妊娠小鼠子宫GMG细胞中活性蛋白与胚泡植入关系的研究
作者：翁静 许晴 梁元晶 路欣 史小林 诸定寿
单位：(首都医科大学生殖医学研究中心)
关键词：胚泡着床；颗粒子宫腺细胞；活性蛋白
首都医科大学学报000304 提要：取孕13～14 d小鼠的子宫腺细胞区，经细胞分离和蛋白提取获得颗粒子宫腺细胞(GMG细胞)中的活性蛋白。将注入活性蛋白的10只孕3 d小鼠作为实验组；对照组10只小鼠给予PBS。注射后5 d取子宫观察胚胎着床情况并计算孕胚数。结果：实验组有9只可见胚胎，胚胎数为112个；对照组有7只可见胚胎，胚胎数为87个。提示：GMG细胞中的活性蛋白对胚泡着床可能有一定促进作用。
中图分类号：Q492.6
The Relationship between Blastocyst
, http://www.100md.com
Implantation and Active Proteins within
Granulated Metrial Gland Cells
Weng Jing，Xu Qing，Liang Yuanjing，Lu Xin，Shi Xiaolin，Zhu Dingshou
(Reproductive Medical Center, Capital University of Medical Sciences)
Abstract: Twenty mice in 3 days of gestation were divided into 2 groups. Ten mice were subcutaneously injected with proteins derived from the isolated granulated metrial gland cells (as experimental group), the others with PBS (as control group). All mice were killed on the 5th day after injection. The numbers of pregnant mice and the implanted blastocysts were counted. Nine out of ten mice in experimental group were pregnant with totally 112 implanted blastocysts, whereas 7 out of ten mice with 87 implanted blastocysts in control group. The results indicate that proteins derived from the isolated GMG cells may promote the implantation of blastocyst.
, http://www.100md.com
Key words: blastocyst implantation; granulated metrial gland cell; active protein
未孕小鼠子宫系膜三角区由疏松结缔组织构成，内含血管、成纤维细胞和极少量小圆形细胞。妊娠后该区出现大量含有耐淀粉酶消化的过碘酸雪夫试剂(PAS)染色阳性的颗粒子宫腺细胞(granulated metrial gland cell, GMG细胞)。GMG细胞在每一植入点的系膜区密集成团，故该区改称为子宫腺细胞区[1]。GMG细胞在妊娠早期出现，中期最多，后期减少，产后消失。因其是孕期形成的一类特殊细胞，又有明显的周期变化，研究者一致认为它是与妊娠有密切关系的一类细胞[2]。有关这类细胞的形态结构和起源已有较多报道，但对于其确切的功能至今尚不清楚。1997年10月～1998年12月，我们取孕鼠子宫腺细胞区，分离GMG细胞，提取蛋白，进行蛋白与胚泡植入关系的研究。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
7～10周昆明种小鼠(首都医科大学实验动物部提供)，体质量约25 g，雌雄分笼饲养。每晚5时合笼，雌雄比为2∶1；次日晨8时查阴道，发现阴栓当日记为妊娠第1天。取妊娠13和14 d小鼠60只，断颈处死，取出子宫角。
子宫腺细胞区的采集：沿对系膜侧剪开子宫，暴露胚胎和胎盘。去除胚胎后，将胎盘自子宫壁上轻轻分离，取子宫壁上白色隆起部分(即子宫腺细胞区)，除去所带蜕膜及肌肉组织，置于液氮中备用(60只孕鼠共取子宫腺细胞区480个)。
GMG细胞的分离纯化参见文献[3]。即每一子宫腺细胞区切成4～6小块，经0.25%胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，再用Percoll非连续性密度梯度法纯化GMG细胞，可获得纯度在80%以上、活细胞占90%的GMG细胞。
GMG细胞中活性蛋白的提取：将分离获得的GMG细胞用PBS稀释为5×107 mL-1，移入电动匀浆器(冰浴)匀浆后低温离心(1 000 g，10 min)弃沉淀，上清液继续离心(10万 g，20 min)，弃沉淀，上清液即为含GMG细胞中活性蛋白的粗提液。
, 百拇医药
蛋白成分生物学实验：取孕3 d的小鼠20只分为2组(每组10只)。实验组小鼠腹腔内注射1 mL活性蛋白稀释液(1 mL活性蛋白用PBS稀释至10 mL)；对照组小鼠腹腔内注射PBS液1 mL。注射后第5天处死动物，取子宫，观察记录胚胎着床情况，计数胚胎数。
