喉癌放疗敏感性与p53和Bcl-2基因综合表达的关系
作者：杨怀安 朴哲孝治 高坂知节
单位：杨怀安(110001 沈阳，中国医科大学附属一院耳鼻咽喉科)；朴哲孝治(日本，东北大学 医院部耳鼻咽喉科)；高坂知节(日本，东北大学 医院部耳鼻咽喉科)
关键词：喉鳞癌；放疗敏感性；p53基因；Bcl-2基因
中华放射医学与防护杂志000313 【摘要】 目的 根据喉癌细胞自身生物学特性，探讨Bcl-2和p53基因综合表达与放射治 疗敏感性的相互关系。方法 应用抗Bcl-2和p53基因蛋白单克隆抗体，采 用 DACO CSA System法染色技术，对两组共70例喉鳞癌组织标本进行了免疫组织化学染色分析 ，将Bcl-2和p53基因表达分3个级别，应用Cramer(修正)列联系数(C)进行检验，探讨各自 及综合表达强度与喉癌放疗敏感性的相互关系。结果 可将喉癌Bcl-2和p5 3基因表达分为强度、中度及阴性表达。基因表达强度与放疗敏感性之间具有相关性，综合 表达 相关性更高。结论 Bcl-2和p53基因综合表达与放疗敏感性间具有明显相 关 性，可以把喉癌Bcl-2和p53基因综合表达作为喉癌放射治疗敏感性判定及指导临床治疗的 参考指标。
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Relationship between Bcl-2 and p53 gene expression and
radiat ion sensitivity in laryngeal carcinoma .
YANG Huai'an, Koji HOZAWA ,T omonori TAKASAKA.The First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang 110001,China
【Abstract】 Objective To determine the relationship between Bcl- 2 and p53 gene expression and radiation sensitivity according to the biologic ch aracter of laryngeal carcinoma. Methods Using monoclonal antibody fo r Bcl-2 and p53 gene protein,70 cases of laryngeal carcinoma were studied by im munohistochemical DACO CSA System method.Bcl-2 and p53 gene expressions were di vided into 3 levels:intense,moderate and negative.The relationship between expre ssion intensity and radiation sensitivity was tested by Cramer method. Res ults There was relationship between each gene expression and radiation se nsitivity.The correlation between cooperative expression and radiation sensitivi ty was higher than that of individual expression. Conclusion There is significant relationship between Bcl-2 and p53 gene cooperative expression a nd radiation sensitivity.The Bcl-2 and p53 gene cooperative expression can serv e as criteria in predicting efficacy of radiation therapy,prognosis of laryngeal carcinoma and guiding clinical treatment.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms; Radiation sensitivtity;p53 gene; Bcl-2 gene
