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编号:10497364
壳聚糖作为敏感膜材料的研究
http://www.100md.com 《同济大学学报(医学版)》 2000年第3期
     作者:方华丰 周宜开 袁津玮 任恕

    单位:同济医科大学环境医学研究所,武汉 430030

    关键词:壳聚糖;敏感膜;化学发光;生物传感器

    同济医科大学学报000310 摘要 以壳聚糖为膜材料制成薄膜,运用生物素-亲和素系统将辣根过氧化物酶(HRP)固定在膜 上,固定化过程对HRP的活性无影响,而其稳定性提高,运用Luminol-H2O2-HRP化学 发光体系,对水样中微量H2O2进行检测,在10-6 ~10-9 mol/L范围内线 性关系良好,回归方程:Y=20.648X-215.239(X:nmol/L), 检测灵敏度为0.5 nmol/ L。实验研制的壳聚糖膜可制成生物传感器多功能敏感膜。

, 百拇医药     中图法分类号 R318.021, R329.2

    Study on Chitosan as Sensing Membrane M aterials

    Fang Huafeng Zhou Yikai Yuan Jinwei et al

    (Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical Un iversity, Wuhan 430030)

    Abstract Biotin-avidin system was used to fix HRP on a thin me mbrane which was made from chitosan.The trace hydrogen peroxide in water samples was determined by using enhanced chemiluminescence (ECL) detection with Luminol -H2O2-HRP reaction system. The linear correlation was good at the range of 10-6 to 10-9 mol/L. Correlation formulation: Y=20.648X-215.239 (X:nmol). The lower detection limit for H2O2 was 0.5 nmol. The manufactur ed HRP-chitosan membrane could be used as a sensing membrane of biosensor for dete ction of H2O2 in vivo.
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    Key words chitosan; sensing membrane; biosensor; chemilum inescene

    近几年来,固定化技术取得了较大的发展,很多生物活性物质被固定于电极表面,制成专一 性强、灵敏度高的生物传感器[1]。通过选择适当的载体及固定方法,可以大大提 高生物活性物质的稳定性,维持其生物活性。亲和素-生物素之间具有高度专一和强烈的相 互作用,在pH、温度、有机溶剂或变性剂等较大的变化范围内均能稳定存在,已广泛应用于 蛋白质的固定及生物传感器[2],亲和素-生物素系统的应用开辟了一类新的固定 化方法,它可方便地设计分子结构单元来赋予膜特定的功能[3]

    人们对壳聚糖用于固定酶等生物大分子很感兴趣,主要是由于它无毒,具有生物相容性等优 良的生物学性能,制成膜后,无色透明,具有较好的物理机械性能,它有丰富的氨基,可以 与酶共价偶联。Krajewska等用戊二醛的方法将尿激酶固定于壳聚糖膜上[4]。然而 用这种方法很容易使壳聚糖膜变黄、变硬、变脆,膜很容易破碎,不宜用于制备敏感膜,我 们采用了一系列浓度的戊二醛和甲醛实验都得到同样的结果,在本实验中,我们采用了一种 新的固定化方法。
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    1 材料和方法

    1.1 材料

    活性生物素(biotin-LC-NHS, Sigma公司);亲和素(Avidin, Sigma公司);生物素化辣根 过氧化物酶(B-HRP,Sigma公司);亲和素辣根过氧化物酶(A-HRP,Sigma公司); HRP (T YPE VI RI=3.0,sigma公司);鲁米诺(luminol, Serva公司);对碘苯酚(paraiodophenol, PIP, Merck公司);H2O2(浙江省临安县化工二厂);壳聚糖(脱乙酰度80%,自制)。

    发光工作液用0.2 mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制(含luminol 3.0×10-4 mol/L;H 2O2 5.0×10-3 mol/L;PIP 6.0×10-4 mol/L),发光工作液临用前 配制,静置2 h后使用。
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    1.2 壳聚糖膜的制备

    壳聚糖膜的制备方法参考Amiji等[5]人的方法,将适量的壳聚糖溶于0.1 mol/L冰 醋酸溶液,制成0.1 %(w/v)溶液,抽滤,将滤液置于塑料培养皿内,自然晾干,然后置于0 .1 mol/L NaOH溶液中浸泡24 h,用去离子双蒸水反复洗涤、浸泡,80 ℃烘干或贮存于PBS (pH7.4)中备用,调整壳聚糖用量后,可制得不同厚度的壳聚糖膜。

    1.3 壳聚糖膜吸水率的测定

    取膜厚约45~50 μm的壳聚糖膜浸泡于10 mmol/L冰醋酸及 PBS(pH7.4)中各10 min, 测定其吸水率。

    吸水率=(Ws-Wd)/Ws×100%

    (Ws:吸水后膜湿重; Wd:膜干重)
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    1.4 壳聚糖膜的生物素化

