肾上腺髓质素在缺氧性肺动脉高压演进过程中的作用
作者：李桢 李强 童斌 刘忠令
单位：李桢 童斌(上海 200433 上海第二军医大学长海医院)；李强 刘忠令(上海 200001 上海三维生物技 术有限公司)
关键词：肾上腺髓质素；肺动脉；高血压；缺氧症；内皮素
中国现代应用药学000304 摘要 目的：研究肾上腺髓质素(AM)在缺氧性肺动脉高压(HPHT)演进过 程中含量的变化规律及其与ET-1的关系。方法：应用常压间断缺氧法建 立大鼠HPHT模型，用放免法测定对照组和不同缺氧时间组血浆和肺组织AM浓度以及血浆ET- 1浓度，并用免疫组化方法观察不同组大鼠肺AM的分布和含量变化。结果：缺氧3d起血浆AM浓度增高，14d起进一步增高；ET-1/AM值自缺氧第1天起增高，7～10d达 到高峰；肺组织AM浓度缺氧14起升高；免疫组化示AM样物质主要沉积于血管，缺氧14～21d 组染色颗粒明显增多。结论：AM可能在HPHT演进过程中起重要作用。
, 百拇医药
Effect of adrenomedullin on development of
pulmonary atery hypertension
Li Zhen
(Shanghai Sunway Biotech Ltd.Co,Shanghai 200001)
Li Qiang
(Shanghai Sunway Biotech Ltd.Co,Shanghai 200001)
Liu Zhongling
(Shanghai Sunway Biotech Ltd.Co,Shanghai 200001)
, http://www.100md.com
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the variation of adrenomedullin(AM) co ncentration and its relation to ET-1 in the development of hypoxic pulmonary ar tery hypertension(HPHT).METHOD:HPHT rat models were established by i ntermittent nomobaric hypoxia and The concentrations of AM in serium and lung ti ssue as well as The concentration of ET-1 in serium were measured by radioimmun oassay.Distribution and changes of AM in lung tissue were observed immunohistoch emically.RESULTS:AM serium concentration increased from the 3rd day of hypoxia and became higher from the 14th day on while value of ET -1/AM increased on 1st day of hypoxia and reached its peak on the 7～10 th day.AM-like immunoreactive fibres were mainly localized within pulmonary vascular vessels and increased significantly in the 14～21st day of hypox ia.CONCLUSION:AM may be an important factor relating to pathogenesis of HPHT.
, http://www.100md.com
KEY WORDS adrenomedullin,hypoxia,pulmonary arteries,hype rtension,endothelin
缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary artery hy pertension,HPHT)是很多呼吸系统疾病的病理生理基础，但其发病机制尚未完全阐明。有证 据表明很多血管活性物质在HPHT发生，发展过程中起有重要作用。肾上腺髓质素(Adrenomed ullin,AM)是新近发现的一种具有强扩血管作用的多肽，本文旨在通过观察在HPHT演进过程 中AM含量的变化，探讨AM在HPHT发病机制中的作用极其潜在的治疗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与模型复制
