钙离子拮抗剂对大鼠局灶性脑缺血环氧酶-2的影响
作者：龙洁 张在强 路敦跃
单位：(首都医科大学附属北京天坛医院神经内科)
关键词：脑缺血；环氧酶-2；钙离子拮抗剂
首都医科大学学报000312 提要：为观察钙离子拮抗剂对环氧酶-2(COX-2)表达的影响及探讨COX-2在缺血损伤过程中的作用，应用免疫组化方法，观察脑缺血模型大鼠缺血和尼莫通干预时环氧酶-2蛋白的表达。结果：2组的假手术亚组、缺血1 h和4 h亚组均无阳性染色细胞，缺血12 h后，开始出现阳性染色细胞。尼莫通组的阳性着色细胞数显著高于单纯缺血组，分别为：缺血12 h 56±11/mm2与45±18/mm2(P<0.05)；缺血24 h 117±16/mm2与69±14/mm2(P<0.01)；缺血48 h 81±14/mm2与41±13/mm2(P<0.01)。阳性染色仅见于梗死周围区形态完整的神经元。尼莫通组的脑梗死面积[(28.308±3.959)mm2]显著小于对照组[(46.780±6.167)mm2,P<0.01]。提示：钙离子拮抗剂可有效减轻缺血性脑损伤，在梗死周围区COX-2延迟表达以及钙离子拮抗剂增加其表达，提示COX-2存在抗缺血损伤的作用。
, 百拇医药
中图分类号：R742； R364.1+2
Effect of Calcium Channel Blocker on
the Expression of Cyclooxygenase-2
in Rats Focal Cerebral Ischemia
Long Jie，Zhang Zaiqiang，Lu Dunyue
(Department of Neurology, Tiantan Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract: To explore the potential impact of COX-2 on cerebral ischemic injurious mechanism,the present studies examined the influence of calcium channel blocker on the expression of COX-2,which is the key enzyme in arachidonic acid metabolism. The model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) and immunohistochemistry staining were used to compare the expression of COX-2 protein in cerebral ischemic group with that in nimotop treatment group. There were no immunochemistry positive staining cells found among either the sham operation subgroup or the subgroup after MCAO for 1 and 4 h; however, positive staining cell began to acumulate after MCAO for 12 h. The positive cells in nimotop group were significantly higher than that in group without intervention: 12 h subgroup 56±11/mm2 vs 45±18/mm2( P<0.05); 24 h subgroup 117±16/mm2 vs 69±14/mm2( P<0.01); 48 h subgroup 81±14/mm2 vs 41±13/mm2( P<0.01). The positive staining only occurred in intact neurons surrounding the core of the infarction. The infarcted area in nimotop group were significantly less than that in group of MCAO for 24 h[(28.308±3.959)mm2 vs (46.780±6.167)mm2, P<0,01). It indicated that Calcium channel blocker can effectively ameliorate experimental cerebral ischemic injury. The characteristics of delayed expression of COX-2 surrounding the core of infarct and the up-regulation of COX-2 by calcium channel blocker, suggested that COX-2 may play a active role in the protective mechanism after ischemic cerebral injury.
