牛嗜铬细胞体外培养及其分泌多巴胺的测定
作者：吕捷 张进禄 赵春礼 段春礼 徐群渊
单位：(首都医科大学北京神经科学研究所)
关键词：嗜铬细胞；牛；细胞培养；多巴胺
首都医科大学学报000301 提要：为给肾上腺髓质细胞移植治疗帕金森病提供理论依据，观察正常体外培养和冷冻复苏后牛肾上腺嗜铬细胞的形态变化，并检测培养液中的多巴胺含量。结果：悬浮培养嗜铬细胞在培养液中集聚成团，始终保持圆形，并分泌多巴胺，在冷冻复苏后仍存活；单层贴壁培养嗜铬细胞于贴壁后开始变形，伸出短的突起，但于1周后开始退化；体外培养嗜铬细胞分泌多巴胺在5～6 d达高峰。结果提示：肾上腺嗜铬细胞可作为脑内移植治疗帕金森病的细胞来源。
中图分类号：Q7-33； R338
Culture of Bovine Chromaffin Cells
, http://www.100md.com
and Determination of Dopamine Secreted
Lü Jie，Zhang Jinlu，Zhao Chunli，Duan Chunli，Xu Qunyuan
(Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences)
Abstract: The morphological changes of cultured bovine chromaffin cells were observed and the dopamine secreted was determined by HPLC to explore the feasibility of gene therapy with adrenal medulla cell transplantation. Results: The chromaffin cells in suspension culture, aggregated in round shape all the time and could secrete dopamine, and were still alive after resuscitation from cryopreservation; the adhesion cells showed round shape first, then stretched out short processes, turned in to shapes as triangle, fusiform, and polygon et al and restored to round shape after a week of culture. The HPLC results showed that the dopamine content arrived at the peak at about 5～6 days of culture. Adrenal chromaffin cell is a valuable source that can be used for gene therapy.
, 百拇医药
Key words: chromaffin cell; bovine; culture; dopamine
因肾上腺髓质细胞具有分泌多巴胺的功能，而被用来移植治疗帕金森病[1]。如何提高它在移植部位的存活及活跃时间是问题的关键。本研究观察正常体外培养及冷冻复苏后的牛肾上腺嗜铬细胞，并测定其分泌多巴胺量。
1 材料和方法
取新鲜牛肾上腺，经缓冲液冲洗后，以0.1%～0.2%Ⅰ型胶原酶逆静脉灌注，37 ℃消化30 min。取出髓质，经300目过筛分离，Percoll密度梯度离心纯化。置培养瓶中，以含10%FCS(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)悬浮培养，或接种于覆有Matrigel胶的培养板中培养，或液氮冻存1月后复苏培养，细胞量1×105 mL-1。每3 d取培养液以高效液相电化学法检测多巴胺含量。
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2 结果和讨论
悬浮培养的嗜铬细胞在培养板中集聚成团，始终保持圆形(图1)，并可分泌多巴胺，在冷冻复苏后仍可存活。单层贴壁培养的嗜铬细胞于贴壁后开始变形，伸出短的突起，呈三角形、梭形或多边形等多种形态(图2、3)，但于1周后开始退化，突起减少(图4)。
图1 悬浮培养9 d牛肾上腺嗜铬细胞 600× 标尺=25 μm(下同)
图2 贴壁培养2 d牛肾上腺嗜铬细胞
图3 贴壁培养4 d牛肾上腺嗜铬细胞
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图4 贴壁培养14 d牛肾上腺嗜铬细胞
高效液相检测结果显示，体外培养嗜铬细胞分泌多巴胺在5～6 d达高峰(图5)。
图5 体外培养牛嗜铬细胞多巴胺分泌量的变化
本实验结果表明，牛嗜铬细胞在最初1周内由贴壁、突起形成达到全盛，此后突起减退、消失，细胞恢复圆形，维持存活状态可达1个月。多巴胺分泌测定表明，其在突起形成时分泌量最高。结果证明嗜铬细胞可以储备并大量长时间存活以作移植之用。细胞贴壁及突起形成是细胞为适应新环境而设法存活的过程，也是细胞旺盛代谢的过程。细胞获得存活进入稳态后，代谢活动减弱，以维持尽可能长久的生存。体内的嗜铬细胞要受到神经内分泌环境的调节。许多实验证实，它改善病人运动症状的时间非常短暂[2]。这可能是因为细胞进入稳态后，处在惰性静止期，失去活性状态下的功能，从而多巴胺分泌减少，神经营养因子合成也减少。尽管嗜铬细胞与移植部位的受体细胞相互接触，不相排斥，但它是构成神经功能系统的一部分还是孤立存活还未知。由此可见，未建立充分有效的细胞联系可能影响移植的嗜铬细胞长时间发挥作用。体外培养虽然不等同于体内情况，但也能说明一些问题，尤其是我们的培养结果与移植细胞的结果非常相似。因此提出将嗜铬细胞与神经细胞共同培养，观察其形态变化及各种递质、营养因子及受体表达的变化，可以作为下一步进行的工作。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金国际合作研究项目 、北京市跨世纪人才工程资助项目
参考文献
1，Freed W J, Poltorak M, Becker J B. Intracerebral adrenal medulla grafts: A review. Exp Neurol, 1990,110(2):139～166
2，Bohn M C, Cupit L, Marciano F, et al. Adrenal medulla grafts enhance recovery of striatal dopaminergic fibers. Science,1987,237(4817):913～916
收稿日期：2000-01-25, http://www.100md.com
单位：(首都医科大学北京神经科学研究所)
