硒对大鼠肝细胞DNA损伤的体内体外研究
作者：余日安 陈学敏 鲁文清
单位：同济医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室, 武汉 430030
关键词：亚硒酸钠；DNA损伤；单细胞凝胶电泳
同济医科大学学报000308 摘要 应用单细胞凝胶电泳研究了一定剂量的亚硒酸 钠对离体和在体大鼠肝细胞DNA损伤的作用。结果表明：在2.185、4.375、8.750 、17.500、35.000 μmol/L的剂量条件下，除2.185 μmol/L的剂量 外，其余剂量的亚硒酸钠均可引起离体大鼠肝细胞DNA损伤。5、10、20 μ mol/kg的亚硒酸钠也可引起在体大鼠肝细胞DNA损伤。亚硒酸钠引起的离体和在体大鼠肝细 胞DNA损伤均存在明显的剂量-反应关系。研究结果提示，一定剂量的亚硒酸钠能引起离 体和在体大鼠肝细胞DNA损伤。
中图法分类号 R599.1, Q523
, 百拇医药
The Effects of Selenium on Hepatocellula r DNA Damage in Rat
Yu Ri′an Chen Xuemin Lu Wenqing
(Department of Environmental Health, School of Public H ealth, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract The effects of sodium selenite (SS) on hepatocellular DNA damage of rats were studied in vivo and in vitro by using single cel l gel-electrophoresis or Comet assay. The results showed that at the concentra tions of 4.375 μmol/L, 8.750 μmol/L, 17.500 μmol/L and 35.000 μmol/L, SS could induce hepatocellular DNA damage of rat in vitro, and at the doses of 5 μmol/kg, 10 μmol/kg, 20 μmol/kg, SS could cause hepatocellular DNA damage of rat in vivo respectively. The in vivo and in vitro findings also re vealed an obvious dose-response relationship between the rate of Comet cells an d the doses of SS. It was suggested that certain doses of SS could induce hepato cellular DNA damage in vivo and in vitro.
, 百拇医药
Key words selenium; DNA damage; single cell gel-electrophore sis
硒是机体必需的微量元素，但对机体又呈现双向性的作用，在一定剂量下，对机体表现为营 养作用，超过或低于某一剂量，则对机体产生有害作用[1]。硒在生命科学中与机 体健康、疾病的关系一直是硒的研究所面临的主要问题。作者曾应用单细胞凝胶电泳研究发 现8.750、17.500、35.000 μmol/L的Na2SeO3可以引起离体大鼠肝细胞DNA单链断裂 ，出现拖尾的慧星细胞[2] 。为了深入研究硒对DNA损伤的作用, 本实验应用单细 胞凝胶电泳, 进一步研究了硒对离体和在体大鼠肝细胞DNA损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 肝细胞悬液制备
, 百拇医药
按文献方法制备肝细胞悬液[3]。所得细胞用台盼蓝染色，存活率平均不低于90 %。
1.2 体外实验分组
用400 μl肝细胞悬液，600 μl PBS建立1 ml反应体系。在反应体系中加入Na2SeO3 至所需终浓度，对照组用PBS代替受试物。共建立6个反应体系，在染毒反应体系中加入Na 2SeO3 的终浓度分别为：2.185、4.375、8.750、17.500、35.000 μmol/L。37 ℃ 水浴箱温浴2 h，离心去上清，将细胞悬于100 μl PBS中。
1.3 单细胞凝胶电泳
按文献[3]方法。电泳后取出玻片，用0.4 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中 和3次，去掉多余液体。用0.02%吖啶橙75 μl染色，盖上盖玻片。在荧光显微镜下，观察 计数100个细胞，根据拖尾中DNA的量占细胞总DNA的比例，将DNA损伤程度分为5级 。0级：无损伤(正常细胞)，<5%；1级：低度损伤，5%～20%；2级：中度损伤，20%～40 %；3级：高度损伤，40%～95%；4 级：重度损伤，>95%。
, 百拇医药
1.4 体内实验分组
实验用大鼠由同济医科大学实验动物学部提供，将实验动物随机分组，每组动物数为5只 。腹腔注射染毒。染毒1次。染毒后48 h 处死动物，取出肝脏，制备肝细胞悬液， 按前述 方法进行单细胞凝胶电泳。各组染毒剂量为：对 照组，腹脏注射等量PBS；低剂量硒组，Na2SeO3 5 μmol/kg；中剂量硒组，Na2SeO 3 10 μmol/kg；高剂量硒组，Na2SeO3 20 μmol/kg.