雄性SD大 鼠，250～350g,随机分为对照组(C)，缺氧1d组(T1)，缺氧3d组(T3)，缺氧5d组(T5)，缺氧7 d组(T7)，缺氧10d组(T10)，缺氧14d组(T14)和缺氧21d组(T21)，每组6～12只动物。采用常 压间断缺氧法[1]复制HPHT动物模型，对照组不缺氧。采用右心导管法[2] 测定大鼠右心室收缩压(Rs)，肺动脉平均压(mPAP)。动物处死后测定右心室/左心室+室间隔 重量比(RV/LV+S)，以这些指标反映模型建立情况。
, 百拇医药
1.2 血浆和肺匀浆 放免测定
自右心室抽血5ml,置于含EDTA(1mg/ml)和抑肽酶(500KIU/ml血浆)的试管内,4℃, 1600×g离心20min,分离血浆,-70℃保存。取100mg左右湿重的右下肺组织，加入预冷的0.5M 醋酸1ml,100℃水浴10min,匀浆化,4℃,1600×g离心20min,-70℃保存。使用AM试剂盒(美国P eninsula Lab)和ET-1试剂盒(解放军总医院东亚免疫技术研究所)，按操作说明方法，测定 血浆和肺匀浆的AM和ET-1放免含量。
1.3 免疫组化分析
取上述动物 模型每组4只，处死后剪开胸腔，作右心室插管至肺动脉根部，灌注泽波氏液(Zamboni)固定 肺组织。20min后取下左肺组织，移入固定液中。12h后移入用0.01mol/L PBS配制的25%蔗糖 溶液。24h后行恒温箱切片。采用LSAB法进行免疫组化染色。兔抗大鼠肾上腺髓质素IgG(美 国Peninsula Lab)，LSAB试剂盒(丹麦DAKO公司)。用图像分析仪(Olympus)记数高倍视野内 肺血管染色阳性纤维数。
, 百拇医药
1.4 统计分析
各组数据均以X±S表示，采用德国Jerry编制的NCSS软件包，对多组均数进行ANOVA分析，两两比较用Newma n-Keul & Duccan检验。
2 结 果
2.1 模型建立
缺氧对大鼠肺动脉血流动力学的影响见表1，可见mPAP和Rs自缺氧7d起升高(P<0.05)，RV/L+S自缺氧14d起升高，以上结果显示HPHT模型成功建立。
表1 缺氧对大鼠血流动力学的影响 Group
Number
RV/(LV+S)
, http://www.100md.com
Rs/Kp
mPAP/Kp
Contol
12
0.209±0.051
3.400±0.323
2.446±0.282
T1
10
0.238±0.024
3.300±0.214
2.407±0.324
, 百拇医药
T3
8
0.248±0.034
3.157±0.526
2.824±0.169
T5
9
0.259±0.016
3.200±0.848
3.174±0.373
T7
10
, 百拇医药
0.229± 0.023
4.600±0.616*
3.456±0.595*
T10
10
0.267±0.033
4.712±0.888*
3.514±0.589*
T14
9
0.292±0.018*
, 百拇医药
4.586±0.734*
3.706±0.563*
T21
8
0.301±0.014*
4.527±0.595*
3.714±0.636*
注：*P<0.05 vs control
2.2 AM 和ET-1含量测定
血浆AM和ET-1含量变化以及ET-1/AM值变 化见表2，可见AM含量从缺氧3d起就明显升高，缺氧14d起又进一步升高。而ET-1/AM比值从 缺氧第1天起就有升高，缺氧7～10d达到高峰。肺匀浆AM含量变化见图1，可见自缺氧14d起 含量明显升高。
, 百拇医药
2.3 免疫组化染色
大鼠肺组织有AM样免疫物质，主要在血管及其周围 富积。缺氧使肺血管大量AM样物质着色，图象分析结果见表3，可见缺氧14～21d组AM染色阳 性纤维明显增多。
3 讨 论
肾上腺髓质素是1993年 被发现的一种具有强扩血管作用的物质[3]，它在肺部的含量较高，提示其可能活 跃地参与肺部的生理和病理活动。Yang[4]等的实验结果显示，AM扩张肺动脉的作 用要强于主动脉。AM与ET-1，NO等与肺动脉高压发病有关的因子之间有密切的相互作用。因此，AM可能在缺氧 性肺动脉高压的发病机制中起有一定的作用。
表2 缺氧性肺动脉高压形成过程中AM，ET-1及其比 值的变化 Group
Numbers
, 百拇医药
AM/pg.ml-1
ET-1/pg.ml-1
ET-1/AM(‰)
Control
12
145.43±31.74
2.25±0.67
10.34±0.56
T1
10
133.98±24.53
, 百拇医药
3.15±0.93*
16.14±0.12 *1
T3
8
214.04±25.29*1
13.46±3.40*1
52.25± 6.23*1
T5
