复合真菌多糖抗肿瘤作用的免疫学研究
作者：刘长喜 高凡钱嘉林 严卫星
单位：卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021
关键词：复合真菌多糖；荷瘤鼠；免疫调节
卫生研究000318 摘要：采用猴头菇、香菇、茯苓3种真菌的多糖等比混合作为总多糖，再按一定比例配以葡萄籽多酚和甘草酸，制成复合真菌多糖，观察其抗肿瘤作用效果以及对荷瘤鼠免疫功能的调节作用。实验以100、200、400mg/kg BW3个剂量(复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)给小鼠灌胃3周后右前腋下接种S-180，继续灌胃10日后实验。同时设200mg/kg BW的香菇多糖对照组和荷瘤模型对照组，另设正常对照组。结果显示：该复合多糖具有明显的抗肿瘤作用，3个剂量组的抑瘤率分别为37.74%、44.73%、48.32%，同等剂量的复合多糖Ⅱ组的抑瘤效果明显优于单味香菇多糖。荷瘤鼠L3T4百分率和L3T4/Lyt-2比值明显下降，NK细胞活性、IL-2、IFN-γ的诱生水平显著低于正常小鼠。复合多糖作为免疫增强剂，可明显提高荷瘤鼠L3T4百分率和L3T4/Lyt-2，对Lyt-2的百分率也有一定的提高作用，增强NK细胞活性，促进IL-2、IFN-γ的诱生水平。单味香菇多糖也有一定改善荷瘤鼠免疫功能的作用，但是不如等剂量复合多糖的效果明显，佐证不同来源的抗肿瘤作用有效成分的相互配伍、相互协同的重要性。
, 百拇医药
中图分类号：R730.3 S646 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)03-0178-03
Immunological study on the antitumor effects of fungus
polysaccharides compounds
Liu Changxi, Gao Peng, Qian Jialin, Yan Weixing
(Institute of Food Safety Control and Inspection,Ministry of Health,Beijing 100021,China)
Abstract：Fungus polysaccharides compounds (FPC) are the mixture of procyanidins oligomers,glycyrrhetinicacid and polysaccharides of hericium erinaceus,lentinus edodes and poria cocos.The antitumor effects of FPC and its immunity regulating effects as an immunostimulant on the mice burdened with sarcoma 180 (S-180) were studied.FPC (100,200 and 400mg/kg BW) was gavaged to mice for 31 days. S-180 was transplanted to these mice on the 21th day. Lentinus edodes group was gavaged 200mg/kg BW saccharine of lentinus edodes. The results showed that FPC could inhibit the growth of S-180 effectively.The inhibitory rates were 37.74%,44.73% and 48.32% respectively. The antineoplastic activity of FPC (200mg/kg.BW) was more effective than polysaccharide of lentinus edodes at the same dose. In S-180 burdened mice,the percentage of L3T4 and the ratio of L3T4/Lyt-2, NK activity and the induced IL-2, IFN-γ levels were decreased significantly compared with the normal control group. As an immunostimulant, FPC could increase the percentage of L3T4 and the ratio of L3T4/Lyt-2 in S-180 burdened mice, but had no significant effects on the percentage of Lyt-2. Polysaccharide of lentinus edodes alone could also increase the immunity competence of mice burdened with S-180, but was not better than that of FPC at the same dose. It could be concluded that the compound of antineoplastic component could be synergetic.