1.5 统计方法
组间比较用χ2检验，剂量反应关系用直线相关分析。
2 结果
2.1 Na2SeO3 对离体大鼠肝细胞DNA损伤的作用
, http://www.100md.com
2.185、4.375、8.750、17.500、35.000 μmol/L的Na2SeO3 引起的DNA损伤分级 计数结果见表1。 2.185 μmol/L的Na2SeO3 引起的DNA损伤与对照组比较，P>0. 05，4.375 μmol/L的Na2SeO3 引起的DNA损伤与对照组比较，P<0.05，而8.750 、17.500、35.000 μmol/L的Na2SeO3 引起的DNA损伤与对照组比较，均为P<0. 01。随着剂量增加，DNA损伤程度加重。
表1 Na2SeO3 对离体大鼠肝细胞DNA损伤实验结果 分组
计数细胞
(个)
, 百拇医药
DNA损伤程度分级
总损伤细胞
(%)
0
1
2
3
4
Na2SeO3(2.185 μmol/L)
100
86
14
, 百拇医药 0
0
0
14.00
Na2SeO3 (4.375 μmol/L)
100
78
10
11
1
0
22.00*
, 百拇医药
Na2SeO3 (8.750 μmol/L)
109
35
37
22
8
7
67.89**
Na2SeO3 (17.500 μmol/L)
107
19
, http://www.100md.com
23
20
30
15
82.24**
Na2SeO3 (35.000 μmol/L)
100
11
10
19
27
33
, 百拇医药
89.00**
对照组(0 μmol/L)
100
88
11
1
0
0
12.00
与对照组比较 * P<0.05， ** P<0.012.2 Na2SeO3对在体大鼠肝细胞DNA损伤的影响[ ST
, 百拇医药
5、10、20 μmol/kg的Na2SeO3及对照组的DNA损伤分级计数结果 见表2。3个剂量组的Na2SeO3引起的DNA损伤程度均较对照组严重，P<0.01。在3个 剂量组间 ，随剂量增加，DNA损伤严重的细胞数也增多，3组之间的差别具有显著性意义，P<0.0 1。
2.3 剂量-反应关系分析
以总损伤细胞百分率为纵坐标，Na2SeO3 的剂量为横坐标，剂量-反应关系曲线呈抛物 线型。将剂量换算成对数，计算直线相关系数。Na2SeO3 体外实验的直线相关系数为0 .956 2(P<0.01)，Na2SeO3 体内实验的直线相关系数为0.972 1，P<0.0 1。
, 百拇医药 表2 Na2SeO3对在体大鼠肝细胞DNA损伤实验结果 分组
计数细胞
(个)
DNA损伤程度分级
总损伤细胞
(%)
0
1
2
3
4
Na2SeO3(5 μmol/kg)
, 百拇医药
500
328
95
54
9
14
34.40**
Na2SeO3(10 μmol/kg)
500
126
165
92
, 百拇医药
54
63
74.80**
Na2SeO3(20 μmol/kg)
500
43
68
106
131
152
91.40**
对照组(0 μmol/kg)
, http://www.100md.com
500
455
35
7
3
0
9.00
与对照组比较 ** P<0.013 讨论
本研究应用单细胞凝胶电泳研究了Na2SeO3一定剂量时在离体和在体条件下对大鼠肝细 胞DNA损伤的影响。结果表明，在离体条件下，各剂量组除2.185 μmol/L Na2SeO3引 起的DNA损伤与对照组无显著差异外(P>0.05)，4.375、8.750、17.500、35.000 μmol/L的Na2SeO3引起的DNA损伤较对照组明显增高，并且存在剂量-反应关系。体内 染毒研究的结果也发现，5、 10、20 μmol/kg Na2SeO3 可引起大鼠肝细胞DNA损伤明 显增高，也存在明显的剂量-反应关系。
, http://www.100md.com
Garberg等人用SD大鼠肝细胞悬液和培养肝细胞研究Na2SeO3 对DNA损伤的作用，结果表 明10～50 μmol/L Na2SeO3可引起DNA损伤[4]，Wilson的实验室用L1210细胞 ，5 μmol/L Na2SeO3染毒24 h也观察到DNA单链断裂[5]。本实验结果不仅支 持了Garberg和Wilson等人的结论，而且与Lu等的报道也是一致的[6]。
