银杏叶醇提取物对异烟肼和利福平肝毒性保护作用的实验研究
作者：王建刚 周海梅 侯湘波 宋晓伟 赵立发 王淑英 吴银萍
单位：洛阳 471003 洛阳医学高等专科学校
关键词：银杏叶醇提取物；肝保护；异烟肼；利福平；肝毒性
中国现代应用药学000303 摘要 目的：观察银杏叶醇提取 物对异烟肼和利福平肝毒性的保护作用及其机制探讨。方法：分别测定 肝损害组和银杏叶醇提取物大、小剂量组小鼠的血清谷丙转胺酶(SGPT)、肝指数、肝匀浆丙 二醛(MDA)含量、肝微粒体P450和线粒体Ca2+ ATP酶活性，以及肝病理检查， 并与对照组比较。结果：银杏叶醇提取物大、小剂量均可对抗异烟肼和 利福平引起的MDA、SGPT、肝微粒体P450的增高(P<0.05)，以及对 抗其引起的形态学改变；银杏叶醇提取物大剂量对抗其线粒体Ca2+ ATP酶活性的降低 。结论：银杏叶醇提取物可对抗异烟肼和利福平所致肝毒性。
, http://www.100md.com
Protective effect of ethanol extracts of ginkgo
biloba leaves on mice hepatic toxic injury
induced by isoniazid and rifampicin
Wang Jiangang
(Luoyang Medical College,Luoyang 471003)
Zhou Haimei
(Luoyang Medical College,Luoyang 471003)
Hou Xiangbo
, 百拇医药
(Luoyang Medical College,Luoyang 471003)
ABSTRACT OBJECTIVE：To observe the protective effect of ethanol extracts from ginkgo biloba leaves on mice hepatic toxic injury induced by isoniazid and rifampicin.METHODS:The level of SGPT,liver index,content of malondia ldehyde(MDA) of liver homogenate,activity of hepatic microsome enzyme and mitoch ondrial membrane Ca2+ ATP enzyme,and degree of liver cell injury were meas ured.RESULTS:The ethanol extracts from ginkgo biloba leaves decrease d the level of SGPT,liver index,content of MDA of liver homogenate,activity of h epatic microsome enzyme(P<0.05),and the degree of liver injury.On t he other hand,ethanolic extracts from ginkgo biloba leaves increased the activit y of mitochondrial membrane Ca2+ ATP enzyme.CONCLUSION:The eth anol extracts from ginkgo biloba leaves had the protective effect on mice hepati c toxic injury induced by isoniazid and rifampicin.
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KEY WORDS ethanol extracts from ginkgo biloba leaves,protective effect of liver,isoniazid,rifampicin,hepatic toxic injury
异烟肼与利福平是目前结核病短程疗法的必需药物[1]。但异烟肼和 利福平联合用药毒性明显增加，严重影响了病人的健康和结核病的疗效[2]。因此 寻找既能增加异烟肼和利福平疗效又能对抗它们不良反应的药物，显得很有必要。近年来研 究资料表明，银杏叶含有多种化学成份，有着广泛的药理作用[3,4]，尤其是它的 抗脂质过氧化作用，为其保肝作用提供了理论基础。本文就银杏叶醇提取物对异烟肼肝毒性 的保护作用及其机制予以探讨。