, 百拇医药
Key words:fungus compound polysaccharides, tumor burdened mice, immunity regulation, L3T4/Lyt-2 ratio
我国天然植物或中草药中有许多具有抗致突变作用或抗肿瘤作用的物质，这些物质在人们日常生活中可以得到，无毒性或不易发生毒性，被认为是高效、无毒的潜在化学预防剂的最佳来源[1]。目前，有关复方中药或单味真菌多糖抗肿瘤作用机理的研究已经引起学者们足够的兴趣。本文对部分复合真菌多糖(以下简称复合多糖)抗肿瘤作用作了研究，复合多糖的作用并非是单味多糖成分的简单相加，各成分间存在着相辅相成、相互为用的关系，其相加、协同或拮抗作用不容忽视。鉴于此，本研究选择猴头菇、香菇、茯苓3种真菌的多糖，配以葡萄籽多酚和甘草酸，制成复合多糖，研究其对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用以及对免疫功能的影响，探讨其抗肿瘤作用的免疫学机理，并对复合多糖与单味香菇多糖的作用效果进行了比较，为进一步开发研究癌化学预防的生物反应调节剂提供参考。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 C57BL/6雄性小鼠，体重(18±2)g，随机分组，每组13只，购自中国医学科学院实验动物中心。
1.1.2 复合多糖的制备 猴头菇多糖、香菇多糖、茯苓多糖购自南京百兴生物工程有限公司，纯度分别为65%、70%、53%，3种多糖按等比混合后作为总多糖。葡萄籽多酚由中国科学院华南植物研究所提供，白花色素含量大于90%。甘草酸购自内蒙古甘草制品厂，纯度大于90%。将多糖、多酚、甘草酸按一定的比例混合，制成复合多糖，密闭避光保存待用。
1.1.3 抗T细胞单克隆抗体L3T4、Lyt-2以及FITC兔抗鼠IgG，购自北京医科大学基础医学学院免疫教研室；白细胞介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)酶标试剂盒购自Biocsource International,Inc。
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1.1.4 细胞株 S-180瘤株、Yac-1细胞由中国医学科学院肿瘤研究所提供。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组 本研究设100、200、400mg/kg BW(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)3个剂量组和香菇多糖(200mg/kg BW)对照组、荷瘤模型组以及正常对照组。灌胃3周后，除正常对照组外，其余5组动物的右前腋下接种5×106个/ml S-180瘤株0.1ml，继续灌胃10日后实验。
1.2.2 脾脏T细胞亚群的检测 采用间接免疫荧光单克隆抗体法。分离脾细胞，用淋巴细胞分层液分离，然后调整细胞浓度为1×106个/ml，分别加到3个试管中，每管1ml，其中一管为空白对照管，其余两管分别加100μl的L3T4、Lyt-2单克隆抗体，4℃孵育30min后，用Hanks液洗3遍，加入FITC兔抗鼠IgG100μl，再放入4℃孵育30min后洗3遍，滴片，在荧光显微镜下计数200个荧光细胞，减去空白对照管的荧光细胞后，求出荧光细胞百分率。
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1.2.3 IL-2、IFN-γ的检测 采用ELISA试剂盒，按说明操作，结果用光密度值表示。
1.2.4 淋巴细胞转化试验、NK细胞活性的检测 采用MTT法。
1.2.5 统计分析方法 所有数据均采用SAS软件进行方差分析处理。
2 结果
2.1 复合多糖对荷瘤动物瘤重、抑瘤率、瘤体比的影响
由表1可见，复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组荷瘤动物的瘤重与荷瘤模型组相比均有明显的抑制作用，香菇多糖组亦有明显的抑制作用，但是远远不及同等剂量的复合多糖Ⅱ组的作用效果(P<0.05)。从抑瘤率的结果来看，也同样表明等剂量的复合多糖Ⅱ组明显优于香菇多糖组。瘤体比的结果显示复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均明显低于香菇多糖组。
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表1 复合多糖对荷瘤动物瘤重的影响(1)(±s,n=12) 组 别
体重(g)
瘤重(g)
抑瘤率(%)
瘤体比(%)
荷瘤模型组
22.21±3.84
1.88±0.23a
—
8.17±0.74a
香菇多糖组
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21.25±3.04
1.31±0.19b
29.56±11.50b
6.33±0.52b
复合多糖Ⅰ
20.89±2.17
1.17±0.28b,c
37.74±13.12a,b
5.58±0.67c
复合多糖Ⅱ
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20.94±3.27
1.02±0.35c
44.73±19.32a
5.11±0.29d
复合多糖Ⅲ
20.21±3.51
0.97±0.25c
48.32±13.07a
4.79±0.23d
注：(1)各栏数据右上角字母不同者P<0.05
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2.2 复合多糖对荷瘤鼠T细胞亚群的影响