至于Na2SeO3引起DNA单链断裂以及其遗传毒作用的机理，可能与硒化物形成活性氧 自由 基的能力有关。徐辉碧等人使用化学发光仪观察不同条件下Luminol的化学发光，当亚硒酸 盐(SeO32-)或还原态谷胱甘肽单独存在时，几乎没有化学发光产生，而当SeO 32-与GSH共存时，体系发光强度明显升高。在这一体系中据认为SeO32-起 催化剂作用，不断催化产生活性氧自由基[7]。Na2SeO3和GSH首先反应生成硒 代谷胱甘肽GSSeSG (selenodiglutathione)，GSSeSG可与O2、H2O2、ROOH发生氧化还 原反应，GSSeSG最终被氧化为SeO32-和GSSG，分 子 氧O2单电子还原为活性氧自由基[8，9]。如果产生的活性氧超过机体抗氧化能力 ，则导致 机体的脂质过氧化，其产物(ROOH, H2O2等)又将促进GSSeSG的氧化，可循环地导致机 体的氧化损伤。已经证实，由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧阴离子自由基可引起DNA 链断 裂，*OH攻击DNA分子中核糖部分也造成链断裂，自由基攻击胸腺嘧啶碱基所造成的损害经 修复酶切除也产生类似的单链断裂。DNA链断裂是活性氧引起的最常见的一种DNA损害[ 10]。
, http://www.100md.com
本文的研究结果表明Na2SeO3能引起DNA损伤，导致DNA单链断裂。尽管硒化合物的 毒性 与其形成活性氧的能力有关是近年来提出的一个引人注目的观点，但Na2SeO3引起的DNA 单链断裂与活性氧的关系尚缺乏直接的实验证据。
国家自然科学基金资助项目(No. 39670626)
余日安，男，1964年生，医学博士
参 考 文 献
1，Oldfield J E. The two faces of selenium. J Nutr, 1987, 117: 2002
2，余日安，陈学敏. 硒对大鼠肝细胞DNA损伤的研究. 环境与健康杂志,1998,15( 5):393
, 百拇医药
3，余日安，陈学敏. 镉对大鼠肝细胞DNA损伤作用的研究.中国公共卫生学报,199 8,17(2):106
4，Garberg P, Stahl A, Warholm M et al. Studies of the role of DNA fragmentation in elenium toxicity. Biochem Pharmacol ,1988, 37: 3401
5，Wilson A C, Thompson H J, Schedin P J. Effect of methylated forms of selenium on cell viability and the induction of DNA strand breakage. Biochem Pharmacol ,1992 , 43: 1137
6，Lu J, Jiang C, Kaeck M et al. Dissociation of the genotoxic and growth inhibitory effects of selenium. Biochem Pharmacol ,1995, 50: 213
, http://www.100md.com
7，徐辉碧, 冯志明, 程 驿. 硒化合物毒性的自由基机理. 华中理工大学学报, 1991, 19(1): 13
8，徐辉碧, 程 驿, 冯志明. 亚硒酸钠催化谷胱甘肽、过氧化氢产生超氧阴离子 的研究. 华中理工大学学报, 1991,19(1): 1
9，徐辉碧, 孙恩杰, 杨祥良. 硒的生物效应的活性氧自由基机理. 华中理工大学 学报, 1991,19(5): 533
10，张 铣, 刘毓谷主编. 毒理学. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合 出版社,1997.152～153
(1999-11-15 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室, 武汉 430030
关键词：亚硒酸钠；DNA损伤；单细胞凝胶电泳
同济医科大学学报000308 摘要 应用单细胞凝胶电泳研究了一定剂量的亚硒酸 钠对离体和在体大鼠肝细胞DNA损伤的作用。结果表明：在2.185、4.375、8.750 、17.500、35.000 μmol/L的剂量条件下，除2.185 μmol/L的剂量 外，其余剂量的亚硒酸钠均可引起离体大鼠肝细胞DNA损伤。5、10、20 μ mol/kg的亚硒酸钠也可引起在体大鼠肝细胞DNA损伤。亚硒酸钠引起的离体和在体大鼠肝细 胞DNA损伤均存在明显的剂量-反应关系。研究结果提示，一定剂量的亚硒酸钠能引起离 体和在体大鼠肝细胞DNA损伤。
中图法分类号 R599.1, Q523
, 百拇医药