1 材料和方法
1.1 银杏叶醇提取物的制备与银杏叶提取物鉴定 10月底收集银杏 落叶，洗净风干，研成粉末干燥备用。 称取银杏叶粉适量，加70%乙醇水浴热回流2次，每次3h,合并滤液，减压蒸馏除去溶剂，挥 干，用20%乙醇溶解、过滤、水浴蒸去溶剂后挥干，以少量乙醇溶解，上硅胶柱，依次用95% 乙醇、75%乙醇和水洗脱，合并乙醇洗脱部分，挥去溶剂后得糖浆状提取物[5]。干 燥后用生理盐水溶解备用。按文献方法以芦丁作对照(芦丁对照品：中国药品生物制品检定 所)为标准，70%乙醇为溶剂测定黄酮含量，结果提取物总黄酮含量为17.12%。实验用提 取物100mg/kg,相当于总黄酮17.12mg/kg;50mg/kg相当于8.56mg/kg。
, 百拇医药
1.2 动物与用药 昆明种小鼠40只，雌雄各半(河南医科大学实验动 物中心)，体重18～24g(21.3±1.8)g,随机分为4组(Ⅰ组：生理盐水对照组)：生理盐水ip, 0.1ml/10g,每天1次连用5d;Ⅱ组(肝损伤组：异烟肼+利福平)：异烟肼(广州明兴制药厂 ，批号：971221-14),利福平(武汉制药厂，批号：970403);异烟肼和利福平分别用生理盐 水配制为0.4%和0.1%溶液。均以0.1ml/10g,ip,每日1次，利福平连用5d,异烟肼用药2d 于第4、5天各ip 1次。Ⅲ组(银杏叶醇提取物小剂量组)：在Ⅱ组用药的基础上，再用0.5%银 杏叶提取物,ip,0.1ml/10g(50mg/kg),连用5d;Ⅳ组(银杏叶醇提取物大剂量组)：在Ⅱ组用药 的基础上，腹腔注射1%银杏叶提取物,0.1ml/10g(100mg/kg),连用5d。全部动物于第6天称体 重，断头取血，剖腹取肝洗净揩干称重。
1.3 主要仪器与试剂 721 分光光度仪(上海第三分析仪器厂),FZQ-2型旋涡混旋器，电动细胞匀浆机,TGL-16G高速 冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。试剂均用分析纯。
, 百拇医药
1.4 用赖氏法 测定血清谷转氨酶(SGPT)活性。
1.5 肝指数及形态学观察 肝指数=肝 重(mg)/处死前体重(g)。取肝左叶，立即用福尔马林液固定2周，常规切片，HE染色。
1.6 肝匀浆MDA测定 准确取肝0.3g,加3ml生理盐水，用电动细胞匀浆机 匀浆1min制成细胞匀浆。按TBA显色法测定丙二醛含量[6]。
1.7 肝微粒体细胞色素P450含量和肝线粒体Ca2+ ATP酶活 性测定 取肝0.5g,用0.25mol/L蔗糖-Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)用电动匀浆机制成20%肝匀 浆，然后用差速离心法制备肝微粒体和线粒体[7],然后测定及计算肝微粒体P4 50含量[8]和肝线粒体Ca2+ ATP酶活性测定[9]。
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1.8 统计学处理 2组间显著性测定用t检验。
2 结 果
2.1 银杏叶醇提取物对小鼠体重、肝湿重 及肝指数的影响 银杏叶醇提取物大剂量组在实验后体重有所降低(P<0.05), 肝指数增加。肝指数增加是由于体重降低所致(表1)。
表1 银杏叶醇提取物对小鼠体重、肝湿重及肝指数的影 响 组 别
实验前体重
/ g
处死前体重
/g
肝湿重
/g
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肝指数
/±s
Ⅰ组
21.7±1.8
23.3±2.8
1.38±0.19
5.96±0.54
Ⅱ组
21.4±2.2
23.3±2.7
1.44±0.22
6.18±0.48
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Ⅲ组
21.4±1.8
22.2±3.2
1.41±0.25
6.35±0.59
Ⅳ组
21.6±1.4
20.4±2.0*
1.35±0.15
6.54±0.48
注：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组均与Ⅱ组比较，*P<0.05