9
236.62±30.24*1
13.57±5.93*1
, http://www.100md.com
48. 05±8.01*1
T7
10
248.81±36.53*1
16.49±6.25*1
67.15±10.21*2
T10
10
216.37±21.48*1
18.86±5.52 *1
, http://www.100md.com
73.23±9.96*2
T14
9
277.81±22.91*3
17.11±3.37*4
53.21±5.11 *1
T21
8
311.65±28.21*3
16.16±5.52*4
, http://www.100md.com
43.23±6 .21*1
注：*1P<0.05 vs control； *2P<0.05 vs control & T1-T5 & T14-T21；*3P<0.05 vs control & T3-T10；*4P<0.001 vs control
图1 缺氧性肺动脉高压 形成过程中肺匀浆AM浓度的变化
*P<0.05
表3 HPHT模型肺血管免疫组化变化 Group
Numbers
AM-IR fibers(fibers/cm2)
, 百拇医药
Control
5
1.71±0.52
T3
5
1.91±0.51
T7
4
1.82±0.43
T10
5
2.03±0.65
T14
, 百拇医药
5
2.81±0.89*
T21
5
2.76±0.43*
注：*P<0.05 vs control
本文动态观察了HPHT演进过程中AM含量的变 化，发现血浆AM浓度从缺氧第3天起就开始升高，而反映组织含量的肺匀浆浓度则从缺氧14d 才开始升高。血管内皮细胞和平滑肌细胞是合成和释放AM的主要场所[5]，本文免 疫组化的结果也提示血管是肺部AM的主要产生部位。肺组织匀浆AM浓度的增高主要反映了肺 血管合成和分泌AM的变化，免疫组化结果也显示缺氧14d左右肺血管AM染色纤维增多，因此 ，本文结果提示从缺氧2周左右起肺血管合成和分泌AM才有明显的增高。血浆AM浓度变化的 原因较多，本文结果提示缺氧早期血浆AM浓度的增高可能不是肺源性的。由于AM在生理浓度 水平主要是以自分泌或旁分泌的方式作用的[6]，因此可以推测，在HPHT发展过程 中，AM对肺血管的作用在缺氧早期并无明显增强，直到缺氧2周左右其作用才有增强。另一 方面，即使从血浆浓度来看，本文结果显示早期AM浓度虽有增高，但ET-1/AM值在缺氧过程 中却明显升高，提示尽管AM浓度在缺氧早期有所升高，但ET-1的升幅更大，而使AM处于相 对不足状态。而从缺氧2周左右，ET-1/AM值则反而比峰值有所下降，提示此时AM的分泌有 了明显的升高。
, 百拇医药
本文以及有关文献者发现[1，7]，HPHT动物模型在缺氧早期，肺 动脉压升高非常迅速，病程急剧进展；而至缺氧2周起，病程则处于一个相对稳定期。本文A M含量的变化规律，与HPHT演进特点在时相上相吻合：缺氧早期，AM合成与分泌相对不足， 而ET-1含量剧增，可能是导致这期间HPHT急剧进展的一个原因；缺氧2周左右，AM合成与分 泌增加，可能通过旁分泌，自分泌或内分泌等途径增强对肺动脉的作用，是这期间HPHT处于 相对稳定的一个可能原因。因此，本文结果提示，AM可能是一个在缺氧性肺动脉高压发病过 程中起重要作用的代偿因子。有文献报道，AM对肺动脉较为敏感，可以在不影响循环血压的 情况下降低肺动脉压力，因此是一个有潜在临床应用价值的治疗HPHT的药物。而本文的结果 ，AM在HPHT早期急剧进展期自身合成分泌明显减少，因此如在这一时期使用，可能会取得更 好的治疗作用。
参考文献
1，薛全福，谢创鸣，胡长贵，等.常压缺氧性大鼠肺动脉高 压模型的建立.中华结核与呼吸杂志，1989,12(6)∶350.
, http://www.100md.com
2，孙波，刘文利.右心导管测定大鼠肺动脉压的实验方法. 中国医学科学院报,1984,6∶465.
3，Kitamura K,Kanagawa K,Kawamoto M,et al.Adrenomedullin:a novel peptide isolated from human pheochromocyteoma.Biochem B iophy Res Commun,1993,192∶553.
4，Yang BC,Lippton H,Gumusel B,et al.Adr enomedullin dilates rat pulmonary atery rings during hypoxic:role of nitric oxid e and vasodilator prostagladins.J Cardiovasc Pharmacol,1996,28(3)∶458.
