence analysis.and use in strain characterization.Exp parasitol，1991，73：73.
26.Sibley LD et al.Generation of a restriction fragment length polymorphisms linkage map for Toxoplasma gondii.Genetics，1992，132：1003.
27.Sibley LD et al.Virulent strains of Toxoplasma gondii Comprise a single a single clonal lineage Nature，1992，359：82.
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28.Cristina N et al.A DNA fingerprinting method for individual characterization of Toxoplasma gondii stains：Combination with isoenzymatic Characters for determination of linkage groups.parasitology Research，1995，81(1)：32.
29.Brindly PJ et al.Differentiaticn of Toxoplasma gondii frem closely related Coccidia by Ribioprint analysis and a surface Antigen gene polymerase Chain Reaction American J of Trep Med and Hyg，1993，48：447.
30.Sibley LD et al.Toxoplasma gondii comprise three clonal lineage：Correlation of parasite Genotype with human disease J of Infect Dis，1995，172：1561.
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33.Welsh J.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.Nucleic Acids Res，1990，18：7213.
34.Williams J et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nudeic Acids Res，1990，18：6531.
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36.Johnson AM et al.Genetic charaeterization of Toxoplasma gondii strains by random amplified polymorphic NDA polymerase chain reaction.Parasitology，1995，111：127., http://www.100md.com
关键词：弓形虫 表型 基因型 分类
弓形虫是寄生于人和哺乳动物组织细胞内的广泛性分布的机会性致病原虫。弓形虫对人类危害严重，先天感染弓形虫可造成畸胎、死胎等，在免疫缺陷和免疫抑制病人合并感染弓形虫可导致脑炎的发生[1、2]。由于在临床上弓形虫病的症状表现多样[1、3]，给诊断治疗及预防等带来许多的不便，因此必须寻找有效的预防与治疗措施。而对弓形虫株的鉴定和分类问题就成为一个十分必要的前提工作。
目前，对弓形虫株的分类还没有一个客观的定论，只是根据弓形虫对动物模型鼠的致病力大小将弓形虫不同分离株分为强毒株和弱毒株[4、5、6]。随着分子生物学和遗传学的发展，弓形虫已从研究其表型发展到研究其基因型。从基因水平解决弓形虫株的分类及弓形虫病预防等一些实际问题，在临床上具有十分重要的意义。现就弓形虫种株的研究概况作以综述。
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1 表型研究1.1 抗原分析 一般认为，世界上只有刚地弓形虫一个种，一个血清型。各虫株间的区别主要在于速殖子对实验宿主或培养细胞的毒力大小。但是毒力是原虫与宿主双方斗争制约所反应出的综合表现，不能代表原虫本身的生物学特性，因此缺乏一定的准确性[7]。通过不同实验方法对弓形虫抗原进行分析研究，旨在发现虫株间的内在联系，从血清学方面对弓形虫株间的区别给以鉴定。
Suggs等(1968)通过对4株弓形虫速殖子的抗原分析比较后，提出虫株间抗原存在差异[8]。Handman等(1980)应用免疫印迹技术对弓形虫RH、C56和C57不同毒力株的膜抗原进行研究，3株弓形虫的血清识别相同的膜抗原。实验结果支持弓形虫只有一个种而分不同毒力株的观点[9]。随着研究的深入，Lunde(1983)、Kaster(1984)和Ware(1987)等对弓形虫抗原研究结果认为虫株间抗原确实存在质与量的区别[10、11、12]。不同研究表明，不仅株间抗原存在差异，同一虫株不同发育阶段抗原也存在差异[13、14、15]。但是这些差异在株间变化较大，规律不明显，不能根据已检测出的抗原差异进行抗原分型。直到1989年，于恩庶通过免疫印迹技术和显凝实验将我国5株弓形虫按抗原差异分为4种抗原型[15]。这种分型方法不一定适合所有的弓形虫株，需要进一步加以研究。
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在这些工作的基础上，沈继龙(1990)、姜昌斌(1993)、陈彩华(1993)和杨惠珍(1995)等用不同的实验方法也证实了弓形虫株抗原差异性[7、17、18、19]。Walfgang(1993)通过对强毒株和弱毒株抗原研究表明，强毒株抗原相似，弱毒株抗原有差异，符合强毒株来自于一个单克隆世系的观点[16]。Parmley(1994)等4个抗P22表面抗原的单克隆抗体对25株不同毒力株抗原进行分析。根据抗原抗体反应结果将25株弓形虫分为三个类群、强毒株属于一个类群，弱毒株属于两个不同的类群[20]。