近年来随着对细胞凋亡基因的了解以及放射线诱导细胞凋亡的研 究逐渐深入 ，已经明确了放射线诱导细胞凋亡可以作为放射治疗敏感性判定的指标。作为抑制细胞凋亡 的 Bcl-2及诱导细胞凋亡的p53基因表达对癌放疗敏感性具有重要影响。本文探讨了喉癌Bcl -2及p53基因表达强度分型以及基因表达强度与放疗敏感性的关系，报道如下。
材料和方法
1.病例选择
选择1985年～1995年间诊断为喉鳞癌，并行单纯放射治疗的70例喉癌患者，其中T1病例57例 ，T2病例12例，T3病例1例。喉癌分期按照1987年UICC喉癌分期标准。表1为Bcl-2及p53基 因表达研究对象。
, 百拇医药
2.放疗敏感性判定标准
全部病例观察5年以上，敏感例定为5年内无复发者。非敏感定为放疗未治愈或5年内局部复 发者。
3.治疗方法
采用单纯60Coγ射线治疗，剂量为60 Gy～70 Gy，每天2 Gy，连续5 d后休息2 d。对 于放疗无效或复发例进一步行部分喉及全喉切除术。
4.染色方法
选择治疗前活检福尔马林固定，石蜡包埋的喉癌组织标本，采用鼠抗人Bcl-2和p53单克隆 抗体(Novocastra Laboratories Ltd产品)，工作液稀释度为1∶20。免疫组织化学染色试剂 盒DACO CAS System(DACO日本株式会社产品)检测标本Bcl-2和p53基因表达情况。具体操作 如下：石蜡包埋癌组织切片(4 μm)在50℃温水中充分伸展后贴附在玻璃片上。在37℃恒温 器上干燥24 h,脱石蜡、亲水化后在10 mmol的柠檬酸缓冲液中煮沸10 min。然后按照DACO CSA System试剂盒顺序操作后在Methylgreen中衬染30 min、脱水、封片。在光学显微镜下B cl-2基因蛋白染色阳性者细胞浆呈黄褐色，染色阴性者细胞浆无色；p53基因蛋白染色阳性 者可见肿瘤细胞核呈黄褐色，染色阴性者细胞核呈淡蓝色(见图1)。
, 百拇医药
5.结果判定
随机选择5个高倍视野，当4/5个以上视野肿瘤细胞核呈黄褐色时定为强度表达；当1/5个以 下 视野肿瘤细胞核呈黄褐色时定为阴性表达；两者之间的定为中度表达。表达强度评分标准是 ：强度表达时p53为3分，Bcl-2为1分；中度表达时p53为2分，Bcl-2为2分；阴性表达时p5 3为1分，Bcl-2为3分。综合表达强度为同一癌组织Bcl-2及p53基因表达强度评分之和，最 高 分为6分，最低分为2分。喉癌放疗敏感性与各基因表达强度间是否相关应用Cramer(修正)列 联系数(C)及Pearson列联系数(P)进行检验。
结果
Bcl-2及p53基因表达在喉癌组织中从无表达到全部表达不等，染色阳性者在显微镜下可见 肿瘤细胞核呈黄褐色，染色阴性者细胞核呈淡蓝色，见图1。
图1 喉癌组织细胞p53染色所见色染淡蓝。甲基绿×100
, 百拇医药
表2为喉癌放疗敏感性与Bcl-2基因表达程度的关系，C=0.5105。
表3为喉癌放疗敏感性与p53基因表达程度的关系，C=0.4802。
表4为喉癌放疗敏感性与p53和Bcl-2基因综合表达程度的关系，P=0.5802。
表1 Bcl-2及p53基因表达研究对 象(例) 分组
例数
T1
T2
T3
μg
g
, 百拇医药
μg
g
μg
g
有效组
40
9
22
2
7
0
0
无效组
30
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7
18
1
3
1
0
注：μg为声门上型喉癌，g为声门型喉癌表2 喉癌放疗敏感性与Bcl-2基因表 达程度的关系 分组
例数
强度
中度
阴性
例数
%
, 百拇医药
例数
%
例数
%
敏感例
40
3
12
18
47
19
95
非敏感例
30
, http://www.100md.com
9
88
20
53
1
5
注：放疗敏感性与Bcl-2基因表达程度相关系数：C=0.5105 表3 喉癌放疗敏感性与p53基因表 达程度的关系 分组
例数
强度
中度
阴性
例数
, 百拇医药
%
例数
%
例数
%
敏感例
40
11
91
24
64
5
24
非敏感例
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30
1
9
13
36
16
76
注：放疗敏感性与P53 基因表达程度相关系数：C=0.4820 表4 喉癌放疗敏感性与p53和Bcl-2 基因综合表达程度的关系 分组
例数
6分
5分
4分
, 百拇医药
3分
2分
有效例
40
7
20
10
3
0
无效例
30
0
2
7
, 百拇医药
15
6
注：放疗敏感性与p53和Bcl-2基因综合表达程度相关系数：P=0.5802
讨论