5，Shimekake Y,Nagata K,Ohta S,et al.Adr enomedullin stimulates two signal transduction pathways,cAMP accumulation and Ca 2+ mobilization in bovine aortic endothellial cells.J Biol Chem,1995,270∶ 4412.
, http://www.100md.com
6，Meeran K,O'Shea D,Upton PD,et al.Circ ulating adrenomedullin does not regulat systemic blood pressure but increase ser iuma prolactin after intravenously infusion in humans:a pharmacokinetic study.J Clin Endocrinol Metab,1997,83∶95.
7，程德云，陈文彬，杨小东.不同缺氧时间对大鼠肺循环改 变的影响.华西医科大学学报,1997,28∶259.
收稿日期：1999-08-31, http://www.100md.com
单位：李桢 童斌(上海 200433 上海第二军医大学长海医院)；李强 刘忠令(上海 200001 上海三维生物技 术有限公司)
关键词：肾上腺髓质素；肺动脉；高血压；缺氧症；内皮素
中国现代应用药学000304 摘要 目的：研究肾上腺髓质素(AM)在缺氧性肺动脉高压(HPHT)演进过 程中含量的变化规律及其与ET-1的关系。方法：应用常压间断缺氧法建 立大鼠HPHT模型，用放免法测定对照组和不同缺氧时间组血浆和肺组织AM浓度以及血浆ET- 1浓度，并用免疫组化方法观察不同组大鼠肺AM的分布和含量变化。结果：缺氧3d起血浆AM浓度增高，14d起进一步增高；ET-1/AM值自缺氧第1天起增高，7～10d达 到高峰；肺组织AM浓度缺氧14起升高；免疫组化示AM样物质主要沉积于血管，缺氧14～21d 组染色颗粒明显增多。结论：AM可能在HPHT演进过程中起重要作用。
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Effect of adrenomedullin on development of
pulmonary atery hypertension
Li Zhen
(Shanghai Sunway Biotech Ltd.Co,Shanghai 200001)
Li Qiang
(Shanghai Sunway Biotech Ltd.Co,Shanghai 200001)
Liu Zhongling
(Shanghai Sunway Biotech Ltd.Co,Shanghai 200001)
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ABSTRACT OBJECTIVE：To study the variation of adrenomedullin(AM) co ncentration and its relation to ET-1 in the development of hypoxic pulmonary ar tery hypertension(HPHT).METHOD:HPHT rat models were established by i ntermittent nomobaric hypoxia and The concentrations of AM in serium and lung ti ssue as well as The concentration of ET-1 in serium were measured by radioimmun oassay.Distribution and changes of AM in lung tissue were observed immunohistoch emically.RESULTS:AM serium concentration increased from the 3rd day of hypoxia and became higher from the 14th day on while value of ET -1/AM increased on 1st day of hypoxia and reached its peak on the 7～10 th day.AM-like immunoreactive fibres were mainly localized within pulmonary vascular vessels and increased significantly in the 14～21st day of hypox ia.CONCLUSION:AM may be an important factor relating to pathogenesis of HPHT.