从以上研究看，不同弓形虫株间抗原确实存在一定差异。虽然抗原的差异能间接的反映遗传物质的差异，但作为遗传物质的产物，抗原可以在转录、翻译及蛋白质合成等多个环节上发生差异，从而导致表型的不同。因此从抗原的差异对弓形虫株进行鉴定和分类还需要加以研究和证实。
1.2 同工酶分析 Dared(1988)对7株毒力不同的弓形虫株进行同工酶分析。根据2个不同的同工酶谱将7株弓形虫分为Z1、Z2和Z3等三个类群[21]。1992年，他扩大了实验材料的数量，对35株不同宿主来源的弓形虫株进行分析，将35株弓形虫分离株按照6个不同的同工酶谱分为Z1—Z5等5个类群，虫株的致病力与同工酶谱间存在一定联系，大多数虫株属于Z1—Z3等3个类群[22]。通过Darde及其他学者的同工酶分析说明，这种方法能结合虫株的致病力、生物学特性等进行虫株分类[23，24]。但弓形虫株的鉴定根据虫株对鼠的致病力及宿主来源不是可靠的方法，而且同工酶技术包含的分子结构的信息比较少，不能充分反映整个基因组的特性。
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总之，同工酶分析和抗原分析均具有局限性，从表型差异不能完全确定基因型的差异，因此有必要从基因水平来研究虫株的差异，利用更先进的分子生物学技术对虫株加以鉴定。
2 基因型分析2.1 限制性酶切片段长度多态性分析(RFLPs) Cristina(1991)用限制性内切酶对10株不同来源的弓形虫株的RFLP进行分析，结果发现10株弓形虫基因之间存在差异，这种差异和虫株的致病力没有相关性[25]。Sibley(1992)通过对弓形虫ME49和C株杂交产生的19个子代进行RFLP分析，说明了弓形虫株基因遗传的稳定性，这对于虫株的鉴定和分类有指导意义[26]。同一年，Sibley对来自不同宿主及地理位置的28株弓形虫基因组DNA进行限制性酶切，用单拷贝探针杂交，强毒株有相同的图谱，弱毒株有不相同的图谱。他根据实验结果提出：强毒株来自于一个单克隆世系，虫株的基因型同宿主或地理位置没有明显的相关性[27]。Cristina(1995)对14株弓形虫进行限制酶切分析，根据虫株间基因相似性将14株弓形虫分为强毒株和弱毒株两大株群[28]。
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从这些结果看，酶谱分析因直接分析遗传物质DNA，能检测基因之间的差异，比传统的抗原分析和同工酶分析更能准确反映种株亲缘关系。但由于实验过程中酶选择的不同及虫株来源数量限制，不能检测虫株间微细差异，尚具有一定的局限性。
2.2 PCR+酶切分析 Brindley(1993)和Danidk(1994)等通过对PCR扩增产物的酶切分析，均发现不同株间有不同的等位基因[29、37]。Parmley(1994)对25株不同来源的弓形虫株在SAG1、850和P22三个基因位点进行扩增产物的RFLP分析，通过实验结果将25株弓形虫按照基因差异大小分为A、B、C三种基因型，其中A属于强毒株，B、C均属于弱毒株[20]。Sibley(1995)对来自欧洲和北美的106个弓形虫分离株的PCR扩增产物进行RFLP分析，根据基因相似性将106个虫株分为三个细胞系，极少数虫株属于混合型。这个结果扩展了sibley于1992年提出的强毒株来自于一个单克隆世系的观点，并且指出基因型控制了弓形虫株的致病机理，而与宿主和地理位置无关[30]。
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2.3 脉冲场凝胶电泳分析(PFGE) Candolfi(1989)首次用PFGE技术的弓形虫不同株进行染色体分析，发现各虫株间染色体差异不大[31]。Sibley(1992)也用PFGE技术分析了3株弓形虫的染色体，构建了弓形虫的分子核型。3株弓形虫在第三和第五条染色体上大约有15%的差异，其余均相似。他认为弓形虫种内遗传比较稳定[32]。
但是分子核型只反映染色体数目和大小，不能指出基因序列的同源性，无法清楚其真实的遗传背景。
2.4 随机扩增多态性DNA(RAPD) 随机扩增多态性DNA技术是1990年发展的一种新技术，它不需要知道待扩增产物的碱基序列，利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。通过对PCR产物的检测可以看到基因组DNA在某些区域的多态性，在生物学分类上有重要价值[33、34]。
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陈观今(1993)等运用3种随机引物对弓形虫基因组DNA进行扩增，所得扩增产物的带型数目与强弱均不一致，说明弓形虫基因组DNA序列中的碱基数目与拷贝存在差异，可以根据扩增产物带型的差异对虫株加以鉴定[35]。Johson(1995)选用7个随机引物扩增11株弓形虫基因组DNA，通过扩增产物的带型及运用定量分析，将11株弓形虫分为强毒株和弱毒株两群，也支持Sibley(1992)提出的强毒株来自于一个单克隆世系的观点[36]。
综上所述，不同的分析方法对弓形虫株的鉴定和分类的结果各有不同，普遍认为将弓形虫株分为强毒株和弱毒株两群，但也有人认为弓形虫株来自于3个细胞系。因此需要在分子生物学水平进一步对弓形虫株进行研究和探讨，对弓形虫株的鉴定和分类给出一个完美的客观的令人信服的最终标准，从而为弓形虫病的临床诊断及治疗与弓形虫疫苗的研究开辟广阔前景。
作者单位：中国医科大学寄生虫学教研室(110011)
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16.Kasper LH.An unexpected response of vaccination with a purified majer membrane eachyzoite antigen(p30)of Toxoplasma gondii.J of Immunology，1995，134：3426.
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