所得数据使用确切概率计算法和两样本秩和检验法进行统计学处理。
2 结果
实验组10只小鼠中，有9只可见胚胎着床(9/10)，1只未见胚胎。对照组7只可见胚胎(7/10)，3只无胚胎。2组相比较无显著性差异(P>0.05)。
实验组共有胚胎112个，平均每只11.2个。对照组共有胚胎数87个，平均每只8.7个。2组相比较无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
, 百拇医药
目前认为小鼠GMG细胞与人子宫内膜NK细胞是同源同功能细胞。在对人内膜NK细胞的研究中，发现它能分泌抑制因子，抑制淋巴细胞免疫活性，保护胚胎免遭排斥，从而有利于胚泡的着床[4，5]。而在小鼠还无证据证明GMG细胞与着床的关系。
本研究取小鼠子宫腺细胞区分离获得GMG细胞，进而提取细胞中的活性蛋白，注入孕3 d小鼠膀胱内，5 d后取子宫观察活性物质与胚泡着床的关系。结果显示，实验组10只小鼠中有9只真正妊娠，而对照组有7只真正妊娠；实验组着床的胚胎总数为112个，对照组为87个，实验组比对照组多25个。从数量上看，实验组的妊娠率及胚泡着床率均高于对照组，提示活性物质对胚泡着床有一定的促进作用。但因提取物为粗制品，加上实验动物数量较少，所以其作用不很显著，表现为数据经统计学处理无显著性差异。
本研究仅仅是对GMG细胞中蛋白成分的粗提取液与胚泡着床关系的研究，究竟是哪种成分起作用，还需进一步研究。
, 百拇医药
北京市自然科学基金资助项目(7892014)
参考文献
1，翁静,诸定寿.妊娠小鼠子宫内出现的一类特殊细胞颗粒子宫腺细胞.生殖与避孕,1994,14(3):178～181
2，诸定寿,史小林,翁静.妊娠妇女和啮齿类动物子宫内的自然杀伤细胞.生殖医学,1995,4(3):180～182
3，翁静,诸定寿,路欣,等.颗粒子宫腺细胞的分离、纯化与细胞化学的研究.中国组织化学与细胞化学杂志,1994,3(4):393～397
4，诸定寿,史小林.人早孕期蜕膜中细胞的组织化学与免疫组织化学研究.首都医学院学报,1991,12(2):110
5，Salim Daya, David A. Preliminary characterization of two types of suppressor cells in human uterus. Fertil Steril, 1985,44:778
收稿日期：1999-03-19, 百拇医药
单位：(首都医科大学生殖医学研究中心)
关键词：胚泡着床；颗粒子宫腺细胞；活性蛋白
首都医科大学学报000304 提要：取孕13～14 d小鼠的子宫腺细胞区，经细胞分离和蛋白提取获得颗粒子宫腺细胞(GMG细胞)中的活性蛋白。将注入活性蛋白的10只孕3 d小鼠作为实验组；对照组10只小鼠给予PBS。注射后5 d取子宫观察胚胎着床情况并计算孕胚数。结果：实验组有9只可见胚胎，胚胎数为112个；对照组有7只可见胚胎，胚胎数为87个。提示：GMG细胞中的活性蛋白对胚泡着床可能有一定促进作用。
中图分类号：Q492.6
The Relationship between Blastocyst
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Implantation and Active Proteins within
Granulated Metrial Gland Cells
Weng Jing，Xu Qing，Liang Yuanjing，Lu Xin，Shi Xiaolin，Zhu Dingshou
(Reproductive Medical Center, Capital University of Medical Sciences)
Abstract: Twenty mice in 3 days of gestation were divided into 2 groups. Ten mice were subcutaneously injected with proteins derived from the isolated granulated metrial gland cells (as experimental group), the others with PBS (as control group). All mice were killed on the 5th day after injection. The numbers of pregnant mice and the implanted blastocysts were counted. Nine out of ten mice in experimental group were pregnant with totally 112 implanted blastocysts, whereas 7 out of ten mice with 87 implanted blastocysts in control group. The results indicate that proteins derived from the isolated GMG cells may promote the implantation of blastocyst.