The Effects of Selenium on Hepatocellula r DNA Damage in Rat
Yu Ri′an Chen Xuemin Lu Wenqing
(Department of Environmental Health, School of Public H ealth, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract The effects of sodium selenite (SS) on hepatocellular DNA damage of rats were studied in vivo and in vitro by using single cel l gel-electrophoresis or Comet assay. The results showed that at the concentra tions of 4.375 μmol/L, 8.750 μmol/L, 17.500 μmol/L and 35.000 μmol/L, SS could induce hepatocellular DNA damage of rat in vitro, and at the doses of 5 μmol/kg, 10 μmol/kg, 20 μmol/kg, SS could cause hepatocellular DNA damage of rat in vivo respectively. The in vivo and in vitro findings also re vealed an obvious dose-response relationship between the rate of Comet cells an d the doses of SS. It was suggested that certain doses of SS could induce hepato cellular DNA damage in vivo and in vitro.
, 百拇医药
Key words selenium; DNA damage; single cell gel-electrophore sis
硒是机体必需的微量元素，但对机体又呈现双向性的作用，在一定剂量下，对机体表现为营 养作用，超过或低于某一剂量，则对机体产生有害作用[1]。硒在生命科学中与机 体健康、疾病的关系一直是硒的研究所面临的主要问题。作者曾应用单细胞凝胶电泳研究发 现8.750、17.500、35.000 μmol/L的Na2SeO3可以引起离体大鼠肝细胞DNA单链断裂 ，出现拖尾的慧星细胞[2] 。为了深入研究硒对DNA损伤的作用, 本实验应用单细 胞凝胶电泳, 进一步研究了硒对离体和在体大鼠肝细胞DNA损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 肝细胞悬液制备
, 百拇医药
按文献方法制备肝细胞悬液[3]。所得细胞用台盼蓝染色，存活率平均不低于90 %。
1.2 体外实验分组
用400 μl肝细胞悬液，600 μl PBS建立1 ml反应体系。在反应体系中加入Na2SeO3 至所需终浓度，对照组用PBS代替受试物。共建立6个反应体系，在染毒反应体系中加入Na 2SeO3 的终浓度分别为：2.185、4.375、8.750、17.500、35.000 μmol/L。37 ℃ 水浴箱温浴2 h，离心去上清，将细胞悬于100 μl PBS中。
1.3 单细胞凝胶电泳
按文献[3]方法。电泳后取出玻片，用0.4 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中 和3次，去掉多余液体。用0.02%吖啶橙75 μl染色，盖上盖玻片。在荧光显微镜下，观察 计数100个细胞，根据拖尾中DNA的量占细胞总DNA的比例，将DNA损伤程度分为5级 。0级：无损伤(正常细胞)，<5%；1级：低度损伤，5%～20%；2级：中度损伤，20%～40 %；3级：高度损伤，40%～95%；4 级：重度损伤，>95%。
, 百拇医药
1.4 体内实验分组
实验用大鼠由同济医科大学实验动物学部提供，将实验动物随机分组，每组动物数为5只 。腹腔注射染毒。染毒1次。染毒后48 h 处死动物，取出肝脏，制备肝细胞悬液， 按前述 方法进行单细胞凝胶电泳。各组染毒剂量为：对 照组，腹脏注射等量PBS；低剂量硒组，Na2SeO3 5 μmol/kg；中剂量硒组，Na2SeO 3 10 μmol/kg；高剂量硒组，Na2SeO3 20 μmol/kg.