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KEY WORDS adrenomedullin,hypoxia,pulmonary arteries,hype rtension,endothelin
缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary artery hy pertension,HPHT)是很多呼吸系统疾病的病理生理基础，但其发病机制尚未完全阐明。有证 据表明很多血管活性物质在HPHT发生，发展过程中起有重要作用。肾上腺髓质素(Adrenomed ullin,AM)是新近发现的一种具有强扩血管作用的多肽，本文旨在通过观察在HPHT演进过程 中AM含量的变化，探讨AM在HPHT发病机制中的作用极其潜在的治疗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与模型复制
雄性SD大 鼠，250～350g,随机分为对照组(C)，缺氧1d组(T1)，缺氧3d组(T3)，缺氧5d组(T5)，缺氧7 d组(T7)，缺氧10d组(T10)，缺氧14d组(T14)和缺氧21d组(T21)，每组6～12只动物。采用常 压间断缺氧法[1]复制HPHT动物模型，对照组不缺氧。采用右心导管法[2] 测定大鼠右心室收缩压(Rs)，肺动脉平均压(mPAP)。动物处死后测定右心室/左心室+室间隔 重量比(RV/LV+S)，以这些指标反映模型建立情况。
, 百拇医药
1.2 血浆和肺匀浆 放免测定
自右心室抽血5ml,置于含EDTA(1mg/ml)和抑肽酶(500KIU/ml血浆)的试管内,4℃, 1600×g离心20min,分离血浆,-70℃保存。取100mg左右湿重的右下肺组织，加入预冷的0.5M 醋酸1ml,100℃水浴10min,匀浆化,4℃,1600×g离心20min,-70℃保存。使用AM试剂盒(美国P eninsula Lab)和ET-1试剂盒(解放军总医院东亚免疫技术研究所)，按操作说明方法，测定 血浆和肺匀浆的AM和ET-1放免含量。
1.3 免疫组化分析
取上述动物 模型每组4只，处死后剪开胸腔，作右心室插管至肺动脉根部，灌注泽波氏液(Zamboni)固定 肺组织。20min后取下左肺组织，移入固定液中。12h后移入用0.01mol/L PBS配制的25%蔗糖 溶液。24h后行恒温箱切片。采用LSAB法进行免疫组化染色。兔抗大鼠肾上腺髓质素IgG(美 国Peninsula Lab)，LSAB试剂盒(丹麦DAKO公司)。用图像分析仪(Olympus)记数高倍视野内 肺血管染色阳性纤维数。
, 百拇医药
1.4 统计分析
各组数据均以X±S表示，采用德国Jerry编制的NCSS软件包，对多组均数进行ANOVA分析，两两比较用Newma n-Keul & Duccan检验。
2 结 果
2.1 模型建立
缺氧对大鼠肺动脉血流动力学的影响见表1，可见mPAP和Rs自缺氧7d起升高(P<0.05)，RV/L+S自缺氧14d起升高，以上结果显示HPHT模型成功建立。
表1 缺氧对大鼠血流动力学的影响 Group
Number
RV/(LV+S)
, http://www.100md.com
Rs/Kp
mPAP/Kp
Contol
12
0.209±0.051
3.400±0.323
2.446±0.282
T1
10
0.238±0.024
3.300±0.214
2.407±0.324
, 百拇医药
T3
8
0.248±0.034
3.157±0.526
2.824±0.169
T5
9
0.259±0.016
3.200±0.848
3.174±0.373
T7
10
, 百拇医药
0.229± 0.023
4.600±0.616*
3.456±0.595*
T10
10
0.267±0.033
4.712±0.888*
3.514±0.589*
T14
9
0.292±0.018*
, 百拇医药
4.586±0.734*
3.706±0.563*
T21
8
0.301±0.014*
4.527±0.595*
3.714±0.636*
注：*P<0.05 vs control
2.2 AM 和ET-1含量测定
血浆AM和ET-1含量变化以及ET-1/AM值变 化见表2，可见AM含量从缺氧3d起就明显升高，缺氧14d起又进一步升高。而ET-1/AM比值从 缺氧第1天起就有升高，缺氧7～10d达到高峰。肺匀浆AM含量变化见图1，可见自缺氧14d起 含量明显升高。
, 百拇医药
2.3 免疫组化染色
大鼠肺组织有AM样免疫物质，主要在血管及其周围 富积。缺氧使肺血管大量AM样物质着色，图象分析结果见表3，可见缺氧14～21d组AM染色阳 性纤维明显增多。
3 讨 论