, 百拇医药
Key words: cerebral ischemia; cyclooxygenase-2; calcium channel blocker
脑缺血后细胞内钙超载，可启动花生四烯酸转化为前列腺素的反应，介导神经元损伤。该反应的限速酶为环氧化酶(COX-2)。尼莫通为1种钙通道阻断剂，具有脑保护作用。我们于1998年1～6月，用免疫组织化学方法观察了大鼠脑缺血不同时期COX-2表达水平的动态变化，以及钙离子拮抗剂对COX-2表达水平的影响。
1 材料和方法
实验动物：Wistar雄性大鼠72只，体质量250～300 g，由中国医科院动物研究所提供。
大鼠脑缺血模型制作：参照Koizumi线栓法[1]，略改进。栓线用直径0.22 mm尼龙鱼线，头端0.5 cm膨大(直径0.25～0.28 mm)。栓线从颈外动脉与颈总动脉分叉处进线约2 cm遇阻即止。全部大鼠均栓塞右侧大脑中动脉。假手术组栓线进入1.5 cm,术后24 h取材。模型成功的标志为：手术麻醉清醒后，大鼠左侧偏瘫，左下肢伸直，站立不稳，向一侧转圈。对所有大鼠进行编号,按随机数字表将大鼠随机分为2组：缺血组(36只)和缺血+尼莫通治疗组(简称尼莫通组，36只)。每组再分为6个配对的亚组，分别为假手术亚组、缺血1、4、12、24及48 h亚组，每亚组6只。尼莫通组：缺血后即刻腹腔注射尼莫通(Bayer公司生产)1 mg/kg，于各自相应的时间点断头取脑。统一采用尾壳核平面脑切片(视神经末端冠状切面)作为观察对象[2]。
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COX-2抗体(山羊抗鼠IgG, Santa Cruz公司)，稀释度1∶100。二抗生物素化兔抗山羊IgG(Santa cruz公司)，抗体稀释度为1∶100。
免疫组化染色：标本组织常规脱水、透明、石蜡包埋，切片厚5 μm，采用免疫组化ABC法染色，二氨基联苯胺显色系统显色。流水终止反应后苏木素液复染，盐酸乙醇分化、清水返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片观察。应用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统对COX-2染色阳性细胞进行记数。
另取10只Wistar大鼠，分为尼莫通治疗组和对照组(各5只)，均于缺血24 h后断头取脑，TTC染色，统一观察尾壳核平面,采用求积仪计算梗死面积。
数据处理：采用SYSTAT统计软件包，利用t检验、方差分析对数据进行处理。
2 结果
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2.1 尼莫通对脑梗死面积的影响
尼莫通治疗组脑梗死面积为(28.308±3.959) mm2，显著低于对照组的(46.780±6.167) mm2(P<0.01)。
2.2 尼莫通对COX-2表达水平的影响
2个假手术亚组左侧大脑组织缺血1 h和4 h均未见COX-2阳性染色细胞。缺血组：缺血12 h右额皮质Ⅰ、Ⅱ区、扣带皮质及灰被可见浅棕黄染色细胞；缺血24 h，该区神经元染色密度加深；缺血48 h，仅右侧扣带皮质中细胞形态完整的神经元呈现棕黄着色。尼莫通组：在额皮质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区、扣带皮质、灰被以及尾壳核内侧区均出现浓重的棕黄染色。尼莫通组与缺血组阳性细胞计数比较：缺血12 h亚组分别为56±11/mm2和45±18/mm2(P<0.05)；缺血24 h亚组分别为117±16/mm2与69±14/mm2(P<0.01)；缺血48 h亚组分别为81±14/mm2与41±13/mm2(P<0.01)(图1、2)。
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图1 单纯缺血组24 h半暗带神经元COX-2蛋白的表达 抗COX-2免疫组化染色 ×400
图2 尼莫通组缺血24 h半暗带神经元COX-2蛋白的表达 示蛋白表达显著增高，抗COX-2免疫组化染色 ×400
3 讨论
本研究表明COX-2在缺血12 h即有表达，24 h达到高峰，48 h后下降，而尼莫通可显著增加COX-2的表达水平及范围。缺血早期基因可能通过激动蛋白(AP1)结合活性增加，从而激活一系列后期效应基因，后者具有抗细胞内损伤和增强修复机能等功能[3]。COX-2基因的启动子区域存在转录因子AP1结合序列，可调控COX-2基因的转录速度和水平[4]。脑缺血后COX-2延迟表达，提示该基因可能是后期反应基因。本实验发现COX-2主要由梗死周围区形态完整的神经细胞表达。这提示COX-2蛋白可能参与神经细胞抗缺血损伤的过程。脑缺血时磷脂酶A2激活，分解膜磷脂产生大量花生四烯酸，后者又产生前列腺素和血栓烷素，同时产生大量氧自由基。COX为该反应的关键酶，因而它为1种重要的损伤因子。但最近的研究发现COX-2可能存在细胞保护作用。Tsujii发现[5]，通过遗传工程技术过度表达COX-2 mRNA的大鼠小肠上皮细胞出现高水平的BCL-2蛋白表达，该细胞对诱导细胞凋亡的环境条件具有较高的耐受性。Von-knethen也观察到COX-2可阻止一氧化氮启动的细胞凋亡[6]。其保护作用的机制可能是通过产生前列腺素类，尤其是PGE2，提高靶细胞内cAMP水平，从而抑制细胞凋亡。因此COX-2既有促损伤作用，又有抗细胞凋亡作用。推测COX-2蛋白在缺血的病理生理过程中也可能发挥双向作用。究竟是起促凋亡还是抗凋亡作用，可能取决于PGE2的进一步代谢，以及各种前列腺素受体在特定状况和细胞类型时的表达水平。
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脑缺血后给尼莫通可显著性增加神经细胞表达COX-2，但作用途径尚不明确，推测与尼莫通扩张脑血管，增加血氧供应，促进细胞存活，有利于抗缺血损伤性蛋白的表达有关。本实验证实尼莫通是一种神经保护剂。过去认为这种作用是通过阻断钙内流、防止细胞内钙超载实现的。本实验结果提示尼莫通还可能通过增加一些后期反应基因如COX-2的表达，发挥其抗缺血损伤的作用。
北京市自然科学基金资助项目(7982022)
参考文献
1，Koizumi J,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema:1.A new experimental model of cerebral embolism in rat in which recirculation can be introduced in the ischemic area.Jpn J Stroke,1986,8:1～8
, http://www.100md.com
