MUC1 粘蛋白基因表达在诊断乳腺癌隐性淋巴结转移中的临床运用
作者：李继梅 孙丽亚 唐睿珠 王秦秦 张立新 李春海
单位：李继梅 唐睿珠 王秦秦(云南省肿瘤研究所)；孙丽亚 张立新 李春海(军事医学科学研究院肿瘤分子生物学研究室，昆明 650032)
关键词：RT-PCR；MUC1粘蛋白；乳腺肿瘤
昆明医学院学报000304 摘要：采用特异、敏感的RT-PCR技术，检测来自20例乳腺癌病人的108个HE染色阴性的腋窝淋巴结MUC1 mRNA的表达，结果MUC11 mRNA在108个HE染色阴性淋巴结中阳性检出率为66%.提示：这些淋巴结中存在肿瘤隐蔽淋巴结转移，这种转移可能是一个或数个肿瘤细胞的转移，以此来提高微转移诊断率，可指导术后治疗，延长患者生存期.结果表明：MUC11 mRNA的RT-PCR分析法可用于乳癌淋巴结微转移诊断中，具有很高的临床使用价值.
中图分类号：R 7304.4，R 737.9 文献标识码：A 文章编号：1003-4706(2000) 03-0014-03
, http://www.100md.com
The Clinical Research on MUC1 Gene in Detection of
Breast Cancer Micrometstases in Axillary Lymph Nodes
LI Ji-mei，TANG Rui-zhu，WANG Qin-qin
(Yunnan Tumor Institute)
SUN Li-ya，ZHANG Li-zin，LI Chun-hai
(Department of Tumor Molecular Biology of Military Medical Academy, Kunming 650032)
Abstract：We tested MUC1 mRNA expression of 108 lymph nodes ( stained negative with HE) taken from 20 breast cancer patients by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Results: Of the 108 histologically negative lymph nodes, 71 ( 66%) were found to express MUC1 mRNA. This indicated the presence of micrometastases, caused by one or two tumor cells, in these 71 lymph nodes could be detected only by RT-PCR method but not by histological examination. Conclusion: The MUC1 mRNA RT-PCR assay has higher detection sensitivity and would be of practical value in selection the patients at high risk for relapse from those who are histologically lymph node negative.
, 百拇医药
Key words：RT-PCR； MUC1 mucin； Breast carcinoma
MUC1粘蛋白是一种高分子量糖蛋白，主要存在于某些上皮性组织和器官中，特别是在所有正常及癌变乳腺组织中均表达，而在间叶组织中不表达〔1〕.由于MUC1的表达具有组织特异性，即主要表达于乳腺等上皮性组织中，而在间叶组织来源的淋巴结中不表达.因此MUC1可作为某些上皮性肿瘤发生淋巴结转移的有效标志物.本研究拟在国外有关实验的基础上建立MUC1 mRNA RT-PCR分析法用于乳癌腋窝淋巴结微转移灶的诊断，以指导乳癌患者的术后治疗，延长生存期，使我省乳癌诊治水平达到国内甚至国外先进水平.
1 材料与方法
1.1 材料
20例乳腺癌组织及腋窝淋巴结手术均取自昆医附一院胸科住院手术病人，所有标本在术后1.5 h内置液氮中保存，并留切部分作相应常规病理学检查.
, http://www.100md.com
1.2 引物设计及各种工具酶
MUCI1 基因引物由军科院肿瘤分子生物学实验室设计提供.其序列为A1(5′-CGTCGTGGACATTGATGGTACC-3′)，A2(5′-GTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA-3′)，内参照采用β-微球蛋白基因，两对引物均在Beckman Oligo 1000DNA合成仪上合成，各种工具酶分别购自Promega公司和华美公司.
1.3 方法
组织总RNA提取采取用异硫氰酸胍，酚-氯仿一步法提取.AMV逆转录酶42℃60 min合成cDNA，再以此为模板结进行PCR循环.阴性对照用未做RT总RNA做模板，空白对照在扩增时不加TaqDNA聚合酶.