1.5 统计方法
组间比较用χ2检验，剂量反应关系用直线相关分析。
2 结果
2.1 Na2SeO3 对离体大鼠肝细胞DNA损伤的作用
, http://www.100md.com
2.185、4.375、8.750、17.500、35.000 μmol/L的Na2SeO3 引起的DNA损伤分级 计数结果见表1。 2.185 μmol/L的Na2SeO3 引起的DNA损伤与对照组比较，P>0. 05，4.375 μmol/L的Na2SeO3 引起的DNA损伤与对照组比较，P<0.05，而8.750 、17.500、35.000 μmol/L的Na2SeO3 引起的DNA损伤与对照组比较，均为P<0. 01。随着剂量增加，DNA损伤程度加重。
表1 Na2SeO3 对离体大鼠肝细胞DNA损伤实验结果 分组
计数细胞
(个)
, 百拇医药
DNA损伤程度分级
总损伤细胞
(%)
0
1
2
3
4
Na2SeO3(2.185 μmol/L)
100
86
14
, 百拇医药 0
0
0
14.00
Na2SeO3 (4.375 μmol/L)
100
78
10
11
1
0
22.00*
, 百拇医药
Na2SeO3 (8.750 μmol/L)
109
35
37
22
8
7
67.89**
Na2SeO3 (17.500 μmol/L)
107
19
, http://www.100md.com
23
20
30
15
82.24**
Na2SeO3 (35.000 μmol/L)
100
11
10
19
27
33
, 百拇医药
89.00**
对照组(0 μmol/L)
100
88
11
1
0
0
12.00
与对照组比较 * P<0.05， ** P<0.012.2 Na2SeO3对在体大鼠肝细胞DNA损伤的影响[ ST
, 百拇医药
5、10、20 μmol/kg的Na2SeO3及对照组的DNA损伤分级计数结果 见表2。3个剂量组的Na2SeO3引起的DNA损伤程度均较对照组严重，P<0.01。在3个 剂量组间 ，随剂量增加，DNA损伤严重的细胞数也增多，3组之间的差别具有显著性意义，P<0.0 1。
2.3 剂量-反应关系分析
以总损伤细胞百分率为纵坐标，Na2SeO3 的剂量为横坐标，剂量-反应关系曲线呈抛物 线型。将剂量换算成对数，计算直线相关系数。Na2SeO3 体外实验的直线相关系数为0 .956 2(P<0.01)，Na2SeO3 体内实验的直线相关系数为0.972 1，P<0.0 1。
, 百拇医药 表2 Na2SeO3对在体大鼠肝细胞DNA损伤实验结果 分组
计数细胞
(个)
DNA损伤程度分级
总损伤细胞
(%)
0
1
2
3
4
Na2SeO3(5 μmol/kg)
, 百拇医药
500
328
95
54
9
14
34.40**
Na2SeO3(10 μmol/kg)
500
126
165
92
, 百拇医药
54
63
74.80**
Na2SeO3(20 μmol/kg)
500
43
68
106
131
152
91.40**
对照组(0 μmol/kg)
, http://www.100md.com
500
455
35
7
3
0
9.00
与对照组比较 ** P<0.013 讨论
本研究应用单细胞凝胶电泳研究了Na2SeO3一定剂量时在离体和在体条件下对大鼠肝细 胞DNA损伤的影响。结果表明，在离体条件下，各剂量组除2.185 μmol/L Na2SeO3引 起的DNA损伤与对照组无显著差异外(P>0.05)，4.375、8.750、17.500、35.000 μmol/L的Na2SeO3引起的DNA损伤较对照组明显增高，并且存在剂量-反应关系。体内 染毒研究的结果也发现，5、 10、20 μmol/kg Na2SeO3 可引起大鼠肝细胞DNA损伤明 显增高，也存在明显的剂量-反应关系。
, http://www.100md.com
Garberg等人用SD大鼠肝细胞悬液和培养肝细胞研究Na2SeO3 对DNA损伤的作用，结果表 明10～50 μmol/L Na2SeO3可引起DNA损伤[4]，Wilson的实验室用L1210细胞 ，5 μmol/L Na2SeO3染毒24 h也观察到DNA单链断裂[5]。本实验结果不仅支 持了Garberg和Wilson等人的结论，而且与Lu等的报道也是一致的[6]。