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Key words: blastocyst implantation; granulated metrial gland cell; active protein
未孕小鼠子宫系膜三角区由疏松结缔组织构成，内含血管、成纤维细胞和极少量小圆形细胞。妊娠后该区出现大量含有耐淀粉酶消化的过碘酸雪夫试剂(PAS)染色阳性的颗粒子宫腺细胞(granulated metrial gland cell, GMG细胞)。GMG细胞在每一植入点的系膜区密集成团，故该区改称为子宫腺细胞区[1]。GMG细胞在妊娠早期出现，中期最多，后期减少，产后消失。因其是孕期形成的一类特殊细胞，又有明显的周期变化，研究者一致认为它是与妊娠有密切关系的一类细胞[2]。有关这类细胞的形态结构和起源已有较多报道，但对于其确切的功能至今尚不清楚。1997年10月～1998年12月，我们取孕鼠子宫腺细胞区，分离GMG细胞，提取蛋白，进行蛋白与胚泡植入关系的研究。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
7～10周昆明种小鼠(首都医科大学实验动物部提供)，体质量约25 g，雌雄分笼饲养。每晚5时合笼，雌雄比为2∶1；次日晨8时查阴道，发现阴栓当日记为妊娠第1天。取妊娠13和14 d小鼠60只，断颈处死，取出子宫角。
子宫腺细胞区的采集：沿对系膜侧剪开子宫，暴露胚胎和胎盘。去除胚胎后，将胎盘自子宫壁上轻轻分离，取子宫壁上白色隆起部分(即子宫腺细胞区)，除去所带蜕膜及肌肉组织，置于液氮中备用(60只孕鼠共取子宫腺细胞区480个)。
GMG细胞的分离纯化参见文献[3]。即每一子宫腺细胞区切成4～6小块，经0.25%胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，再用Percoll非连续性密度梯度法纯化GMG细胞，可获得纯度在80%以上、活细胞占90%的GMG细胞。
GMG细胞中活性蛋白的提取：将分离获得的GMG细胞用PBS稀释为5×107 mL-1，移入电动匀浆器(冰浴)匀浆后低温离心(1 000 g，10 min)弃沉淀，上清液继续离心(10万 g，20 min)，弃沉淀，上清液即为含GMG细胞中活性蛋白的粗提液。
, 百拇医药
蛋白成分生物学实验：取孕3 d的小鼠20只分为2组(每组10只)。实验组小鼠腹腔内注射1 mL活性蛋白稀释液(1 mL活性蛋白用PBS稀释至10 mL)；对照组小鼠腹腔内注射PBS液1 mL。注射后第5天处死动物，取子宫，观察记录胚胎着床情况，计数胚胎数。
所得数据使用确切概率计算法和两样本秩和检验法进行统计学处理。
2 结果
实验组10只小鼠中，有9只可见胚胎着床(9/10)，1只未见胚胎。对照组7只可见胚胎(7/10)，3只无胚胎。2组相比较无显著性差异(P>0.05)。
实验组共有胚胎112个，平均每只11.2个。对照组共有胚胎数87个，平均每只8.7个。2组相比较无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
, 百拇医药
目前认为小鼠GMG细胞与人子宫内膜NK细胞是同源同功能细胞。在对人内膜NK细胞的研究中，发现它能分泌抑制因子，抑制淋巴细胞免疫活性，保护胚胎免遭排斥，从而有利于胚泡的着床[4，5]。而在小鼠还无证据证明GMG细胞与着床的关系。
本研究取小鼠子宫腺细胞区分离获得GMG细胞，进而提取细胞中的活性蛋白，注入孕3 d小鼠膀胱内，5 d后取子宫观察活性物质与胚泡着床的关系。结果显示，实验组10只小鼠中有9只真正妊娠，而对照组有7只真正妊娠；实验组着床的胚胎总数为112个，对照组为87个，实验组比对照组多25个。从数量上看，实验组的妊娠率及胚泡着床率均高于对照组，提示活性物质对胚泡着床有一定的促进作用。但因提取物为粗制品，加上实验动物数量较少，所以其作用不很显著，表现为数据经统计学处理无显著性差异。
本研究仅仅是对GMG细胞中蛋白成分的粗提取液与胚泡着床关系的研究，究竟是哪种成分起作用，还需进一步研究。
, 百拇医药
北京市自然科学基金资助项目(7892014)
参考文献
1，翁静,诸定寿.妊娠小鼠子宫内出现的一类特殊细胞颗粒子宫腺细胞.生殖与避孕,1994,14(3):178～181
2，诸定寿,史小林,翁静.妊娠妇女和啮齿类动物子宫内的自然杀伤细胞.生殖医学,1995,4(3):180～182
3，翁静,诸定寿,路欣,等.颗粒子宫腺细胞的分离、纯化与细胞化学的研究.中国组织化学与细胞化学杂志,1994,3(4):393～397
4，诸定寿,史小林.人早孕期蜕膜中细胞的组织化学与免疫组织化学研究.首都医学院学报,1991,12(2):110
5，Salim Daya, David A. Preliminary characterization of two types of suppressor cells in human uterus. Fertil Steril, 1985,44:778
收稿日期：1999-03-19, 百拇医药