2，包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.北京:人民卫生出版社,1991.22～24
3，Akins P T,Liu P K,Hsu C Y.Immediate early expression in response to cerebral ischemia-friend or foe? Stroke,1996,27:1682
4，Kosaka T A,Miyata H,Ihara S,et al.Characterization of the human gene encoding prostaglandin-endoperoxide synthase 2.Eur J Biochem,1994，221:889～897
5，Tsujii M, Dubois R N.Alteration in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpression prostaglandin endoperoxide synthase 2.Cell,1995,83:493～501
6，Von-Knethen A, Brune B. Cyclooxygenase-2: An essential regulator of NO-mediated apoptosis.FASEB J,1997，11(11):887～895
收稿日期：1999-10-22, http://www.100md.com
单位：(首都医科大学附属北京天坛医院神经内科)
关键词：脑缺血；环氧酶-2；钙离子拮抗剂
首都医科大学学报000312 提要：为观察钙离子拮抗剂对环氧酶-2(COX-2)表达的影响及探讨COX-2在缺血损伤过程中的作用，应用免疫组化方法，观察脑缺血模型大鼠缺血和尼莫通干预时环氧酶-2蛋白的表达。结果：2组的假手术亚组、缺血1 h和4 h亚组均无阳性染色细胞，缺血12 h后，开始出现阳性染色细胞。尼莫通组的阳性着色细胞数显著高于单纯缺血组，分别为：缺血12 h 56±11/mm2与45±18/mm2(P<0.05)；缺血24 h 117±16/mm2与69±14/mm2(P<0.01)；缺血48 h 81±14/mm2与41±13/mm2(P<0.01)。阳性染色仅见于梗死周围区形态完整的神经元。尼莫通组的脑梗死面积[(28.308±3.959)mm2]显著小于对照组[(46.780±6.167)mm2,P<0.01]。提示：钙离子拮抗剂可有效减轻缺血性脑损伤，在梗死周围区COX-2延迟表达以及钙离子拮抗剂增加其表达，提示COX-2存在抗缺血损伤的作用。
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中图分类号：R742； R364.1+2
Effect of Calcium Channel Blocker on
the Expression of Cyclooxygenase-2
in Rats Focal Cerebral Ischemia
Long Jie，Zhang Zaiqiang，Lu Dunyue
(Department of Neurology, Tiantan Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract: To explore the potential impact of COX-2 on cerebral ischemic injurious mechanism,the present studies examined the influence of calcium channel blocker on the expression of COX-2,which is the key enzyme in arachidonic acid metabolism. The model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) and immunohistochemistry staining were used to compare the expression of COX-2 protein in cerebral ischemic group with that in nimotop treatment group. There were no immunochemistry positive staining cells found among either the sham operation subgroup or the subgroup after MCAO for 1 and 4 h; however, positive staining cell began to acumulate after MCAO for 12 h. The positive cells in nimotop group were significantly higher than that in group without intervention: 12 h subgroup 56±11/mm2 vs 45±18/mm2( P<0.05); 24 h subgroup 117±16/mm2 vs 69±14/mm2( P<0.01); 48 h subgroup 81±14/mm2 vs 41±13/mm2( P<0.01). The positive staining only occurred in intact neurons surrounding the core of the infarction. The infarcted area in nimotop group were significantly less than that in group of MCAO for 24 h[(28.308±3.959)mm2 vs (46.780±6.167)mm2, P<0,01). It indicated that Calcium channel blocker can effectively ameliorate experimental cerebral ischemic injury. The characteristics of delayed expression of COX-2 surrounding the core of infarct and the up-regulation of COX-2 by calcium channel blocker, suggested that COX-2 may play a active role in the protective mechanism after ischemic cerebral injury.