由表2可见，荷瘤鼠的辅助性T细胞L3T4水平明显下降，抑制性T细胞Lyt-2水平亦显著下降，但下降的幅度不如L3T4明显，L3T4/Lyt-2比值极显著下降。复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及香菇多糖组均能明显提高L3T4、L3T4/Lyt-2比值，而且复合多糖Ⅱ、Ⅲ组的L3T4水平、L3T4/Lyt-2比值恢复到正常小鼠水平。香菇多糖组也能提高L3T4水平、L3T4/Lyt-2比值，但是明显弱于同等剂量的复合多糖Ⅱ组。复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及香菇多糖组对Lyt-2的水平亦有一定的提高作用，但总体来看变化幅度不如L3T4明显。
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表2 复合多糖对小鼠T细胞亚群的影响(1)(±s,n=12) 组别
L3T4
(%)
Lyt-2
(%)
L3T4/Lyt-2
正常对照组
23.46±2.30a
15.27±0.99a
1.54±0.12a
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荷瘤模型组
12.32±1.84c
12.20±1.48d
1.04±0.15c
香菇多糖组
19.20±1.73b
13.63±1.12c
1.41±0.13b
复合多糖Ⅰ
20.57±1.55b
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14.01±1.09b,c
1.46±0.12a,b
复合多糖Ⅱ
22.17±1.75a
14.75±1.21a,b
1.52±0.19a，b
复合多糖Ⅲ
23.19±2.13a
15.21±1.05a
1.53±0.17a,b
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注：(1)各栏数据右上角字母不同者P<0.05
2.3 复合多糖对脾细胞增殖分化以及NK细胞活性的影响
由表3可见，荷瘤鼠的脾细胞转化功能以及NK细胞活性均明显低于正常对照组。复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及香菇多糖组均能提高荷瘤鼠的脾细胞转化功能以及NK细胞活性，在提高NK细胞活性方面，复合多糖Ⅱ组的效果优于香菇多糖组，复合多糖Ⅲ组的NK细胞活性恢复到正常小鼠水平。
表3 复合多糖对小鼠脾细胞增殖分化以及NK
细胞活性的影响(1)(±s,n=13) 组别
脾细胞转化功能
NK细胞活性
正常对照组
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0.205±0.098a
24.64±3.07a
荷瘤模型组
0.040±0.029d
14.43±1.14d
香菇多糖组
0.109±0.044b,c
19.19±1.82c
复合多糖Ⅰ
0.092±0.026c
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19.65±2.81c
复合多糖Ⅱ
0.107±0.032b,c
21.03±1.91b
复合多糖Ⅲ
0.137±0.043b
22.89±3.13a,b
注：(1)各栏数据右上角字母不同者，P<0.05
2.4 复合多糖对荷瘤鼠细胞因子诱生水平的影响(1)
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由表4可见，荷瘤鼠IL-2、IFN-γ的诱生水平均明显下降。复合多糖Ⅲ组能明显提高IL-2诱生水平，但是尚未恢复到正常小鼠水平。复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及香菇多糖组均能明显提高IFN-γ的诱生水平，复合多糖Ⅲ组的IFN-γ水平恢复到正常范围。
表4 复合多糖对荷瘤鼠细胞因子诱生水平的影响(1)(±s,n=10) 组 别
IL-2(OD)值
IFN-γ(OD值)
正常对照组
0.070±0.016a
0.147±0.035a
荷瘤模型组
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0.030±0.009c
0.071±0.021c
香菇多糖组
0.032±0.008c
0.100±0.016b
复合多糖Ⅰ
0.033±0.006c
0.094±0.014b
复合多糖Ⅱ
0.037±0.008c
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0.101±0.020b
复合多糖Ⅲ
0.051±0.009b
0.129±0.032a
注：(1)各栏数据右上角字母不同者P<0.05
2.5 荷瘤鼠瘤重与L3T4、Lyt-2、L3T4/Lyt-2比值的相关性分析
荷瘤鼠的瘤重与L3T4、Lyt-2、L3T4/Lyt-2三者均呈负相关(γ值分别为-0.952 7、-0.912 3、-0.960 4)，说明L3T4水平的升高，L3T4/Lyt-2比值升高有利于肿瘤的治疗。然而Lyt-2下降导致的L3T4/Lyt-2比值升高或Lyt-2水平升高使L3T4/Lyt-2比值达到下降的程度均对肿瘤的治疗不利[2～4]。
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3 讨论
3.1 复合多糖对小鼠移植性肿瘤的抑制作用
