S-亚硝基硫醇的生理意义分析方法
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国外医学临床生物化学与检验学分册 1999年第20卷第2
湖北省黄冈卫生党校(436100)周剑涛* 吴友才** 何香
摘 要 S-亚硝基硫醇作为一氧化氮的中间代谢形式普遍存在生物体系中，对NO的舒张血管、防止血小板粘连聚集等效应有调节意义。准确测定S-亚硝基硫醇对于完整地认识体现NO代谢是重要的，化学发光法、荧光光谱法、高效毛细管电泳法等是目前直接测定S-亚硝基硫醇应用的方法。
关键词：S-亚硝基硫醇；一氧化氮；生理意义；测定方法
S-亚硝基硫醇(S-nitrosothiols或thionitrites)是硫醇(R-SH)化合物的NO取代物(RSNO)。随着NO生物医学的深入研究，RSNO在NO代谢过程中的重要作用逐渐被认识，促进了人们对RSNO具有的生理意义及检测方法的研究。
1 人体内的RSNO
, 百拇医药
一般而言，含有硫基(-SH)的化合物均有可能形成RSNO。普遍存在于机体内的RSNO主要有小分子的S-亚硝基半胱氨酸(S-nitrosocysteine, Cys-SNO)与S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione, GSNO)、大分子的S-亚硝基白蛋白(S-nitrosoalbumin, Alb-SNO)与S-亚硝基血红蛋白(S-nitrosohaem-oglobin, Hb-SNO)等。
血液及部分组织或细胞中某些RSNO的浓度水平已有报道[1]。血样本贮存2～3周后，测得血浆Alb-SNO浓度为0.25～1.0μmol/L，若样本采集后即刻测定，其浓度会更高一些。血浆Cys-SNO浓度为0.3μmol/L，但波动性大于Alb-SNO。血浆中GSNO浓度范围为0.12～0.18μmol/L。气道粘液中GSNO浓度范围为0.25μmol/L(正常人体)，肺炎患者为4.0μmol/L，肺移植患者在移植后为0.8μmol/L。体外膜肺(ECMO)患者气道粘液中似乎缺乏GSNO。红细胞内Hb-SNO含量在动脉血和静脉血之间为0.3μmol/L，而静脉血中仅为0.03μmol/L。
, 百拇医药
Stamler指出[2]，Hb在肺部通过直接与NO反应或通过血中RSNO(如GSNO)转亚硝基作用形式Hb-SNO。
Hb-SH+RSNO→Hb-SNO+RSH
NO与Hb两个半胱氨酸的巯基结合形成Hb-SNO的反应称为Hb亚硝化作用，该过程依赖于Hb的构象状态，作为一种变构效应伴随Hb的氧合作用[3]，R型(Relaxed form)Hb较T型(taut form)Hb的亚硝基化程度高。
2 RSNO的生理意义
RSNO是生物体内NO供体(NO donors)之一。Rubanyi等曾认为[4]，内皮衍化松驰因子(EDRF)是Cys-SNO而不是NO，由于Cys-SNO很容易分解成为Cys和NO，当时未能得到证实。目前，实验证明激活鸟苷酸环化酶(GC)产生生物效应的是游离NO，但游离NO可来源于RSNO。NO合酶(NOS)催化L-精氨酸产生的NO以结合形式(如RSNO)释放出来，结合状态的NO不像游离NO易被血液中NO捕捉剂捕获，在需要的时候可释放NO介导GC激活过程。
, 百拇医药
动、静脉血中Hb-SNO含量的显蓍差异也表明，在微循环中，Hb-SNO作为NO供体可调节血管张力，即NO的舒血管特性。在组织低氧环境，Hb变构，氧亲和力降低，释放氧同时去亚硝基化。Lancaster曾运用Fick氏第二扩散定律对血管壁中NO扩散性质进行分析[5]，认为血管中游离NO将被Hb捕获, 以致NO水平降至GC的Km值以下。如果血管局部产生的NO被血液Hb捕捉，就不表现出舒血管效应，那么，Hb-SNO在脱氧时释放NO就有重要意义。总之，激活GC的NO可能是局部产生的，也可以由Hb-SNO等供体释放，究竟哪种来源为主，可能依赖于血管类型。