喉癌放射治疗已有多年，人们很早就发现放疗敏感性个体差异很大，并对影响放疗敏感性的 诸多 因素如肿瘤大小，生长部位及分化程度等进行了研究[1，2]。它们与放疗敏感性虽 有相 关性，但临床上常出现例外。近年来随着分子生物学理论及其技术在医疗研究中的不断应用 ，证实放射线能够引起细胞凋亡[3]，细胞凋亡依赖于p53基因[4]并受Bcl -2基因水平限制[5]，因此可以作为判定癌症放射治疗敏感性的指标。
我们应用针对人p53及Bcl-2基因产物蛋白单克隆抗体对70例接受单纯放射治疗的喉癌患者 进 行了回顾性研究，发现虽然都是喉鳞癌，但p53及Bcl-2基因表达在喉癌组织中从无表达到 强 表达不等，差异还很大，将p53及Bcl-2基因表达强度分为强度表达、中度表达及阴性表达 ， 并探讨了每种基因表达与喉鳞癌放疗敏感性的关系。发现放疗敏感组Bcl-2基因表达较低， 而放 疗非敏感组Bcl-2基因表达较高，放疗敏感性与Bcl-2基因表达相关。而p53基因表达则相 反，放 疗敏感组p53基因表达较高，放疗非敏感组p53基因表达较低。结果表明放疗敏感性与Bcl-2 及p5 3基因表达具有相关性，全相关系数较低。从表5喉癌放疗敏感性与p53和Bcl-2基因综合表 达强 度的关系看，两者不但相关，并明显的提高了相关系数，P=0.5802。因此显示出p53和 Bcl-2基因综合表达强度与喉癌放疗敏感性具有更高的相关性。
, 百拇医药
当然，喉癌放疗敏感性是受多种因素影响决定的，如能应用这些因素对喉癌放疗敏感性进行 综合 判定，那将会提高判定准确率，并对选择治疗方案(放疗或切除等)具有重要的临床意义 。
参考文献
1 朝仓光司，志藤文明，坪田大他.喉头癌放射线照射后再发症例レ-ザ-手术.耳 鼻临床，1996，89：1249-1252.
2 Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of a mouse monoclonal antibody rea ctive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation.Int J Canc er,1983,31:13-20.
3 Yamada T,Ohyama H.Radiation-induced interphase death of rat thymocytes is in ternally programmed(apoptosis).Int J Radiat Biol,1988,53:65-75.
, 百拇医药
4 Caelles C,Helmberg A, Karin M.p53-dependent apoptosis in the absence of t ranscriptional activation of p53-target genes.Nature,(London).1994,370:220-223 .
5 Hockenbery DM,Oltai ZN,Yin XM et al.Bcl-2 functions in an antioxidant pathwa y to prevent apoptosis.Cell,1993,75:241-251.
(收稿日期:1999-12-14), 百拇医药
单位：杨怀安(110001 沈阳，中国医科大学附属一院耳鼻咽喉科)；朴哲孝治(日本，东北大学 医院部耳鼻咽喉科)；高坂知节(日本，东北大学 医院部耳鼻咽喉科)
关键词：喉鳞癌；放疗敏感性；p53基因；Bcl-2基因
中华放射医学与防护杂志000313 【摘要】 目的 根据喉癌细胞自身生物学特性，探讨Bcl-2和p53基因综合表达与放射治 疗敏感性的相互关系。方法 应用抗Bcl-2和p53基因蛋白单克隆抗体，采 用 DACO CSA System法染色技术，对两组共70例喉鳞癌组织标本进行了免疫组织化学染色分析 ，将Bcl-2和p53基因表达分3个级别，应用Cramer(修正)列联系数(C)进行检验，探讨各自 及综合表达强度与喉癌放疗敏感性的相互关系。结果 可将喉癌Bcl-2和p5 3基因表达分为强度、中度及阴性表达。基因表达强度与放疗敏感性之间具有相关性，综合 表达 相关性更高。结论 Bcl-2和p53基因综合表达与放疗敏感性间具有明显相 关 性，可以把喉癌Bcl-2和p53基因综合表达作为喉癌放射治疗敏感性判定及指导临床治疗的 参考指标。
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Relationship between Bcl-2 and p53 gene expression and
radiat ion sensitivity in laryngeal carcinoma .