复合多糖主要是由3种真菌多糖、葡萄籽多酚以及甘草酸组成。文献报道，不同来源的多糖对瘤株存在着不同程度的抑制作用，如猴头菇多糖对脑瘤(B22)、肉瘤(S-180)、肝癌(Hep)的抑制作用较明显，而对艾氏腹水癌(EC)不明显[5]；香菇多糖对Hep和B22的作用较明显，而对EC和S-180不明显；甘草酸对S-180有较明显的抑制作用，对Hep有一定的作用，而对B22作用不明显[1，2，6，7]。葡萄子多酚主要是通过抗氧化和调节机体免疫功能来实现抗肿瘤作用的[4，5]，主要对Hep、EC有较明显的抑制作用，对S-180有一定的抑制作用，而对B22作用不明显[1，4，6]。基于上述因素，本研究采用以不同来源的多糖为主，佐以具有很强抗氧化作用的葡萄籽多酚和甘草酸，扩大了抗瘤谱，提高了对肿瘤细胞的杀伤、抑制作用，有着广泛的推广应用前景。本研究通过复合多糖对荷瘤鼠瘤重等影响的分析，表明虽然复合多糖组和单味香菇多糖组对荷瘤的瘤重均有明显的抑制作用(如表1)，但是等剂量的复合多糖Ⅱ组作用效果明显优于香菇多糖组。传统上多采用瘤重来判断抑瘤效果，但是尚有一定的片面性，瘤体比既可以反应机体的全身状况，又能反映抑瘤效果，是观察抑瘤作用更为客观的指标，从瘤体比的统计分析结果更能清楚地说明复合多糖组的作用效果明显优于香菇多糖组，表明各成分间未发生拮抗作用，佐证了各抗肿瘤作用有效成分相互配伍使用的重要性。
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3.2 复合多糖对荷瘤鼠免疫调节功能的影响
TH细胞和TS细胞是免疫调节、免疫监视的核心，两者之间处于相互制约的平衡状态，若TH细胞和TS细胞的数目或功能发生改变，两者间的平衡受到破坏，免疫监视功能失调，被认为是肿瘤发生的主要免疫学机制。TH/TS比值的改变与肿瘤的发生密切相关，提高TH/TS比值可明显降低肿瘤的发生[7]。L3T4及Lyt-2分别相当于CD4及CD8分子，CD4和CD8分别存在于诱导-辅助性T细胞(Ti/TH)和抑制性T细胞及杀伤性T细胞(TS/TC)表面[6]。本研究发现荷瘤鼠的L3T4和Lyt-2百分率均明显下降，但是Lyt-2下降的幅度比L3T4小，因此，L3T4/Lyt-2比值亦明显下降。给予复合多糖和香菇多糖后L3T4和Lyt-2百分率均有明显升高。L3T4百分率恢复到正常小鼠水平(见表2)，香菇多糖组的作用效果远远不及等剂量的复合多糖Ⅱ组，而且，无论是复合多糖组还是香菇多糖组虽然都能提高Lyt-2的百分率，但是幅度不如L3T4明显。因此L3T4/Lyt-2比值明显升高。复合多糖Ⅱ、Ⅲ组的L3T4/Lyt-2比值恢复到正常小鼠水平，表明该复合多糖具有良好的改善荷瘤鼠免疫功能的作用。通过瘤重与L3T4、Lyt-2、L3T4/Lyt-2的相关性分析发现，瘤重与三者均呈负相关，显示Lyt-2水平的升高也可以抑制肿瘤细胞的生长?近年来的研究发现L3T4、Lyt-2细胞亦是不均一的群体，在L3T4和Lyt-2细胞内均有不同的表型，Lyt-2细胞内尚有反抑制细胞(TCS)，这种细胞阻止TS对TH的抑制作用，直接参与杀伤靶细胞[4，7，8]。因此推论，给予复合多糖和香菇多糖后升高的Lyt-2或许是TCS表型，但是，若一味提高Lyt-2水平，致使L3T4/Lyt-2比值下降，不利于肿瘤的治疗，佐证L3T4在肿瘤免疫中是最为关键的效应细胞[7]。L3T4细胞既可以直接杀伤肿瘤细胞也可与NK细胞协同，提高NK细胞活性，而且诱导IL-2的分泌，提高Mφ的活性，活化其它组织细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，提高机体的整体抗肿瘤能力。本研究的荷瘤鼠NK细胞活性以及IL-2、IFN-γ诱生水平下降，通过给予复合多糖和香菇多糖后明显提高(见表3、4)，佐证了上述推论。香菇多糖在提高荷瘤鼠NK细胞活性方面，远远不及等剂量的复合多糖Ⅱ组明显，进一步证明复合多糖比单味香菇多糖具有更为理想的抗肿瘤作用效果。
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综上所述，本研究证明该复合多糖具有明显的抗肿瘤作用，而且可作为免疫增强剂提高荷瘤鼠的L3T4百分率以及L3T4/Lyt-2比值；提高NK细胞活性，诱导IL-2、IFN-γ的分泌，改善荷瘤鼠的免疫功能。各抗肿瘤作用有效成分的相互配伍、相互协同在肿瘤药物开发研究中是很有意义的。
基金项目：国家自然科学基金项目(No.39840016)
作者简介：刘长喜，男，硕士，副研究员
参考文献
1，赵长琦，许有玲，王亚洲.抗肿瘤植物药及其有效成分.北京：中国中医药出版社，1997，138—146
2，杜维霞，刘秀敏，赵乃坤.复方洋参多糖免疫增强剂对荷瘤和辐射小鼠T细胞亚群的影响.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(4)：58—61
, 百拇医药
3，苏燎原，田海林，徐映东，等.淋巴细胞亚群的NK活性及低剂量辐射对其影响.癌症，1997，16(2)：95—97
4，Pross HF.Continuous IL-2 and LAK cells for advanced cancer:a national biotherapy study group trial.Nat Immunol Cell Growth Regul，1997，7：51
5，Aggarwal B,Kohr J,Hass E, et al. Human tumor necrosis factor.J Biol Chem,1998,260(4):2345
6，内田 浩二.食品成分による发癌预防酵素群の诱导.ガン预防食品の开发，1995，37—45
7，大泽 俊彦.がんを防じ52の野菜.日本：株式会社 法研，1994，21—32
8，大东 肇.未知の-がん预防-成分の检索.がん预防食品の开发，1995，292—299
(2000-01-17收稿), 百拇医药