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Key words: cerebral ischemia; cyclooxygenase-2; calcium channel blocker
脑缺血后细胞内钙超载，可启动花生四烯酸转化为前列腺素的反应，介导神经元损伤。该反应的限速酶为环氧化酶(COX-2)。尼莫通为1种钙通道阻断剂，具有脑保护作用。我们于1998年1～6月，用免疫组织化学方法观察了大鼠脑缺血不同时期COX-2表达水平的动态变化，以及钙离子拮抗剂对COX-2表达水平的影响。
1 材料和方法
实验动物：Wistar雄性大鼠72只，体质量250～300 g，由中国医科院动物研究所提供。
大鼠脑缺血模型制作：参照Koizumi线栓法[1]，略改进。栓线用直径0.22 mm尼龙鱼线，头端0.5 cm膨大(直径0.25～0.28 mm)。栓线从颈外动脉与颈总动脉分叉处进线约2 cm遇阻即止。全部大鼠均栓塞右侧大脑中动脉。假手术组栓线进入1.5 cm,术后24 h取材。模型成功的标志为：手术麻醉清醒后，大鼠左侧偏瘫，左下肢伸直，站立不稳，向一侧转圈。对所有大鼠进行编号,按随机数字表将大鼠随机分为2组：缺血组(36只)和缺血+尼莫通治疗组(简称尼莫通组，36只)。每组再分为6个配对的亚组，分别为假手术亚组、缺血1、4、12、24及48 h亚组，每亚组6只。尼莫通组：缺血后即刻腹腔注射尼莫通(Bayer公司生产)1 mg/kg，于各自相应的时间点断头取脑。统一采用尾壳核平面脑切片(视神经末端冠状切面)作为观察对象[2]。
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COX-2抗体(山羊抗鼠IgG, Santa Cruz公司)，稀释度1∶100。二抗生物素化兔抗山羊IgG(Santa cruz公司)，抗体稀释度为1∶100。
免疫组化染色：标本组织常规脱水、透明、石蜡包埋，切片厚5 μm，采用免疫组化ABC法染色，二氨基联苯胺显色系统显色。流水终止反应后苏木素液复染，盐酸乙醇分化、清水返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片观察。应用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统对COX-2染色阳性细胞进行记数。
另取10只Wistar大鼠，分为尼莫通治疗组和对照组(各5只)，均于缺血24 h后断头取脑，TTC染色，统一观察尾壳核平面,采用求积仪计算梗死面积。
数据处理：采用SYSTAT统计软件包，利用t检验、方差分析对数据进行处理。
2 结果
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2.1 尼莫通对脑梗死面积的影响
尼莫通治疗组脑梗死面积为(28.308±3.959) mm2，显著低于对照组的(46.780±6.167) mm2(P<0.01)。
2.2 尼莫通对COX-2表达水平的影响
2个假手术亚组左侧大脑组织缺血1 h和4 h均未见COX-2阳性染色细胞。缺血组：缺血12 h右额皮质Ⅰ、Ⅱ区、扣带皮质及灰被可见浅棕黄染色细胞；缺血24 h，该区神经元染色密度加深；缺血48 h，仅右侧扣带皮质中细胞形态完整的神经元呈现棕黄着色。尼莫通组：在额皮质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区、扣带皮质、灰被以及尾壳核内侧区均出现浓重的棕黄染色。尼莫通组与缺血组阳性细胞计数比较：缺血12 h亚组分别为56±11/mm2和45±18/mm2(P<0.05)；缺血24 h亚组分别为117±16/mm2与69±14/mm2(P<0.01)；缺血48 h亚组分别为81±14/mm2与41±13/mm2(P<0.01)(图1、2)。
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图1 单纯缺血组24 h半暗带神经元COX-2蛋白的表达 抗COX-2免疫组化染色 ×400
图2 尼莫通组缺血24 h半暗带神经元COX-2蛋白的表达 示蛋白表达显著增高，抗COX-2免疫组化染色 ×400