RT-PCR结束后，取扩增产物10 μL，进行2%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，Kodak Digital Science凝胶成像系统照相，打印结果.
, 百拇医药
2 结果
2.1 乳腺组织MUC1 mRNA的表达
8例乳腺癌组织中，经RT-PCR检查均表达MUC1 mRNA，阳性检出率为100%
2.2 HE染色阴性淋巴结中MUC1 mRNA的表达
临床样本的MUC1和内参照β-微球蛋白扩增,结果见附图.MUC1和β-微球蛋白分别得到288 bp和150 bp左右的扩增条带，与所设计的扩增片段相符.空白对照和阴性对照均未见扩增条带，来自20例乳癌病人的108个HE染色未见转移的淋巴结中71个经RT-PCR方法后有MUC1mRNA表达，阳性检出率为66%，大大提高了微转移灶的诊断率.
附图 RT-PCR电泳图
, 百拇医药
1.MUC1(-)；2.PCR Markers:1 543 pb,994 bp,697 bp,515 bp,377 bp,237 bp,3～5.MUC1(+)，为288 bp(536 bp为基因组DNA扩增产物)，150 bp为β-微球蛋白；6.阴性对照.
3 讨论
乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，近年来发病率有上升趋势，其发病率已居女性肿瘤之首位，严重影响了人民的身心健康.目前乳腺癌以早期手术为主要原则.影响其术后预后的因素很多，其中腋窝淋巴结有无转移是确定综合治疗方案和影响预后的重要因素之一.研究表明：淋巴结转移与生存率呈正相关〔2〕.有统计表明淋巴结阴性的乳癌患者的10 a发病率是20%～30%，可以认为这些患者在诊断之初可能就存在隐蔽的淋巴结转移或全身转移〔3,4〕，用常规的组织病理方法甚至免疫组化方法都不易发现，需要找更为敏感有效的标志物或方法来解决这一问题.
, http://www.100md.com
MUC1粘蛋白是一种高分子量膜糖蛋白，主要存在于某些上皮性组织和器官中.如乳腺、胰腺、卵巢和结肠等，特别是在所有正常及癌变组织中均表达而在间叶组织来源的淋巴结中不表达〔1〕，因些MUC1可作为某些上皮性肿瘤发生淋巴结转移的有效标志物.
由于常规组织病理方法甚至免疫组化方法常常不能检出一些微转移病灶.1991年国际乳癌研究小组推出了一种连续切片病检方法以诊断微小转移灶，可使微转移灶检出率提高20%左右〔5〕，但费时费力，不适用于常规检测.近年来由于分子生物学技术的发展及新的肿瘤标志物出现，使从血液、骨髓、淋巴结中更有效地发现微转移灶成为可能.国外已开始采用RT-PCR法，意在检测癌肿细胞中广泛表达而正常淋巴结和骨髓细胞中不表达的基因.Wang等人利用酪氨酸酶来检测淋巴结和外周血中黑色素瘤细胞的存在〔6〕.对乳癌病人Nongchit和Schenfeld分别利用MUC1和K19基因为标志物，来检测腋窝淋巴结微转移灶的存在〔7,8〕.Gerhard等人发展了一种敏感性很高的PCR方法来检测肠、胰腺或胃癌病人骨髓中表达CEA的肿瘤细胞的存在〔9〕.
, http://www.100md.com
我们在国外有关实验的基础上，建立了自己的MUC1 mRNA RT-PCR分析法用于乳癌腋窝淋巴结微转移灶的诊断.结果在108个常规病理学检查阴性的淋巴结中有71个发现有MUC1 mRNA的表达.阳性检出率为66%，大大提高了微转移灶的诊断率.提示RT-PCR检测淋巴结中MUC1 mRNA的表达作为一种监测癌细胞隐性淋巴结转移的手段是可行的.可用以指导乳癌病人术后的治疗方案，降低发病率，提高治愈率，延长患者生存期.