单位：卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021
关键词：复合真菌多糖；荷瘤鼠；免疫调节
卫生研究000318 摘要：采用猴头菇、香菇、茯苓3种真菌的多糖等比混合作为总多糖，再按一定比例配以葡萄籽多酚和甘草酸，制成复合真菌多糖，观察其抗肿瘤作用效果以及对荷瘤鼠免疫功能的调节作用。实验以100、200、400mg/kg BW3个剂量(复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)给小鼠灌胃3周后右前腋下接种S-180，继续灌胃10日后实验。同时设200mg/kg BW的香菇多糖对照组和荷瘤模型对照组，另设正常对照组。结果显示：该复合多糖具有明显的抗肿瘤作用，3个剂量组的抑瘤率分别为37.74%、44.73%、48.32%，同等剂量的复合多糖Ⅱ组的抑瘤效果明显优于单味香菇多糖。荷瘤鼠L3T4百分率和L3T4/Lyt-2比值明显下降，NK细胞活性、IL-2、IFN-γ的诱生水平显著低于正常小鼠。复合多糖作为免疫增强剂，可明显提高荷瘤鼠L3T4百分率和L3T4/Lyt-2，对Lyt-2的百分率也有一定的提高作用，增强NK细胞活性，促进IL-2、IFN-γ的诱生水平。单味香菇多糖也有一定改善荷瘤鼠免疫功能的作用，但是不如等剂量复合多糖的效果明显，佐证不同来源的抗肿瘤作用有效成分的相互配伍、相互协同的重要性。
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中图分类号：R730.3 S646 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)03-0178-03
Immunological study on the antitumor effects of fungus
polysaccharides compounds
Liu Changxi, Gao Peng, Qian Jialin, Yan Weixing
(Institute of Food Safety Control and Inspection,Ministry of Health,Beijing 100021,China)
Abstract：Fungus polysaccharides compounds (FPC) are the mixture of procyanidins oligomers,glycyrrhetinicacid and polysaccharides of hericium erinaceus,lentinus edodes and poria cocos.The antitumor effects of FPC and its immunity regulating effects as an immunostimulant on the mice burdened with sarcoma 180 (S-180) were studied.FPC (100,200 and 400mg/kg BW) was gavaged to mice for 31 days. S-180 was transplanted to these mice on the 21th day. Lentinus edodes group was gavaged 200mg/kg BW saccharine of lentinus edodes. The results showed that FPC could inhibit the growth of S-180 effectively.The inhibitory rates were 37.74%,44.73% and 48.32% respectively. The antineoplastic activity of FPC (200mg/kg.BW) was more effective than polysaccharide of lentinus edodes at the same dose. In S-180 burdened mice,the percentage of L3T4 and the ratio of L3T4/Lyt-2, NK activity and the induced IL-2, IFN-γ levels were decreased significantly compared with the normal control group. As an immunostimulant, FPC could increase the percentage of L3T4 and the ratio of L3T4/Lyt-2 in S-180 burdened mice, but had no significant effects on the percentage of Lyt-2. Polysaccharide of lentinus edodes alone could also increase the immunity competence of mice burdened with S-180, but was not better than that of FPC at the same dose. It could be concluded that the compound of antineoplastic component could be synergetic.
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Key words:fungus compound polysaccharides, tumor burdened mice, immunity regulation, L3T4/Lyt-2 ratio