关键词：嗜铬细胞；牛；细胞培养；多巴胺
首都医科大学学报000301 提要：为给肾上腺髓质细胞移植治疗帕金森病提供理论依据，观察正常体外培养和冷冻复苏后牛肾上腺嗜铬细胞的形态变化，并检测培养液中的多巴胺含量。结果：悬浮培养嗜铬细胞在培养液中集聚成团，始终保持圆形，并分泌多巴胺，在冷冻复苏后仍存活；单层贴壁培养嗜铬细胞于贴壁后开始变形，伸出短的突起，但于1周后开始退化；体外培养嗜铬细胞分泌多巴胺在5～6 d达高峰。结果提示：肾上腺嗜铬细胞可作为脑内移植治疗帕金森病的细胞来源。
中图分类号：Q7-33； R338
Culture of Bovine Chromaffin Cells
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and Determination of Dopamine Secreted
Lü Jie，Zhang Jinlu，Zhao Chunli，Duan Chunli，Xu Qunyuan
(Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences)
Abstract: The morphological changes of cultured bovine chromaffin cells were observed and the dopamine secreted was determined by HPLC to explore the feasibility of gene therapy with adrenal medulla cell transplantation. Results: The chromaffin cells in suspension culture, aggregated in round shape all the time and could secrete dopamine, and were still alive after resuscitation from cryopreservation; the adhesion cells showed round shape first, then stretched out short processes, turned in to shapes as triangle, fusiform, and polygon et al and restored to round shape after a week of culture. The HPLC results showed that the dopamine content arrived at the peak at about 5～6 days of culture. Adrenal chromaffin cell is a valuable source that can be used for gene therapy.
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Key words: chromaffin cell; bovine; culture; dopamine
因肾上腺髓质细胞具有分泌多巴胺的功能，而被用来移植治疗帕金森病[1]。如何提高它在移植部位的存活及活跃时间是问题的关键。本研究观察正常体外培养及冷冻复苏后的牛肾上腺嗜铬细胞，并测定其分泌多巴胺量。
1 材料和方法
取新鲜牛肾上腺，经缓冲液冲洗后，以0.1%～0.2%Ⅰ型胶原酶逆静脉灌注，37 ℃消化30 min。取出髓质，经300目过筛分离，Percoll密度梯度离心纯化。置培养瓶中，以含10%FCS(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)悬浮培养，或接种于覆有Matrigel胶的培养板中培养，或液氮冻存1月后复苏培养，细胞量1×105 mL-1。每3 d取培养液以高效液相电化学法检测多巴胺含量。
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2 结果和讨论
悬浮培养的嗜铬细胞在培养板中集聚成团，始终保持圆形(图1)，并可分泌多巴胺，在冷冻复苏后仍可存活。单层贴壁培养的嗜铬细胞于贴壁后开始变形，伸出短的突起，呈三角形、梭形或多边形等多种形态(图2、3)，但于1周后开始退化，突起减少(图4)。
图1 悬浮培养9 d牛肾上腺嗜铬细胞 600× 标尺=25 μm(下同)
图2 贴壁培养2 d牛肾上腺嗜铬细胞
图3 贴壁培养4 d牛肾上腺嗜铬细胞
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图4 贴壁培养14 d牛肾上腺嗜铬细胞
高效液相检测结果显示，体外培养嗜铬细胞分泌多巴胺在5～6 d达高峰(图5)。
图5 体外培养牛嗜铬细胞多巴胺分泌量的变化
本实验结果表明，牛嗜铬细胞在最初1周内由贴壁、突起形成达到全盛，此后突起减退、消失，细胞恢复圆形，维持存活状态可达1个月。多巴胺分泌测定表明，其在突起形成时分泌量最高。结果证明嗜铬细胞可以储备并大量长时间存活以作移植之用。细胞贴壁及突起形成是细胞为适应新环境而设法存活的过程，也是细胞旺盛代谢的过程。细胞获得存活进入稳态后，代谢活动减弱，以维持尽可能长久的生存。体内的嗜铬细胞要受到神经内分泌环境的调节。许多实验证实，它改善病人运动症状的时间非常短暂[2]。这可能是因为细胞进入稳态后，处在惰性静止期，失去活性状态下的功能，从而多巴胺分泌减少，神经营养因子合成也减少。尽管嗜铬细胞与移植部位的受体细胞相互接触，不相排斥，但它是构成神经功能系统的一部分还是孤立存活还未知。由此可见，未建立充分有效的细胞联系可能影响移植的嗜铬细胞长时间发挥作用。体外培养虽然不等同于体内情况，但也能说明一些问题，尤其是我们的培养结果与移植细胞的结果非常相似。因此提出将嗜铬细胞与神经细胞共同培养，观察其形态变化及各种递质、营养因子及受体表达的变化，可以作为下一步进行的工作。
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国家自然科学基金国际合作研究项目 、北京市跨世纪人才工程资助项目
参考文献
1，Freed W J, Poltorak M, Becker J B. Intracerebral adrenal medulla grafts: A review. Exp Neurol, 1990,110(2):139～166
2，Bohn M C, Cupit L, Marciano F, et al. Adrenal medulla grafts enhance recovery of striatal dopaminergic fibers. Science,1987,237(4817):913～916
收稿日期：2000-01-25, http://www.100md.com