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2.2 银杏叶醇提取物对小鼠SGPT和肝病理性改变的影响 异烟肼和利福 平组的SGPT明显升高，银杏叶醇提取物大小剂量组均与正常对照无差别；形态学检查在光学 显微镜下，异烟肼和利福平组的多数小鼠都有肝细胞水泡样变性，有些还可见坏死，而银杏 叶组损害程度明显减轻。根据损伤轻重分为4级,(-)为正常,(+)肝细胞轻度水泡样变性,(++) 变性程度加重，且偶见散在点状坏死;(+++)每个视野均可见点状坏死病灶。其结果见表2。
表2 银杏叶醇提取物对小鼠SGPT和肝病理性改变的影 响 组 别
sGPT(x±s/
赖氏单位
病理改变
-
+
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++
+++
Ⅰ组
30.41±7.29*1
6
4
0
0*1
Ⅱ组
47.86±9.41
2
3
4
, 百拇医药
1
Ⅲ组
33.44±4.28*1
6
3
1
0*1
Ⅳ组
28.12±4.31*2
7
3
0
, 百拇医药 0*1
注：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组均与Ⅱ组比较，*1P<0.05；*2P <0.01
2.3 银杏叶醇提取物对肝匀浆MDA、细胞色素P450、Ca2+ A TP酶活性影响 异烟肼和利福平组的MDA及细胞色素P450含量均明显增加而Ca2+ ATP酶活性则明显降低。银杏叶醇提取物大小剂量组则能对抗异烟肼和利福平增加MDA及 细胞色素P450含量的作用及降低Ca2+ ATP酶活性(但小剂量P >0.05)的作用(见表3)。
3 讨 论
异烟肼和利福平的肝损害机制为利福平诱导了肝药酶，从而加速了异烟肼的代谢[10， 11]，其代谢物具有脂质过氧化作用，引起细胞膜及线粒体膜的脂质过氧化，线粒体膜Ca 2+ ATP酶活性降低，细胞内及线粒体内Ca2+过多，致使细胞变性甚至死亡；而 银杏叶提取物自由基的清除作用及可能的肝药酶抑制作用，以及继发的线粒体膜 的Ca2+ ATP酶保护作用，可能是肝保护作用的药理基础。
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表3 银杏叶醇提取物对小鼠肝匀浆MDA、P450 和Ca2+ ATP酶活性的影响 组别
MDA
/nmol.g组织-1
P450/nmol.g
微粒体蛋白-1
Ca2+ ATP酶活性
/μmol Pi.mg pr-1 .h-1
Ⅰ组
, 百拇医药
158.0±57.9*1
5.89±2.17*1
21.57±3.77*1
Ⅱ组
210.9±57.4
7.57±1.90
16.95±4.34
Ⅲ组
142.2±24.3*2
5.34±0.42*2
, 百拇医药
19.41±4.26
Ⅳ组
122.1±40.2*2
4.83±0.75*2
22.06±4.26*2
注：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组均与Ⅱ组比较，*1P<0.05；*2P<0.01
参考文献
1，何国钧.抗结核化疗的进展和存在的问题浅议. 中华结核和呼吸杂志，1993，16(2)∶67.
2，焦晓玲，杨毓章，肖跃平，等.抗结核药不良反 应监测.药物流行病学杂志，1995，4(2)∶77.
, 百拇医药
3，冯汉林，郑意端.银杏叶的药用.中国中药药杂 志，1996，3(10)∶13.
4，王巧明，台育 秦.银杏叶的研究概况.甘肃中医学院学报，1998，15(1)∶48.
5，庄向平，虞杏英，杨更生.银杏叶提取物.中草 药，1992，23(2)∶122.
6，Okawa H,Ohi shi N,Yaji K.Assay for lipid peroxidex in animal tissues by thiobarbituric acid reaction.Anal Biochem,1979,95(2)∶351.
7，刘晓芳，伸来福，夏元洵.维生素E对氯丁二烯 所致大鼠肝损害的预防作用.中国药理学与毒理学杂志，1995，9(4)∶283.
8，姚朗，石晓者，腾翁和，等.青蒿琥酯及四种经 典抗疟药对大鼠肝线粒体亚铁螯合酶活性的影响.中国药理学与毒理学杂志，1996，10(3)∶ 239.
, 百拇医药
9，赵保昌，姚晓丹，顾淑珍，等. 四氯化碳中毒大鼠肝脏Ca2+ ATP酶和磷酸化a活性的研究.中华劳动卫生职业病杂志， 1990，8(4)∶215.