我国天然植物或中草药中有许多具有抗致突变作用或抗肿瘤作用的物质，这些物质在人们日常生活中可以得到，无毒性或不易发生毒性，被认为是高效、无毒的潜在化学预防剂的最佳来源[1]。目前，有关复方中药或单味真菌多糖抗肿瘤作用机理的研究已经引起学者们足够的兴趣。本文对部分复合真菌多糖(以下简称复合多糖)抗肿瘤作用作了研究，复合多糖的作用并非是单味多糖成分的简单相加，各成分间存在着相辅相成、相互为用的关系，其相加、协同或拮抗作用不容忽视。鉴于此，本研究选择猴头菇、香菇、茯苓3种真菌的多糖，配以葡萄籽多酚和甘草酸，制成复合多糖，研究其对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用以及对免疫功能的影响，探讨其抗肿瘤作用的免疫学机理，并对复合多糖与单味香菇多糖的作用效果进行了比较，为进一步开发研究癌化学预防的生物反应调节剂提供参考。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 C57BL/6雄性小鼠，体重(18±2)g，随机分组，每组13只，购自中国医学科学院实验动物中心。
1.1.2 复合多糖的制备 猴头菇多糖、香菇多糖、茯苓多糖购自南京百兴生物工程有限公司，纯度分别为65%、70%、53%，3种多糖按等比混合后作为总多糖。葡萄籽多酚由中国科学院华南植物研究所提供，白花色素含量大于90%。甘草酸购自内蒙古甘草制品厂，纯度大于90%。将多糖、多酚、甘草酸按一定的比例混合，制成复合多糖，密闭避光保存待用。
1.1.3 抗T细胞单克隆抗体L3T4、Lyt-2以及FITC兔抗鼠IgG，购自北京医科大学基础医学学院免疫教研室；白细胞介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)酶标试剂盒购自Biocsource International,Inc。
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1.1.4 细胞株 S-180瘤株、Yac-1细胞由中国医学科学院肿瘤研究所提供。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组 本研究设100、200、400mg/kg BW(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)3个剂量组和香菇多糖(200mg/kg BW)对照组、荷瘤模型组以及正常对照组。灌胃3周后，除正常对照组外，其余5组动物的右前腋下接种5×106个/ml S-180瘤株0.1ml，继续灌胃10日后实验。
1.2.2 脾脏T细胞亚群的检测 采用间接免疫荧光单克隆抗体法。分离脾细胞，用淋巴细胞分层液分离，然后调整细胞浓度为1×106个/ml，分别加到3个试管中，每管1ml，其中一管为空白对照管，其余两管分别加100μl的L3T4、Lyt-2单克隆抗体，4℃孵育30min后，用Hanks液洗3遍，加入FITC兔抗鼠IgG100μl，再放入4℃孵育30min后洗3遍，滴片，在荧光显微镜下计数200个荧光细胞，减去空白对照管的荧光细胞后，求出荧光细胞百分率。
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1.2.3 IL-2、IFN-γ的检测 采用ELISA试剂盒，按说明操作，结果用光密度值表示。
1.2.4 淋巴细胞转化试验、NK细胞活性的检测 采用MTT法。
1.2.5 统计分析方法 所有数据均采用SAS软件进行方差分析处理。
2 结果
2.1 复合多糖对荷瘤动物瘤重、抑瘤率、瘤体比的影响
由表1可见，复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组荷瘤动物的瘤重与荷瘤模型组相比均有明显的抑制作用，香菇多糖组亦有明显的抑制作用，但是远远不及同等剂量的复合多糖Ⅱ组的作用效果(P<0.05)。从抑瘤率的结果来看，也同样表明等剂量的复合多糖Ⅱ组明显优于香菇多糖组。瘤体比的结果显示复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均明显低于香菇多糖组。
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表1 复合多糖对荷瘤动物瘤重的影响(1)(±s,n=12) 组 别
体重(g)
瘤重(g)
抑瘤率(%)
瘤体比(%)
荷瘤模型组
22.21±3.84
1.88±0.23a
—
8.17±0.74a
香菇多糖组
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21.25±3.04
1.31±0.19b
29.56±11.50b
6.33±0.52b
复合多糖Ⅰ
20.89±2.17
1.17±0.28b,c
37.74±13.12a,b
5.58±0.67c
复合多糖Ⅱ
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20.94±3.27
1.02±0.35c
44.73±19.32a
5.11±0.29d
复合多糖Ⅲ
20.21±3.51
0.97±0.25c
48.32±13.07a
4.79±0.23d
注：(1)各栏数据右上角字母不同者P<0.05
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2.2 复合多糖对荷瘤鼠T细胞亚群的影响