RSNO较NO的半寿期长，且具有NO抗血小板粘附及聚集的效应。Mendelsohn等认为RSNO通过释放NO激活GC，引起血小板内cGMP水平升高，抑制人血小板粘附于纤维胶原蛋白和人内皮细胞，也降低大鼠体内ADP诱导的血小板聚集作用[6]。即RSNO具有防止血小板粘连聚集作用。GSNO的血小板抑制活性大于NO和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine, SNAP)，GSNO是目前有效的药用NO供体之一。
, 百拇医药
RSNO曾被认为是非肾上腺能非胆碱能(NANC)神经的递质。Gibson和Barbier等报道GSNO是小鼠肛尾肌和大鼠胃底部NANC神经释放的递质[7,8]。NANC神经支配的平滑肌舒张作用能被NOS抑制剂阻断，然而能消除外源性NO舒张效应的NO捕捉剂对此无影响。如生成超氧离子的物质能灭活外源性NO，对NANC诱导的大鼠胃底部和小鼠肛尾肌的舒张作用没有影响。Liu等指出[9]RSNO可能参与阴茎勃起，也可能与调节支气管平滑肌张力有关。不过，RSNO直接作为NANC神经递质的观点未能被广泛接受。
3 RSNO的测定方法
3.1 RSNO的性质 RSNO水溶液在330～350nm和540～600nm有吸收峰[1,10]，利用光吸收特性可能来监测实验条件，RSNO生成或分解状态，也可用于定量分析。
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RSNO通过S-N键均裂产生NO和相应二硫化合物(RSSR)[10]。根据这一性质采用检测NO及其NO代谢产物(NO2—，NO3—)的一系列分析技术间接测定RSNO。不过，室温条件下RSNO水溶液比较稳定。用金属离子，如10-6mol/L铜离子能有效地加速RSNO分解。Dicks等认为发生有效催化作用的是Cu(Ⅰ)而不是Cu(Ⅱ)[11]。Gordge等报道[12]，选择性Cu(Ⅰ络合剂能降低RSNO抗血小板聚集作用。
可见光和紫外光(UV)也加速RSNO分解.。可见光引起GSNO释放NO，因此用于体外GSNO研究的生物材料应避光培养[13]。UV分解RSNO对分析测定RSNO极有意义，等基于UV分解-S-N键的特点，建立了一种有效的RSNO检测系统。
目前，RSNO的测定方法有直接测定法和间接测定法。一般而言，适合NO分析测定的方法可用于RSNO的间接测定，诸如化学发光法、NO2—与NO3—法、高铁血红蛋白法，电子自旋共振波谱法、电化学法等[14]，本文不再赘述。以下介绍几种直接测定RSNO的分析方法。
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3.2 光解-化学发光法[15](photolysis-chemilumi-nescence) 该方法建立在NO化学发光法基础之上，包括光解断裂S-NO键和化学发光法检测NO两个过程。样本通过HPLC或GC分离系统进入光分解器，利用UV(如365nm)使RSNO中的S-NO键均裂产生NO，NO随隋性气体进入化学发光仪与臭氧(O3)发生化学反应生成激发态NO2(NO2*)，后者以光子形式释放能量返回基态，采用敏感的光电倍增管检测该过程中光子发射强度，以此确定NO含量。
NO+O3→NO2*+O2
NO2*→NO2+hv
根据化学发光仪检测前是否经过光解作用可以区别游离NO与RSNO和其它的NO衍生物，该法检测下限为10-9mol/L，变异系数<2%，可以满足生理性和药理条件下细胞、血桨中的RSNO的测定。由于光解-化学发光法综合地利用了HPLC或GC的高分辨率，UV特异性断裂RSNO分子中S-N键、NO与O3高反应特异性和化学发光法的高灵敏度。所以，目前认为该方法是测定RSNO的最佳方法之一。