10，张仁亮，王振钺，李端，等.利福平对大鼠异烟肼及其 代谢物乙酰肼 药物动力学的影响.中国药理学报，1992，13(6)∶494.
11，Sarma GR.Rifampicin-induced release of hydrazin e from isoniazid.Am Rev Reapir Dis,1986,133∶1072.
收稿日期：1999-01-15, 百拇医药
单位：洛阳 471003 洛阳医学高等专科学校
关键词：银杏叶醇提取物；肝保护；异烟肼；利福平；肝毒性
中国现代应用药学000303 摘要 目的：观察银杏叶醇提取 物对异烟肼和利福平肝毒性的保护作用及其机制探讨。方法：分别测定 肝损害组和银杏叶醇提取物大、小剂量组小鼠的血清谷丙转胺酶(SGPT)、肝指数、肝匀浆丙 二醛(MDA)含量、肝微粒体P450和线粒体Ca2+ ATP酶活性，以及肝病理检查， 并与对照组比较。结果：银杏叶醇提取物大、小剂量均可对抗异烟肼和 利福平引起的MDA、SGPT、肝微粒体P450的增高(P<0.05)，以及对 抗其引起的形态学改变；银杏叶醇提取物大剂量对抗其线粒体Ca2+ ATP酶活性的降低 。结论：银杏叶醇提取物可对抗异烟肼和利福平所致肝毒性。
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Protective effect of ethanol extracts of ginkgo
biloba leaves on mice hepatic toxic injury
induced by isoniazid and rifampicin
Wang Jiangang
(Luoyang Medical College,Luoyang 471003)
Zhou Haimei
(Luoyang Medical College,Luoyang 471003)
Hou Xiangbo
, 百拇医药
(Luoyang Medical College,Luoyang 471003)
ABSTRACT OBJECTIVE：To observe the protective effect of ethanol extracts from ginkgo biloba leaves on mice hepatic toxic injury induced by isoniazid and rifampicin.METHODS:The level of SGPT,liver index,content of malondia ldehyde(MDA) of liver homogenate,activity of hepatic microsome enzyme and mitoch ondrial membrane Ca2+ ATP enzyme,and degree of liver cell injury were meas ured.RESULTS:The ethanol extracts from ginkgo biloba leaves decrease d the level of SGPT,liver index,content of MDA of liver homogenate,activity of h epatic microsome enzyme(P<0.05),and the degree of liver injury.On t he other hand,ethanolic extracts from ginkgo biloba leaves increased the activit y of mitochondrial membrane Ca2+ ATP enzyme.CONCLUSION:The eth anol extracts from ginkgo biloba leaves had the protective effect on mice hepati c toxic injury induced by isoniazid and rifampicin.
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KEY WORDS ethanol extracts from ginkgo biloba leaves,protective effect of liver,isoniazid,rifampicin,hepatic toxic injury
异烟肼与利福平是目前结核病短程疗法的必需药物[1]。但异烟肼和 利福平联合用药毒性明显增加，严重影响了病人的健康和结核病的疗效[2]。因此 寻找既能增加异烟肼和利福平疗效又能对抗它们不良反应的药物，显得很有必要。近年来研 究资料表明，银杏叶含有多种化学成份，有着广泛的药理作用[3,4]，尤其是它的 抗脂质过氧化作用，为其保肝作用提供了理论基础。本文就银杏叶醇提取物对异烟肼肝毒性 的保护作用及其机制予以探讨。