    取约2 cm2壳聚糖膜,加Biotin-LC-NHS的二甲基甲酰胺(DMF)液0.5 ml (1 mg/ml) ,0.1 mol/L NaHCO3溶液1 ml,置于小烧杯中,室温振动反应4 h,然后置4 ℃冰箱中过 夜。用PBS反复洗涤,浸泡。

    1.5 壳聚糖膜上HRP固定

    固定HRP采用A、B两种方法,见图1。

    图1 辣根过氧化物酶固定于壳聚糖膜

    1.5.1 A:取生物素化的壳聚糖膜,加Av-HRP(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml,室温反应 30 min,PBS洗涤3次。为了检验该过程,同时作对照实验:①取未生物素化膜,其余过程同 上;②取生物素化壳聚糖膜,先加亲和素(100 μg/ml) 5 μl, 再与Av-HRP反应。
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    1.5.2 B:取生物素化的壳聚糖膜,加亲和素(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml,室温反 应30 min,PBS洗涤3次,再加Biotin-HRP(100 μg/ml) 5 μl, PBS 2 ml,室温反应30 mi n,PBS洗涤3次。同时作对照实验:①取未生物素化的壳聚糖膜,其余过程同上,②不加亲 和素,直接加Biotin-HRP,其余过程同上,③以HRP替代B-HRP。

    1.6 化学发光检测HRP

    检测方法参照袁津玮等报道的方法[5],取壳聚糖膜约2 cm2,置发光管中 ,加pH8.5硼酸缓冲液200 μl浸没壳聚糖膜,加发光工作液100 μl,静置5 min,25 ℃, 记录连续测定的发光强度最大值及6 s积分值。

    1.7 HRP-壳聚糖膜检测水样中H2O2
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    取固定有HRP的壳聚糖膜约2 cm2,加入发光管,加pH8.5硼酸缓冲液200 μl浸没膜,加入 不同H2O2浓度的发光工作液100 μl,摇匀后,静置5 min,在LKB-1251发光仪(Pharma cia公司)上,连续测定最大发光强度。

    1.8 壳聚糖膜上HRP稳定性

    为了检验壳聚糖膜上HRP的稳定性,将HRP壳聚膜(约2 cm2)置于pH7.4 PBS中,同时用 与HRP壳聚糖膜发光强度近似的游离HRP(2×10-9 mol/L)作对照,4 ℃贮存,定时 取样,按1.6方法测定发光强度。

    2 结果

    2.1 壳聚糖膜的制备

    文献报道的制备壳聚糖膜的方法[6]是将壳聚糖醋酸溶液倾注于平板玻璃上,晾干 后即可成膜。实验中发现,壳聚糖膜对玻璃的粘附性很强,这样制得的膜很难取下,需用甘 油预涂表面,本实验改在具有一定极性的塑料培养皿中制膜,效果很好。壳聚糖对塑料表面 有一定的润湿能力,可以铺展成膜,晾干后粘附力降低,壳聚糖膜可以完整地取下,而且调整 壳聚糖用量,可以得到不同厚度的壳聚糖膜,本实验制得的壳聚糖膜无色透明,柔韧性好,具 有较好的机械强度。
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    2.2 壳聚糖膜的稳定性及吸水率

    研究表明,介质pH对壳聚糖膜的稳定性影响很大,在酸性条件下,壳聚糖膜易溶解,介质pH 越低,壳聚糖膜的稳定性越差。在pH3.5的溶液中壳聚糖膜0.5 h即变为絮状,但在pH>7 .0的条件下,壳聚糖膜不溶解,较稳定。壳聚糖膜有较高的吸水率,吸水后膜变厚,其吸 水率与介质pH有关,在酸性介质中,吸水率较高。

    表1 壳聚糖膜在不同介质中吸水率和厚度 介 质

    吸水率(%)

    膜厚(μm)

    冰醋酸

    72.30±3.27

    62.50±0.86
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    磷酸盐缓冲液

    37.90±1.52

    47.00±4.78

    2.3 壳聚糖膜的生物素化及化学发光检测

    壳聚糖上有丰富的伯氨基,性质较活泼,可以与生物素琥珀酰亚胺脂反应。影响增强化学发光强度的因素很多[7],如各物质的浓度,缓冲液pH、反应时间 、反应 温度等,本文增强化学发光检测条件是按有关文献进行的[5]。实验表明,在Lumino l-H2O2-HRP-PIP发光体系中,为了获得理想的发光检测效果,pH在8.0~8.7之间 为宜, 由于HRP的化学发光属于较平稳的持续发光, 因而增强化学发光达到相对稳定需要 一定时间,一般以静置5 min为宜。壳聚糖膜上HRP催化Luminol氧化发光,其检测结果见表 2。
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    表2 化学发光检测壳聚糖膜上HRP 固定方法