当然，RT-PCR检测技术的潜力还受到肿瘤标志物的特异性、样品收集、保存等诸多因素所限，但仍远远敏感于免疫组化法，二者相辅相成.将其应用于其它上皮性肿瘤微转移灶诊断仍有待于进一步的探讨.
基金项目：云南省应用基础研究基金资助项目 (96CO77Q)
作者简介：李继梅(1969～)，女，云南昆明人，理学学士，主要从事肿瘤免疫学及分子生物学的研究.
, http://www.100md.com
参考文献
[1] ZOTTER S,LOSSNTTZER A,KUNZE K D,et al.Epithelial markers for paraffinembedded human tissues[J].Cancer Res,1985,406:237
[2] 沈镇宙.乳腺癌的治疗[J].实用外科杂志，1991，11(8)：417
[3] FISHER E ,REDMOND C,FISHER B,et al. Prognostic factors in NSABP studies of women with node-negative dreat cancer[J].Monnog Natl Cancer Inst ,1992,11:151
[4] NASSER I A,LEE A K C,BOSARI S,et al.Occult axillary lymph onde metastaes in “node-negative”breast cacinoma[J].Human Pathol,1993,24(9):950
, http://www.100md.com
[5] GUSTERSON B.Are micrometastases clinically relevant[J].Br J Hosp,1991,47:247
[6] WANG X,HELIER R,VANVOORHIS N, et al.Detection of submicroscopic lymph node metastases with polymerase chain reaction in patients with malignant melanemea[J].Ann Surg,1994,220:768
[7] NOGUHI S ,AIHARA T,MOTOMURA K ,et al.Detecion of breast cancer micrometases in axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction comparison between MUC1 mRNA and keratin 19 mRNA amplification[J].Am J Pathol,1996,148(2):649
, http://www.100md.com
[8] SCHOENFELD A,LUQMANI Y,SMITH D,et al.Detection of breast cancer micrometasetases in axillary iymph nodes by using polymerase chain reaction[J].Cancer Res,1994,54:2986
[9] GEHARD M, JUHL H,KALTHOFF H,et al .Specific detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymeerase chain reaction[J].J Clin Oncol,1994, 12:725
(1999-12-20收稿), 百拇医药
单位：李继梅 唐睿珠 王秦秦(云南省肿瘤研究所)；孙丽亚 张立新 李春海(军事医学科学研究院肿瘤分子生物学研究室，昆明 650032)
关键词：RT-PCR；MUC1粘蛋白；乳腺肿瘤
昆明医学院学报000304 摘要：采用特异、敏感的RT-PCR技术，检测来自20例乳腺癌病人的108个HE染色阴性的腋窝淋巴结MUC1 mRNA的表达，结果MUC11 mRNA在108个HE染色阴性淋巴结中阳性检出率为66%.提示：这些淋巴结中存在肿瘤隐蔽淋巴结转移，这种转移可能是一个或数个肿瘤细胞的转移，以此来提高微转移诊断率，可指导术后治疗，延长患者生存期.结果表明：MUC11 mRNA的RT-PCR分析法可用于乳癌淋巴结微转移诊断中，具有很高的临床使用价值.
中图分类号：R 7304.4，R 737.9 文献标识码：A 文章编号：1003-4706(2000) 03-0014-03
, http://www.100md.com
The Clinical Research on MUC1 Gene in Detection of
Breast Cancer Micrometstases in Axillary Lymph Nodes
LI Ji-mei，TANG Rui-zhu，WANG Qin-qin
(Yunnan Tumor Institute)
SUN Li-ya，ZHANG Li-zin，LI Chun-hai
(Department of Tumor Molecular Biology of Military Medical Academy, Kunming 650032)
Abstract：We tested MUC1 mRNA expression of 108 lymph nodes ( stained negative with HE) taken from 20 breast cancer patients by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Results: Of the 108 histologically negative lymph nodes, 71 ( 66%) were found to express MUC1 mRNA. This indicated the presence of micrometastases, caused by one or two tumor cells, in these 71 lymph nodes could be detected only by RT-PCR method but not by histological examination. Conclusion: The MUC1 mRNA RT-PCR assay has higher detection sensitivity and would be of practical value in selection the patients at high risk for relapse from those who are histologically lymph node negative.