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3.3 荧光光谱法[11](spectrofluorometric method ) RSNO(如GSNO)水溶液(pH1)在334nm和544nm有吸收峰，但摩尔吸光系数极低，分别为890和16，检测灵敏度远不能满足生理水平需要。为了提高检测灵敏度，Gabor等利用“内滤光效应”(innerfilter effect)，采用荧光光谱法测定RSNO含量。RSNO本身无荧光性质，Gabor选用硫酸喹啉作为荧光剂，因为硫酸喹啉与RSNO在334nm有最大重迭吸收峰。硫酸喹啉与RSNO吸收334nm波长符合Lambert-Beer定律，所以两者吸收光的相对量可通过334nm波长处吸收系数比值确定。RSNO影响硫酸喹啉对激发光的吸收，导致其发射光(453nm)强度变化。即在一定条件下，RSNO含量越大，硫酸喹啉发射荧光强度越小。由于NO与RSH生成RSNO是化学计量反应，所以该方法既适合检测生理条件细胞和体液中NO含量，又适合RSNO(如GSNO)和硫醇(如谷胱苷肽)含量的测定。
3.4 高效毛细管电泳(high-performance capiuary electrophoresis, HPCE) HPCE技术以高分辨率、快速、微量为其特点，在分析多种体液中大小成份方面已显出独特的优势[16]，在高电压(10～30kV)条件，HPCE也适合分离分析硫醇及相应RSNO和二硫化物。但是，目前用HPCE分析RSNO，其灵敏度还未达到人体生理水平，另外，分析不同的硫醇衍生物需要调整电场条件和缓冲液pH值，故还不能同时用来分析硫醇衍生物[17]。所以，HPCE测定RSNO尚需要进一步改进。可以预计，随着HPCE自动分析仪的推广与应用，测定分析条件的不断完善，HPCE技术将会更好地用于RSNO的研究。
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*作者简介：周剑涛，男，44岁，本科，学士。现任副主任技师，主持黄冈市临床检验中心工作及从事生物化学、生物化学检验技术教学。
**湖北省黄冈市一医院检验科
参考文献
1 Butler AR, Rhodes P, Anal Biochem,1997;249:1-9
2 Stamler JC.Cell,1994;78:931-936
3 Jia L, Bonaventura C, Bonaventura J, et al.Nature,1996;380:221-226
4 Rubanyi GM, Johns A, Wilcox D, et al. J Cardiovasc Pharmacol,1991,17:S41-S45
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5 Lancaster JR, Proc Natl Acad Sci USA,1994;91:8137-8141
6 Radomski MW, Rees DD, Dutra A, et al.Br J Pharmacol,1992;107:745-749
7 Gibson A, Babbedge R, Brave SR, et al .Br J Pharmacol,1992;107:715-721
8 Barbier AJM, Lefebve RA. Eur J Pharmacol,891992;219:331-334
9 Liu X, Gillespie JS, Martin W.Br J Pharmacol, 1994:111:1287-1295
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10 Gabor G, Allon N. Anal Biochem,1994;220:16-19
11 Dicks AP. Swift HR, Williams DLH, et al. J Chem Soc Perkin Trans ,1996;2:481-487
12 Gordge MP, Meyer DJ, Hothersall J, et al.Br J Pharmacol ,1995;114:1083-1089
13 Sexton DJ. Muruganandam A, Mckenney DJ, et al .Photochem Photobiol,1994;59:463-467