3 讨论
本研究表明COX-2在缺血12 h即有表达，24 h达到高峰，48 h后下降，而尼莫通可显著增加COX-2的表达水平及范围。缺血早期基因可能通过激动蛋白(AP1)结合活性增加，从而激活一系列后期效应基因，后者具有抗细胞内损伤和增强修复机能等功能[3]。COX-2基因的启动子区域存在转录因子AP1结合序列，可调控COX-2基因的转录速度和水平[4]。脑缺血后COX-2延迟表达，提示该基因可能是后期反应基因。本实验发现COX-2主要由梗死周围区形态完整的神经细胞表达。这提示COX-2蛋白可能参与神经细胞抗缺血损伤的过程。脑缺血时磷脂酶A2激活，分解膜磷脂产生大量花生四烯酸，后者又产生前列腺素和血栓烷素，同时产生大量氧自由基。COX为该反应的关键酶，因而它为1种重要的损伤因子。但最近的研究发现COX-2可能存在细胞保护作用。Tsujii发现[5]，通过遗传工程技术过度表达COX-2 mRNA的大鼠小肠上皮细胞出现高水平的BCL-2蛋白表达，该细胞对诱导细胞凋亡的环境条件具有较高的耐受性。Von-knethen也观察到COX-2可阻止一氧化氮启动的细胞凋亡[6]。其保护作用的机制可能是通过产生前列腺素类，尤其是PGE2，提高靶细胞内cAMP水平，从而抑制细胞凋亡。因此COX-2既有促损伤作用，又有抗细胞凋亡作用。推测COX-2蛋白在缺血的病理生理过程中也可能发挥双向作用。究竟是起促凋亡还是抗凋亡作用，可能取决于PGE2的进一步代谢，以及各种前列腺素受体在特定状况和细胞类型时的表达水平。
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脑缺血后给尼莫通可显著性增加神经细胞表达COX-2，但作用途径尚不明确，推测与尼莫通扩张脑血管，增加血氧供应，促进细胞存活，有利于抗缺血损伤性蛋白的表达有关。本实验证实尼莫通是一种神经保护剂。过去认为这种作用是通过阻断钙内流、防止细胞内钙超载实现的。本实验结果提示尼莫通还可能通过增加一些后期反应基因如COX-2的表达，发挥其抗缺血损伤的作用。
北京市自然科学基金资助项目(7982022)
参考文献
1，Koizumi J,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema:1.A new experimental model of cerebral embolism in rat in which recirculation can be introduced in the ischemic area.Jpn J Stroke,1986,8:1～8
, http://www.100md.com
2，包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.北京:人民卫生出版社,1991.22～24
3，Akins P T,Liu P K,Hsu C Y.Immediate early expression in response to cerebral ischemia-friend or foe? Stroke,1996,27:1682
4，Kosaka T A,Miyata H,Ihara S,et al.Characterization of the human gene encoding prostaglandin-endoperoxide synthase 2.Eur J Biochem,1994，221:889～897
5，Tsujii M, Dubois R N.Alteration in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpression prostaglandin endoperoxide synthase 2.Cell,1995,83:493～501
6，Von-Knethen A, Brune B. Cyclooxygenase-2: An essential regulator of NO-mediated apoptosis.FASEB J,1997，11(11):887～895
收稿日期：1999-10-22, http://www.100md.com