由表2可见，荷瘤鼠的辅助性T细胞L3T4水平明显下降，抑制性T细胞Lyt-2水平亦显著下降，但下降的幅度不如L3T4明显，L3T4/Lyt-2比值极显著下降。复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及香菇多糖组均能明显提高L3T4、L3T4/Lyt-2比值，而且复合多糖Ⅱ、Ⅲ组的L3T4水平、L3T4/Lyt-2比值恢复到正常小鼠水平。香菇多糖组也能提高L3T4水平、L3T4/Lyt-2比值，但是明显弱于同等剂量的复合多糖Ⅱ组。复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及香菇多糖组对Lyt-2的水平亦有一定的提高作用，但总体来看变化幅度不如L3T4明显。
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表2 复合多糖对小鼠T细胞亚群的影响(1)(±s,n=12) 组别
L3T4
(%)
Lyt-2
(%)
L3T4/Lyt-2
正常对照组
23.46±2.30a
15.27±0.99a
1.54±0.12a
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荷瘤模型组
12.32±1.84c
12.20±1.48d
1.04±0.15c
香菇多糖组
19.20±1.73b
13.63±1.12c
1.41±0.13b
复合多糖Ⅰ
20.57±1.55b
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14.01±1.09b,c
1.46±0.12a,b
复合多糖Ⅱ
22.17±1.75a
14.75±1.21a,b
1.52±0.19a，b
复合多糖Ⅲ
23.19±2.13a
15.21±1.05a
1.53±0.17a,b
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注：(1)各栏数据右上角字母不同者P<0.05
2.3 复合多糖对脾细胞增殖分化以及NK细胞活性的影响
由表3可见，荷瘤鼠的脾细胞转化功能以及NK细胞活性均明显低于正常对照组。复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及香菇多糖组均能提高荷瘤鼠的脾细胞转化功能以及NK细胞活性，在提高NK细胞活性方面，复合多糖Ⅱ组的效果优于香菇多糖组，复合多糖Ⅲ组的NK细胞活性恢复到正常小鼠水平。
表3 复合多糖对小鼠脾细胞增殖分化以及NK
细胞活性的影响(1)(±s,n=13) 组别
脾细胞转化功能
NK细胞活性
正常对照组
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0.205±0.098a
24.64±3.07a
荷瘤模型组
0.040±0.029d
14.43±1.14d
香菇多糖组
0.109±0.044b,c
19.19±1.82c
复合多糖Ⅰ
0.092±0.026c
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19.65±2.81c
复合多糖Ⅱ
0.107±0.032b,c
21.03±1.91b
复合多糖Ⅲ
0.137±0.043b
22.89±3.13a,b
注：(1)各栏数据右上角字母不同者，P<0.05
2.4 复合多糖对荷瘤鼠细胞因子诱生水平的影响(1)
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由表4可见，荷瘤鼠IL-2、IFN-γ的诱生水平均明显下降。复合多糖Ⅲ组能明显提高IL-2诱生水平，但是尚未恢复到正常小鼠水平。复合多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及香菇多糖组均能明显提高IFN-γ的诱生水平，复合多糖Ⅲ组的IFN-γ水平恢复到正常范围。
表4 复合多糖对荷瘤鼠细胞因子诱生水平的影响(1)(±s,n=10) 组 别
IL-2(OD)值
IFN-γ(OD值)
正常对照组
0.070±0.016a
0.147±0.035a
荷瘤模型组
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0.030±0.009c
0.071±0.021c
香菇多糖组
0.032±0.008c
0.100±0.016b
复合多糖Ⅰ
0.033±0.006c
0.094±0.014b
复合多糖Ⅱ
0.037±0.008c
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0.101±0.020b
复合多糖Ⅲ
0.051±0.009b
0.129±0.032a
注：(1)各栏数据右上角字母不同者P<0.05
2.5 荷瘤鼠瘤重与L3T4、Lyt-2、L3T4/Lyt-2比值的相关性分析
荷瘤鼠的瘤重与L3T4、Lyt-2、L3T4/Lyt-2三者均呈负相关(γ值分别为-0.952 7、-0.912 3、-0.960 4)，说明L3T4水平的升高，L3T4/Lyt-2比值升高有利于肿瘤的治疗。然而Lyt-2下降导致的L3T4/Lyt-2比值升高或Lyt-2水平升高使L3T4/Lyt-2比值达到下降的程度均对肿瘤的治疗不利[2～4]。
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3 讨论
3.1 复合多糖对小鼠移植性肿瘤的抑制作用