YANG Huai'an, Koji HOZAWA ,T omonori TAKASAKA.The First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang 110001,China
【Abstract】 Objective To determine the relationship between Bcl- 2 and p53 gene expression and radiation sensitivity according to the biologic ch aracter of laryngeal carcinoma. Methods Using monoclonal antibody fo r Bcl-2 and p53 gene protein,70 cases of laryngeal carcinoma were studied by im munohistochemical DACO CSA System method.Bcl-2 and p53 gene expressions were di vided into 3 levels:intense,moderate and negative.The relationship between expre ssion intensity and radiation sensitivity was tested by Cramer method. Res ults There was relationship between each gene expression and radiation se nsitivity.The correlation between cooperative expression and radiation sensitivi ty was higher than that of individual expression. Conclusion There is significant relationship between Bcl-2 and p53 gene cooperative expression a nd radiation sensitivity.The Bcl-2 and p53 gene cooperative expression can serv e as criteria in predicting efficacy of radiation therapy,prognosis of laryngeal carcinoma and guiding clinical treatment.
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【Key words】 Laryngeal neoplasms; Radiation sensitivtity;p53 gene; Bcl-2 gene
近年来随着对细胞凋亡基因的了解以及放射线诱导细胞凋亡的研 究逐渐深入 ，已经明确了放射线诱导细胞凋亡可以作为放射治疗敏感性判定的指标。作为抑制细胞凋亡 的 Bcl-2及诱导细胞凋亡的p53基因表达对癌放疗敏感性具有重要影响。本文探讨了喉癌Bcl -2及p53基因表达强度分型以及基因表达强度与放疗敏感性的关系，报道如下。
材料和方法
1.病例选择
选择1985年～1995年间诊断为喉鳞癌，并行单纯放射治疗的70例喉癌患者，其中T1病例57例 ，T2病例12例，T3病例1例。喉癌分期按照1987年UICC喉癌分期标准。表1为Bcl-2及p53基 因表达研究对象。
, 百拇医药
2.放疗敏感性判定标准
全部病例观察5年以上，敏感例定为5年内无复发者。非敏感定为放疗未治愈或5年内局部复 发者。
3.治疗方法
采用单纯60Coγ射线治疗，剂量为60 Gy～70 Gy，每天2 Gy，连续5 d后休息2 d。对 于放疗无效或复发例进一步行部分喉及全喉切除术。
4.染色方法
选择治疗前活检福尔马林固定，石蜡包埋的喉癌组织标本，采用鼠抗人Bcl-2和p53单克隆 抗体(Novocastra Laboratories Ltd产品)，工作液稀释度为1∶20。免疫组织化学染色试剂 盒DACO CAS System(DACO日本株式会社产品)检测标本Bcl-2和p53基因表达情况。具体操作 如下：石蜡包埋癌组织切片(4 μm)在50℃温水中充分伸展后贴附在玻璃片上。在37℃恒温 器上干燥24 h,脱石蜡、亲水化后在10 mmol的柠檬酸缓冲液中煮沸10 min。然后按照DACO CSA System试剂盒顺序操作后在Methylgreen中衬染30 min、脱水、封片。在光学显微镜下B cl-2基因蛋白染色阳性者细胞浆呈黄褐色，染色阴性者细胞浆无色；p53基因蛋白染色阳性 者可见肿瘤细胞核呈黄褐色，染色阴性者细胞核呈淡蓝色(见图1)。
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5.结果判定
随机选择5个高倍视野，当4/5个以上视野肿瘤细胞核呈黄褐色时定为强度表达；当1/5个以 下 视野肿瘤细胞核呈黄褐色时定为阴性表达；两者之间的定为中度表达。表达强度评分标准是 ：强度表达时p53为3分，Bcl-2为1分；中度表达时p53为2分，Bcl-2为2分；阴性表达时p5 3为1分，Bcl-2为3分。综合表达强度为同一癌组织Bcl-2及p53基因表达强度评分之和，最 高 分为6分，最低分为2分。喉癌放疗敏感性与各基因表达强度间是否相关应用Cramer(修正)列 联系数(C)及Pearson列联系数(P)进行检验。