1 材料和方法
1.1 银杏叶醇提取物的制备与银杏叶提取物鉴定 10月底收集银杏 落叶，洗净风干，研成粉末干燥备用。 称取银杏叶粉适量，加70%乙醇水浴热回流2次，每次3h,合并滤液，减压蒸馏除去溶剂，挥 干，用20%乙醇溶解、过滤、水浴蒸去溶剂后挥干，以少量乙醇溶解，上硅胶柱，依次用95% 乙醇、75%乙醇和水洗脱，合并乙醇洗脱部分，挥去溶剂后得糖浆状提取物[5]。干 燥后用生理盐水溶解备用。按文献方法以芦丁作对照(芦丁对照品：中国药品生物制品检定 所)为标准，70%乙醇为溶剂测定黄酮含量，结果提取物总黄酮含量为17.12%。实验用提 取物100mg/kg,相当于总黄酮17.12mg/kg;50mg/kg相当于8.56mg/kg。
, 百拇医药
1.2 动物与用药 昆明种小鼠40只，雌雄各半(河南医科大学实验动 物中心)，体重18～24g(21.3±1.8)g,随机分为4组(Ⅰ组：生理盐水对照组)：生理盐水ip, 0.1ml/10g,每天1次连用5d;Ⅱ组(肝损伤组：异烟肼+利福平)：异烟肼(广州明兴制药厂 ，批号：971221-14),利福平(武汉制药厂，批号：970403);异烟肼和利福平分别用生理盐 水配制为0.4%和0.1%溶液。均以0.1ml/10g,ip,每日1次，利福平连用5d,异烟肼用药2d 于第4、5天各ip 1次。Ⅲ组(银杏叶醇提取物小剂量组)：在Ⅱ组用药的基础上，再用0.5%银 杏叶提取物,ip,0.1ml/10g(50mg/kg),连用5d;Ⅳ组(银杏叶醇提取物大剂量组)：在Ⅱ组用药 的基础上，腹腔注射1%银杏叶提取物,0.1ml/10g(100mg/kg),连用5d。全部动物于第6天称体 重，断头取血，剖腹取肝洗净揩干称重。
1.3 主要仪器与试剂 721 分光光度仪(上海第三分析仪器厂),FZQ-2型旋涡混旋器，电动细胞匀浆机,TGL-16G高速 冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。试剂均用分析纯。
, 百拇医药
1.4 用赖氏法 测定血清谷转氨酶(SGPT)活性。
1.5 肝指数及形态学观察 肝指数=肝 重(mg)/处死前体重(g)。取肝左叶，立即用福尔马林液固定2周，常规切片，HE染色。
1.6 肝匀浆MDA测定 准确取肝0.3g,加3ml生理盐水，用电动细胞匀浆机 匀浆1min制成细胞匀浆。按TBA显色法测定丙二醛含量[6]。
1.7 肝微粒体细胞色素P450含量和肝线粒体Ca2+ ATP酶活 性测定 取肝0.5g,用0.25mol/L蔗糖-Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)用电动匀浆机制成20%肝匀 浆，然后用差速离心法制备肝微粒体和线粒体[7],然后测定及计算肝微粒体P4 50含量[8]和肝线粒体Ca2+ ATP酶活性测定[9]。
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1.8 统计学处理 2组间显著性测定用t检验。
2 结 果
2.1 银杏叶醇提取物对小鼠体重、肝湿重 及肝指数的影响 银杏叶醇提取物大剂量组在实验后体重有所降低(P<0.05), 肝指数增加。肝指数增加是由于体重降低所致(表1)。
表1 银杏叶醇提取物对小鼠体重、肝湿重及肝指数的影 响 组 别
实验前体重
/ g
处死前体重
/g
肝湿重
/g
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肝指数
/±s
Ⅰ组
21.7±1.8
23.3±2.8
1.38±0.19
5.96±0.54
Ⅱ组
21.4±2.2
23.3±2.7
1.44±0.22
6.18±0.48
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Ⅲ组
21.4±1.8
22.2±3.2
1.41±0.25
6.35±0.59
Ⅳ组
21.6±1.4
20.4±2.0*
1.35±0.15
6.54±0.48
注：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组均与Ⅱ组比较，*P<0.05
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2.2 银杏叶醇提取物对小鼠SGPT和肝病理性改变的影响 异烟肼和利福 平组的SGPT明显升高，银杏叶醇提取物大小剂量组均与正常对照无差别；形态学检查在光学 显微镜下，异烟肼和利福平组的多数小鼠都有肝细胞水泡样变性，有些还可见坏死，而银杏 叶组损害程度明显减轻。根据损伤轻重分为4级,(-)为正常,(+)肝细胞轻度水泡样变性,(++) 变性程度加重，且偶见散在点状坏死;(+++)每个视野均可见点状坏死病灶。其结果见表2。