至于Na2SeO3引起DNA单链断裂以及其遗传毒作用的机理，可能与硒化物形成活性氧 自由 基的能力有关。徐辉碧等人使用化学发光仪观察不同条件下Luminol的化学发光，当亚硒酸 盐(SeO32-)或还原态谷胱甘肽单独存在时，几乎没有化学发光产生，而当SeO 32-与GSH共存时，体系发光强度明显升高。在这一体系中据认为SeO32-起 催化剂作用，不断催化产生活性氧自由基[7]。Na2SeO3和GSH首先反应生成硒 代谷胱甘肽GSSeSG (selenodiglutathione)，GSSeSG可与O2、H2O2、ROOH发生氧化还 原反应，GSSeSG最终被氧化为SeO32-和GSSG，分 子 氧O2单电子还原为活性氧自由基[8，9]。如果产生的活性氧超过机体抗氧化能力 ，则导致 机体的脂质过氧化，其产物(ROOH, H2O2等)又将促进GSSeSG的氧化，可循环地导致机 体的氧化损伤。已经证实，由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧阴离子自由基可引起DNA 链断 裂，*OH攻击DNA分子中核糖部分也造成链断裂，自由基攻击胸腺嘧啶碱基所造成的损害经 修复酶切除也产生类似的单链断裂。DNA链断裂是活性氧引起的最常见的一种DNA损害[ 10]。
, http://www.100md.com
本文的研究结果表明Na2SeO3能引起DNA损伤，导致DNA单链断裂。尽管硒化合物的 毒性 与其形成活性氧的能力有关是近年来提出的一个引人注目的观点，但Na2SeO3引起的DNA 单链断裂与活性氧的关系尚缺乏直接的实验证据。
国家自然科学基金资助项目(No. 39670626)
余日安，男，1964年生，医学博士
参 考 文 献
1，Oldfield J E. The two faces of selenium. J Nutr, 1987, 117: 2002
2，余日安，陈学敏. 硒对大鼠肝细胞DNA损伤的研究. 环境与健康杂志,1998,15( 5):393
, 百拇医药
3，余日安，陈学敏. 镉对大鼠肝细胞DNA损伤作用的研究.中国公共卫生学报,199 8,17(2):106
4，Garberg P, Stahl A, Warholm M et al. Studies of the role of DNA fragmentation in elenium toxicity. Biochem Pharmacol ,1988, 37: 3401
5，Wilson A C, Thompson H J, Schedin P J. Effect of methylated forms of selenium on cell viability and the induction of DNA strand breakage. Biochem Pharmacol ,1992 , 43: 1137
6，Lu J, Jiang C, Kaeck M et al. Dissociation of the genotoxic and growth inhibitory effects of selenium. Biochem Pharmacol ,1995, 50: 213
, http://www.100md.com
7，徐辉碧, 冯志明, 程 驿. 硒化合物毒性的自由基机理. 华中理工大学学报, 1991, 19(1): 13
8，徐辉碧, 程 驿, 冯志明. 亚硒酸钠催化谷胱甘肽、过氧化氢产生超氧阴离子 的研究. 华中理工大学学报, 1991,19(1): 1
9，徐辉碧, 孙恩杰, 杨祥良. 硒的生物效应的活性氧自由基机理. 华中理工大学 学报, 1991,19(5): 533
10，张 铣, 刘毓谷主编. 毒理学. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合 出版社,1997.152～153
(1999-11-15 收稿), 百拇医药