结果
Bcl-2及p53基因表达在喉癌组织中从无表达到全部表达不等，染色阳性者在显微镜下可见 肿瘤细胞核呈黄褐色，染色阴性者细胞核呈淡蓝色，见图1。
图1 喉癌组织细胞p53染色所见色染淡蓝。甲基绿×100
, 百拇医药
表2为喉癌放疗敏感性与Bcl-2基因表达程度的关系，C=0.5105。
表3为喉癌放疗敏感性与p53基因表达程度的关系，C=0.4802。
表4为喉癌放疗敏感性与p53和Bcl-2基因综合表达程度的关系，P=0.5802。
表1 Bcl-2及p53基因表达研究对 象(例) 分组
例数
T1
T2
T3
μg
g
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μg
g
μg
g
有效组
40
9
22
2
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无效组
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注：μg为声门上型喉癌，g为声门型喉癌表2 喉癌放疗敏感性与Bcl-2基因表 达程度的关系 分组
例数
强度
中度
阴性
例数
%
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例数
%
例数
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非敏感例
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注：放疗敏感性与Bcl-2基因表达程度相关系数：C=0.5105 表3 喉癌放疗敏感性与p53基因表 达程度的关系 分组
例数
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注：放疗敏感性与P53 基因表达程度相关系数：C=0.4820 表4 喉癌放疗敏感性与p53和Bcl-2 基因综合表达程度的关系 分组
例数
6分
5分
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注：放疗敏感性与p53和Bcl-2基因综合表达程度相关系数：P=0.5802
讨论
喉癌放射治疗已有多年，人们很早就发现放疗敏感性个体差异很大，并对影响放疗敏感性的 诸多 因素如肿瘤大小，生长部位及分化程度等进行了研究[1，2]。它们与放疗敏感性虽 有相 关性，但临床上常出现例外。近年来随着分子生物学理论及其技术在医疗研究中的不断应用 ，证实放射线能够引起细胞凋亡[3]，细胞凋亡依赖于p53基因[4]并受Bcl -2基因水平限制[5]，因此可以作为判定癌症放射治疗敏感性的指标。
我们应用针对人p53及Bcl-2基因产物蛋白单克隆抗体对70例接受单纯放射治疗的喉癌患者 进 行了回顾性研究，发现虽然都是喉鳞癌，但p53及Bcl-2基因表达在喉癌组织中从无表达到 强 表达不等，差异还很大，将p53及Bcl-2基因表达强度分为强度表达、中度表达及阴性表达 ， 并探讨了每种基因表达与喉鳞癌放疗敏感性的关系。发现放疗敏感组Bcl-2基因表达较低， 而放 疗非敏感组Bcl-2基因表达较高，放疗敏感性与Bcl-2基因表达相关。而p53基因表达则相 反，放 疗敏感组p53基因表达较高，放疗非敏感组p53基因表达较低。结果表明放疗敏感性与Bcl-2 及p5 3基因表达具有相关性，全相关系数较低。从表5喉癌放疗敏感性与p53和Bcl-2基因综合表 达强 度的关系看，两者不但相关，并明显的提高了相关系数，P=0.5802。因此显示出p53和 Bcl-2基因综合表达强度与喉癌放疗敏感性具有更高的相关性。
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当然，喉癌放疗敏感性是受多种因素影响决定的，如能应用这些因素对喉癌放疗敏感性进行 综合 判定，那将会提高判定准确率，并对选择治疗方案(放疗或切除等)具有重要的临床意义 。
参考文献
1 朝仓光司，志藤文明，坪田大他.喉头癌放射线照射后再发症例レ-ザ-手术.耳 鼻临床，1996，89：1249-1252.
2 Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of a mouse monoclonal antibody rea ctive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation.Int J Canc er,1983,31:13-20.
3 Yamada T,Ohyama H.Radiation-induced interphase death of rat thymocytes is in ternally programmed(apoptosis).Int J Radiat Biol,1988,53:65-75.
, 百拇医药
4 Caelles C,Helmberg A, Karin M.p53-dependent apoptosis in the absence of t ranscriptional activation of p53-target genes.Nature,(London).1994,370:220-223 .
5 Hockenbery DM,Oltai ZN,Yin XM et al.Bcl-2 functions in an antioxidant pathwa y to prevent apoptosis.Cell,1993,75:241-251.
(收稿日期:1999-12-14), 百拇医药