复合多糖主要是由3种真菌多糖、葡萄籽多酚以及甘草酸组成。文献报道，不同来源的多糖对瘤株存在着不同程度的抑制作用，如猴头菇多糖对脑瘤(B22)、肉瘤(S-180)、肝癌(Hep)的抑制作用较明显，而对艾氏腹水癌(EC)不明显[5]；香菇多糖对Hep和B22的作用较明显，而对EC和S-180不明显；甘草酸对S-180有较明显的抑制作用，对Hep有一定的作用，而对B22作用不明显[1，2，6，7]。葡萄子多酚主要是通过抗氧化和调节机体免疫功能来实现抗肿瘤作用的[4，5]，主要对Hep、EC有较明显的抑制作用，对S-180有一定的抑制作用，而对B22作用不明显[1，4，6]。基于上述因素，本研究采用以不同来源的多糖为主，佐以具有很强抗氧化作用的葡萄籽多酚和甘草酸，扩大了抗瘤谱，提高了对肿瘤细胞的杀伤、抑制作用，有着广泛的推广应用前景。本研究通过复合多糖对荷瘤鼠瘤重等影响的分析，表明虽然复合多糖组和单味香菇多糖组对荷瘤的瘤重均有明显的抑制作用(如表1)，但是等剂量的复合多糖Ⅱ组作用效果明显优于香菇多糖组。传统上多采用瘤重来判断抑瘤效果，但是尚有一定的片面性，瘤体比既可以反应机体的全身状况，又能反映抑瘤效果，是观察抑瘤作用更为客观的指标，从瘤体比的统计分析结果更能清楚地说明复合多糖组的作用效果明显优于香菇多糖组，表明各成分间未发生拮抗作用，佐证了各抗肿瘤作用有效成分相互配伍使用的重要性。
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3.2 复合多糖对荷瘤鼠免疫调节功能的影响
TH细胞和TS细胞是免疫调节、免疫监视的核心，两者之间处于相互制约的平衡状态，若TH细胞和TS细胞的数目或功能发生改变，两者间的平衡受到破坏，免疫监视功能失调，被认为是肿瘤发生的主要免疫学机制。TH/TS比值的改变与肿瘤的发生密切相关，提高TH/TS比值可明显降低肿瘤的发生[7]。L3T4及Lyt-2分别相当于CD4及CD8分子，CD4和CD8分别存在于诱导-辅助性T细胞(Ti/TH)和抑制性T细胞及杀伤性T细胞(TS/TC)表面[6]。本研究发现荷瘤鼠的L3T4和Lyt-2百分率均明显下降，但是Lyt-2下降的幅度比L3T4小，因此，L3T4/Lyt-2比值亦明显下降。给予复合多糖和香菇多糖后L3T4和Lyt-2百分率均有明显升高。L3T4百分率恢复到正常小鼠水平(见表2)，香菇多糖组的作用效果远远不及等剂量的复合多糖Ⅱ组，而且，无论是复合多糖组还是香菇多糖组虽然都能提高Lyt-2的百分率，但是幅度不如L3T4明显。因此L3T4/Lyt-2比值明显升高。复合多糖Ⅱ、Ⅲ组的L3T4/Lyt-2比值恢复到正常小鼠水平，表明该复合多糖具有良好的改善荷瘤鼠免疫功能的作用。通过瘤重与L3T4、Lyt-2、L3T4/Lyt-2的相关性分析发现，瘤重与三者均呈负相关，显示Lyt-2水平的升高也可以抑制肿瘤细胞的生长?近年来的研究发现L3T4、Lyt-2细胞亦是不均一的群体，在L3T4和Lyt-2细胞内均有不同的表型，Lyt-2细胞内尚有反抑制细胞(TCS)，这种细胞阻止TS对TH的抑制作用，直接参与杀伤靶细胞[4，7，8]。因此推论，给予复合多糖和香菇多糖后升高的Lyt-2或许是TCS表型，但是，若一味提高Lyt-2水平，致使L3T4/Lyt-2比值下降，不利于肿瘤的治疗，佐证L3T4在肿瘤免疫中是最为关键的效应细胞[7]。L3T4细胞既可以直接杀伤肿瘤细胞也可与NK细胞协同，提高NK细胞活性，而且诱导IL-2的分泌，提高Mφ的活性，活化其它组织细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，提高机体的整体抗肿瘤能力。本研究的荷瘤鼠NK细胞活性以及IL-2、IFN-γ诱生水平下降，通过给予复合多糖和香菇多糖后明显提高(见表3、4)，佐证了上述推论。香菇多糖在提高荷瘤鼠NK细胞活性方面，远远不及等剂量的复合多糖Ⅱ组明显，进一步证明复合多糖比单味香菇多糖具有更为理想的抗肿瘤作用效果。
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综上所述，本研究证明该复合多糖具有明显的抗肿瘤作用，而且可作为免疫增强剂提高荷瘤鼠的L3T4百分率以及L3T4/Lyt-2比值；提高NK细胞活性，诱导IL-2、IFN-γ的分泌，改善荷瘤鼠的免疫功能。各抗肿瘤作用有效成分的相互配伍、相互协同在肿瘤药物开发研究中是很有意义的。
基金项目：国家自然科学基金项目(No.39840016)
作者简介：刘长喜，男，硕士，副研究员
参考文献
1，赵长琦，许有玲，王亚洲.抗肿瘤植物药及其有效成分.北京：中国中医药出版社，1997，138—146
2，杜维霞，刘秀敏，赵乃坤.复方洋参多糖免疫增强剂对荷瘤和辐射小鼠T细胞亚群的影响.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(4)：58—61
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3，苏燎原，田海林，徐映东，等.淋巴细胞亚群的NK活性及低剂量辐射对其影响.癌症，1997，16(2)：95—97
4，Pross HF.Continuous IL-2 and LAK cells for advanced cancer:a national biotherapy study group trial.Nat Immunol Cell Growth Regul，1997，7：51
5，Aggarwal B,Kohr J,Hass E, et al. Human tumor necrosis factor.J Biol Chem,1998,260(4):2345
6，内田 浩二.食品成分による发癌预防酵素群の诱导.ガン预防食品の开发，1995，37—45
7，大泽 俊彦.がんを防じ52の野菜.日本：株式会社 法研，1994，21—32
8，大东 肇.未知の-がん预防-成分の检索.がん预防食品の开发，1995，292—299
(2000-01-17收稿), 百拇医药