, 百拇医药
Key words：RT-PCR； MUC1 mucin； Breast carcinoma
MUC1粘蛋白是一种高分子量糖蛋白，主要存在于某些上皮性组织和器官中，特别是在所有正常及癌变乳腺组织中均表达，而在间叶组织中不表达〔1〕.由于MUC1的表达具有组织特异性，即主要表达于乳腺等上皮性组织中，而在间叶组织来源的淋巴结中不表达.因此MUC1可作为某些上皮性肿瘤发生淋巴结转移的有效标志物.本研究拟在国外有关实验的基础上建立MUC1 mRNA RT-PCR分析法用于乳癌腋窝淋巴结微转移灶的诊断，以指导乳癌患者的术后治疗，延长生存期，使我省乳癌诊治水平达到国内甚至国外先进水平.
1 材料与方法
1.1 材料
20例乳腺癌组织及腋窝淋巴结手术均取自昆医附一院胸科住院手术病人，所有标本在术后1.5 h内置液氮中保存，并留切部分作相应常规病理学检查.
, http://www.100md.com
1.2 引物设计及各种工具酶
MUCI1 基因引物由军科院肿瘤分子生物学实验室设计提供.其序列为A1(5′-CGTCGTGGACATTGATGGTACC-3′)，A2(5′-GTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA-3′)，内参照采用β-微球蛋白基因，两对引物均在Beckman Oligo 1000DNA合成仪上合成，各种工具酶分别购自Promega公司和华美公司.
1.3 方法
组织总RNA提取采取用异硫氰酸胍，酚-氯仿一步法提取.AMV逆转录酶42℃60 min合成cDNA，再以此为模板结进行PCR循环.阴性对照用未做RT总RNA做模板，空白对照在扩增时不加TaqDNA聚合酶.
RT-PCR结束后，取扩增产物10 μL，进行2%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，Kodak Digital Science凝胶成像系统照相，打印结果.
, 百拇医药
2 结果
2.1 乳腺组织MUC1 mRNA的表达
8例乳腺癌组织中，经RT-PCR检查均表达MUC1 mRNA，阳性检出率为100%
2.2 HE染色阴性淋巴结中MUC1 mRNA的表达
临床样本的MUC1和内参照β-微球蛋白扩增,结果见附图.MUC1和β-微球蛋白分别得到288 bp和150 bp左右的扩增条带，与所设计的扩增片段相符.空白对照和阴性对照均未见扩增条带，来自20例乳癌病人的108个HE染色未见转移的淋巴结中71个经RT-PCR方法后有MUC1mRNA表达，阳性检出率为66%，大大提高了微转移灶的诊断率.
附图 RT-PCR电泳图
, 百拇医药
1.MUC1(-)；2.PCR Markers:1 543 pb,994 bp,697 bp,515 bp,377 bp,237 bp,3～5.MUC1(+)，为288 bp(536 bp为基因组DNA扩增产物)，150 bp为β-微球蛋白；6.阴性对照.
3 讨论
乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，近年来发病率有上升趋势，其发病率已居女性肿瘤之首位，严重影响了人民的身心健康.目前乳腺癌以早期手术为主要原则.影响其术后预后的因素很多，其中腋窝淋巴结有无转移是确定综合治疗方案和影响预后的重要因素之一.研究表明：淋巴结转移与生存率呈正相关〔2〕.有统计表明淋巴结阴性的乳癌患者的10 a发病率是20%～30%，可以认为这些患者在诊断之初可能就存在隐蔽的淋巴结转移或全身转移〔3,4〕，用常规的组织病理方法甚至免疫组化方法都不易发现，需要找更为敏感有效的标志物或方法来解决这一问题.
, http://www.100md.com
MUC1粘蛋白是一种高分子量膜糖蛋白，主要存在于某些上皮性组织和器官中.如乳腺、胰腺、卵巢和结肠等，特别是在所有正常及癌变组织中均表达而在间叶组织来源的淋巴结中不表达〔1〕，因些MUC1可作为某些上皮性肿瘤发生淋巴结转移的有效标志物.