    最大发光强度

    (RLU/cm2)

    分光强度

    6S积分值

    (RLU/cm2)

    A

    Av-HRP

    3 037±52

    18 458±212

    Av Av-HRP
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    1 156±37

    6 438±106

    non-biotinylated

    membrane Av-HRP

    25±3

    131±6

    B

    Av B-HRP

    2 951±86

    17 875±187

    B-HRP

    103±32
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    615±87

    Av HRP

    38±5

    215±38

    non-biotinylated

    membrane B-HRP

    27±6

    129±12

    2.4 水样中H2O2检测

    H2O2浓度对化学发光影响较为显著, 可能是在不同条件下,化学发光反应机制不同所致 [8] , 一定范围内H2O2浓度与发光强度呈正相关,但其浓度不宜太高,否则,背景会相应增加, 而H2O2 浓度太低时,由于其本身不稳定,导致发光强度变异较大,因而我们采用去离子双蒸水配制 系列浓度H2O2,其检测结果见图2。直线方程为:Y=20.648X-215.239(X:nmol/ L)r=0.994,检测限为0.5 nmol/L。
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    图2 壳聚糖膜检测水样中H2O2

    2.5 壳聚糖膜上HRP的固定及稳定性

    我们在实验中发现,壳聚糖膜在醛基的作用下变黄、变脆,而且脱乙酰度越大,这种现 象越明显,这种壳聚糖膜极易破碎,不宜作为敏感膜,我们采用生物素-亲和素间的桥连作 用,成功地将HRP固定到壳聚糖膜上,而不改变膜的基本特征,所制备的敏感膜无色透明, 柔韧,机械性能较好,可以作为自载膜。

    HRP固定于壳聚糖膜后,其稳定性增加,结果见图3。

    图3 壳聚糖膜上HRP 的稳定性(4℃)

    3 讨论
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    本文首次报道将壳聚糖膜生物素化,并将HRP成功地固定于壳聚糖膜, 这种制备敏感膜的 方法有多种优点。① 壳聚糖是天然的高分子聚合物,其来源丰富,可根据不同需要很容易 制成不同厚度的薄膜;壳聚糖膜具有较好的机械性能,可制成自载膜, 在中性、碱性溶液 中稳定,可以在pH>7.0的水中长期浸泡;②生物素化生物大分子可以在壳聚糖膜上形成有 序膜或单分子层膜,可适用于蛋白质、酶、多肽、DNA等生物大分子的固定,制备过程不需复 杂的反应及有机溶剂, 对生物活性几乎没有影响,因而生物素化壳聚糖膜在医药工业及生 物传感器等方面,均有潜在的价值; ③应用载酶(HRP)壳聚糖膜,与化学发光反应相 结合,可对生物样品中的微量H2O2进行快速、灵敏检测。为构建生物体内H2O2自由 基生物传感器打下基础。

    国家自然科学基金资助项目(No.39990570)

    方华丰,男,1969年生,博士研究生。
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     通信联络人

    参 考 文 献

    1,Ziegler C, Gopel W .Biosensor development. Curr Opin Chem Biol, 1998,2:585

    2,Wilchek M, Bayer E A. The avidin-biotin comples in bioanalytical applications. Anal Biochem,1988,171:1

    3,方华丰,周宜开. 生物素-亲和素系统在生物传感器中的应用.化学传感器,1997,17:177

    4,Barbara K, Maciej L,Wieslawa Z. Urease immobilized on chitosan membrane: preparation and properties. J chen Tech Biotechnol, 1990,48:337
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    5,袁津玮, 周宜开, 孙雅量等.应用化学发光自显影技术检测甲型肝炎病毒和 人IgM. 同济医科大学学报,1997,26(5): 362

    6,Amiji M M. Permeability and blood compatibility properties of chitosan-poly(ethylene oxide) blend membranes for haemodialysis. Biomaterials,1995,16:593

    7,梁 雁,林汉华,袁津玮等.化学发光法测定辣根过氧化物酶浓度的实验条件探 讨.同济医科大学学报,1998,27(6):445

    8,Bibjanna C,Boris C, Reith R et al. Effect of oxygen abstraction on the peroxidase-luminol-perborate system: relevance to the HRP enhanced che miluminescence mechanism. J Biolumin Chemilumin,1994,9:273

    (1999-07-12 收稿), http://www.100md.com