表2 银杏叶醇提取物对小鼠SGPT和肝病理性改变的影 响 组 别
sGPT(x±s/
赖氏单位
病理改变
-
+
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++
+++
Ⅰ组
30.41±7.29*1
6
4
0
0*1
Ⅱ组
47.86±9.41
2
3
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1
Ⅲ组
33.44±4.28*1
6
3
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0*1
Ⅳ组
28.12±4.31*2
7
3
0
, 百拇医药 0*1
注：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组均与Ⅱ组比较，*1P<0.05；*2P <0.01
2.3 银杏叶醇提取物对肝匀浆MDA、细胞色素P450、Ca2+ A TP酶活性影响 异烟肼和利福平组的MDA及细胞色素P450含量均明显增加而Ca2+ ATP酶活性则明显降低。银杏叶醇提取物大小剂量组则能对抗异烟肼和利福平增加MDA及 细胞色素P450含量的作用及降低Ca2+ ATP酶活性(但小剂量P >0.05)的作用(见表3)。
3 讨 论
异烟肼和利福平的肝损害机制为利福平诱导了肝药酶，从而加速了异烟肼的代谢[10， 11]，其代谢物具有脂质过氧化作用，引起细胞膜及线粒体膜的脂质过氧化，线粒体膜Ca 2+ ATP酶活性降低，细胞内及线粒体内Ca2+过多，致使细胞变性甚至死亡；而 银杏叶提取物自由基的清除作用及可能的肝药酶抑制作用，以及继发的线粒体膜 的Ca2+ ATP酶保护作用，可能是肝保护作用的药理基础。
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表3 银杏叶醇提取物对小鼠肝匀浆MDA、P450 和Ca2+ ATP酶活性的影响 组别
MDA
/nmol.g组织-1
P450/nmol.g
微粒体蛋白-1
Ca2+ ATP酶活性
/μmol Pi.mg pr-1 .h-1
Ⅰ组
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158.0±57.9*1
5.89±2.17*1
21.57±3.77*1
Ⅱ组
210.9±57.4
7.57±1.90
16.95±4.34
Ⅲ组
142.2±24.3*2
5.34±0.42*2
, 百拇医药
19.41±4.26
Ⅳ组
122.1±40.2*2
4.83±0.75*2
22.06±4.26*2
注：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组均与Ⅱ组比较，*1P<0.05；*2P<0.01
参考文献
1，何国钧.抗结核化疗的进展和存在的问题浅议. 中华结核和呼吸杂志，1993，16(2)∶67.
2，焦晓玲，杨毓章，肖跃平，等.抗结核药不良反 应监测.药物流行病学杂志，1995，4(2)∶77.
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3，冯汉林，郑意端.银杏叶的药用.中国中药药杂 志，1996，3(10)∶13.
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5，庄向平，虞杏英，杨更生.银杏叶提取物.中草 药，1992，23(2)∶122.
6，Okawa H,Ohi shi N,Yaji K.Assay for lipid peroxidex in animal tissues by thiobarbituric acid reaction.Anal Biochem,1979,95(2)∶351.
7，刘晓芳，伸来福，夏元洵.维生素E对氯丁二烯 所致大鼠肝损害的预防作用.中国药理学与毒理学杂志，1995，9(4)∶283.
8，姚朗，石晓者，腾翁和，等.青蒿琥酯及四种经 典抗疟药对大鼠肝线粒体亚铁螯合酶活性的影响.中国药理学与毒理学杂志，1996，10(3)∶ 239.
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10，张仁亮，王振钺，李端，等.利福平对大鼠异烟肼及其 代谢物乙酰肼 药物动力学的影响.中国药理学报，1992，13(6)∶494.
11，Sarma GR.Rifampicin-induced release of hydrazin e from isoniazid.Am Rev Reapir Dis,1986,133∶1072.
收稿日期：1999-01-15, 百拇医药