由于常规组织病理方法甚至免疫组化方法常常不能检出一些微转移病灶.1991年国际乳癌研究小组推出了一种连续切片病检方法以诊断微小转移灶，可使微转移灶检出率提高20%左右〔5〕，但费时费力，不适用于常规检测.近年来由于分子生物学技术的发展及新的肿瘤标志物出现，使从血液、骨髓、淋巴结中更有效地发现微转移灶成为可能.国外已开始采用RT-PCR法，意在检测癌肿细胞中广泛表达而正常淋巴结和骨髓细胞中不表达的基因.Wang等人利用酪氨酸酶来检测淋巴结和外周血中黑色素瘤细胞的存在〔6〕.对乳癌病人Nongchit和Schenfeld分别利用MUC1和K19基因为标志物，来检测腋窝淋巴结微转移灶的存在〔7,8〕.Gerhard等人发展了一种敏感性很高的PCR方法来检测肠、胰腺或胃癌病人骨髓中表达CEA的肿瘤细胞的存在〔9〕.
, http://www.100md.com
我们在国外有关实验的基础上，建立了自己的MUC1 mRNA RT-PCR分析法用于乳癌腋窝淋巴结微转移灶的诊断.结果在108个常规病理学检查阴性的淋巴结中有71个发现有MUC1 mRNA的表达.阳性检出率为66%，大大提高了微转移灶的诊断率.提示RT-PCR检测淋巴结中MUC1 mRNA的表达作为一种监测癌细胞隐性淋巴结转移的手段是可行的.可用以指导乳癌病人术后的治疗方案，降低发病率，提高治愈率，延长患者生存期.
当然，RT-PCR检测技术的潜力还受到肿瘤标志物的特异性、样品收集、保存等诸多因素所限，但仍远远敏感于免疫组化法，二者相辅相成.将其应用于其它上皮性肿瘤微转移灶诊断仍有待于进一步的探讨.
基金项目：云南省应用基础研究基金资助项目 (96CO77Q)
作者简介：李继梅(1969～)，女，云南昆明人，理学学士，主要从事肿瘤免疫学及分子生物学的研究.
, http://www.100md.com
参考文献
[1] ZOTTER S,LOSSNTTZER A,KUNZE K D,et al.Epithelial markers for paraffinembedded human tissues[J].Cancer Res,1985,406:237
[2] 沈镇宙.乳腺癌的治疗[J].实用外科杂志，1991，11(8)：417
[3] FISHER E ,REDMOND C,FISHER B,et al. Prognostic factors in NSABP studies of women with node-negative dreat cancer[J].Monnog Natl Cancer Inst ,1992,11:151
[4] NASSER I A,LEE A K C,BOSARI S,et al.Occult axillary lymph onde metastaes in “node-negative”breast cacinoma[J].Human Pathol,1993,24(9):950
, http://www.100md.com
[5] GUSTERSON B.Are micrometastases clinically relevant[J].Br J Hosp,1991,47:247
[6] WANG X,HELIER R,VANVOORHIS N, et al.Detection of submicroscopic lymph node metastases with polymerase chain reaction in patients with malignant melanemea[J].Ann Surg,1994,220:768
[7] NOGUHI S ,AIHARA T,MOTOMURA K ,et al.Detecion of breast cancer micrometases in axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction comparison between MUC1 mRNA and keratin 19 mRNA amplification[J].Am J Pathol,1996,148(2):649
, http://www.100md.com
[8] SCHOENFELD A,LUQMANI Y,SMITH D,et al.Detection of breast cancer micrometasetases in axillary iymph nodes by using polymerase chain reaction[J].Cancer Res,1994,54:2986
[9] GEHARD M, JUHL H,KALTHOFF H,et al .Specific detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymeerase chain reaction[J].J Clin Oncol,1994, 12:725
(1999-12-20收稿), 百拇医药