肾上腺髓质素是1993年 被发现的一种具有强扩血管作用的物质[3]，它在肺部的含量较高，提示其可能活 跃地参与肺部的生理和病理活动。Yang[4]等的实验结果显示，AM扩张肺动脉的作 用要强于主动脉。AM与ET-1，NO等与肺动脉高压发病有关的因子之间有密切的相互作用。因此，AM可能在缺氧 性肺动脉高压的发病机制中起有一定的作用。
表2 缺氧性肺动脉高压形成过程中AM，ET-1及其比 值的变化 Group
Numbers
, 百拇医药
AM/pg.ml-1
ET-1/pg.ml-1
ET-1/AM(‰)
Control
12
145.43±31.74
2.25±0.67
10.34±0.56
T1
10
133.98±24.53
, 百拇医药
3.15±0.93*
16.14±0.12 *1
T3
8
214.04±25.29*1
13.46±3.40*1
52.25± 6.23*1
T5
9
236.62±30.24*1
13.57±5.93*1
, http://www.100md.com
48. 05±8.01*1
T7
10
248.81±36.53*1
16.49±6.25*1
67.15±10.21*2
T10
10
216.37±21.48*1
18.86±5.52 *1
, http://www.100md.com
73.23±9.96*2
T14
9
277.81±22.91*3
17.11±3.37*4
53.21±5.11 *1
T21
8
311.65±28.21*3
16.16±5.52*4
, http://www.100md.com
43.23±6 .21*1
注：*1P<0.05 vs control； *2P<0.05 vs control & T1-T5 & T14-T21；*3P<0.05 vs control & T3-T10；*4P<0.001 vs control
图1 缺氧性肺动脉高压 形成过程中肺匀浆AM浓度的变化
*P<0.05
表3 HPHT模型肺血管免疫组化变化 Group
Numbers
AM-IR fibers(fibers/cm2)
, 百拇医药
Control
5
1.71±0.52
T3
5
1.91±0.51
T7
4
1.82±0.43
T10
5
2.03±0.65
T14
, 百拇医药
5
2.81±0.89*
T21
5
2.76±0.43*
注：*P<0.05 vs control
本文动态观察了HPHT演进过程中AM含量的变 化，发现血浆AM浓度从缺氧第3天起就开始升高，而反映组织含量的肺匀浆浓度则从缺氧14d 才开始升高。血管内皮细胞和平滑肌细胞是合成和释放AM的主要场所[5]，本文免 疫组化的结果也提示血管是肺部AM的主要产生部位。肺组织匀浆AM浓度的增高主要反映了肺 血管合成和分泌AM的变化，免疫组化结果也显示缺氧14d左右肺血管AM染色纤维增多，因此 ，本文结果提示从缺氧2周左右起肺血管合成和分泌AM才有明显的增高。血浆AM浓度变化的 原因较多，本文结果提示缺氧早期血浆AM浓度的增高可能不是肺源性的。由于AM在生理浓度 水平主要是以自分泌或旁分泌的方式作用的[6]，因此可以推测，在HPHT发展过程 中，AM对肺血管的作用在缺氧早期并无明显增强，直到缺氧2周左右其作用才有增强。另一 方面，即使从血浆浓度来看，本文结果显示早期AM浓度虽有增高，但ET-1/AM值在缺氧过程 中却明显升高，提示尽管AM浓度在缺氧早期有所升高，但ET-1的升幅更大，而使AM处于相 对不足状态。而从缺氧2周左右，ET-1/AM值则反而比峰值有所下降，提示此时AM的分泌有 了明显的升高。
, 百拇医药
本文以及有关文献者发现[1，7]，HPHT动物模型在缺氧早期，肺 动脉压升高非常迅速，病程急剧进展；而至缺氧2周起，病程则处于一个相对稳定期。本文A M含量的变化规律，与HPHT演进特点在时相上相吻合：缺氧早期，AM合成与分泌相对不足， 而ET-1含量剧增，可能是导致这期间HPHT急剧进展的一个原因；缺氧2周左右，AM合成与分 泌增加，可能通过旁分泌，自分泌或内分泌等途径增强对肺动脉的作用，是这期间HPHT处于 相对稳定的一个可能原因。因此，本文结果提示，AM可能是一个在缺氧性肺动脉高压发病过 程中起重要作用的代偿因子。有文献报道，AM对肺动脉较为敏感，可以在不影响循环血压的 情况下降低肺动脉压力，因此是一个有潜在临床应用价值的治疗HPHT的药物。而本文的结果 ，AM在HPHT早期急剧进展期自身合成分泌明显减少，因此如在这一时期使用，可能会取得更 好的治疗作用。
参考文献
1，薛全福，谢创鸣，胡长贵，等.常压缺氧性大鼠肺动脉高 压模型的建立.中华结核与呼吸杂志，1989,12(6)∶350.
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收稿日期：1999-08-31, http://www.100md.com