14 王成彬,沈文梅,田亚平。国外医学临床生物化学与检验学分册,1996;17(4):176-178
, 百拇医药
15 Alpert C, Ramdev N, George D, et al. Anal Biochem ,1997;245:1-7
16 张庆殷,李丽珍,邹雄。医学临床生物化学与检验学分册,1997;18(3):123-125
17 Stamler JS, Loscalzo J. Anal Chem ,1992;64:779-785
(98-04-10收稿)
录入：邰 燕
校对：马海茸, 百拇医药
摘 要 S-亚硝基硫醇作为一氧化氮的中间代谢形式普遍存在生物体系中，对NO的舒张血管、防止血小板粘连聚集等效应有调节意义。准确测定S-亚硝基硫醇对于完整地认识体现NO代谢是重要的，化学发光法、荧光光谱法、高效毛细管电泳法等是目前直接测定S-亚硝基硫醇应用的方法。
关键词：S-亚硝基硫醇；一氧化氮；生理意义；测定方法
S-亚硝基硫醇(S-nitrosothiols或thionitrites)是硫醇(R-SH)化合物的NO取代物(RSNO)。随着NO生物医学的深入研究，RSNO在NO代谢过程中的重要作用逐渐被认识，促进了人们对RSNO具有的生理意义及检测方法的研究。
1 人体内的RSNO
, 百拇医药
一般而言，含有硫基(-SH)的化合物均有可能形成RSNO。普遍存在于机体内的RSNO主要有小分子的S-亚硝基半胱氨酸(S-nitrosocysteine, Cys-SNO)与S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione, GSNO)、大分子的S-亚硝基白蛋白(S-nitrosoalbumin, Alb-SNO)与S-亚硝基血红蛋白(S-nitrosohaem-oglobin, Hb-SNO)等。
血液及部分组织或细胞中某些RSNO的浓度水平已有报道[1]。血样本贮存2～3周后，测得血浆Alb-SNO浓度为0.25～1.0μmol/L，若样本采集后即刻测定，其浓度会更高一些。血浆Cys-SNO浓度为0.3μmol/L，但波动性大于Alb-SNO。血浆中GSNO浓度范围为0.12～0.18μmol/L。气道粘液中GSNO浓度范围为0.25μmol/L(正常人体)，肺炎患者为4.0μmol/L，肺移植患者在移植后为0.8μmol/L。体外膜肺(ECMO)患者气道粘液中似乎缺乏GSNO。红细胞内Hb-SNO含量在动脉血和静脉血之间为0.3μmol/L，而静脉血中仅为0.03μmol/L。
, 百拇医药
Stamler指出[2]，Hb在肺部通过直接与NO反应或通过血中RSNO(如GSNO)转亚硝基作用形式Hb-SNO。
Hb-SH+RSNO→Hb-SNO+RSH
NO与Hb两个半胱氨酸的巯基结合形成Hb-SNO的反应称为Hb亚硝化作用，该过程依赖于Hb的构象状态，作为一种变构效应伴随Hb的氧合作用[3]，R型(Relaxed form)Hb较T型(taut form)Hb的亚硝基化程度高。
2 RSNO的生理意义
RSNO是生物体内NO供体(NO donors)之一。Rubanyi等曾认为[4]，内皮衍化松驰因子(EDRF)是Cys-SNO而不是NO，由于Cys-SNO很容易分解成为Cys和NO，当时未能得到证实。目前，实验证明激活鸟苷酸环化酶(GC)产生生物效应的是游离NO，但游离NO可来源于RSNO。NO合酶(NOS)催化L-精氨酸产生的NO以结合形式(如RSNO)释放出来，结合状态的NO不像游离NO易被血液中NO捕捉剂捕获，在需要的时候可释放NO介导GC激活过程。
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动、静脉血中Hb-SNO含量的显蓍差异也表明，在微循环中，Hb-SNO作为NO供体可调节血管张力，即NO的舒血管特性。在组织低氧环境，Hb变构，氧亲和力降低，释放氧同时去亚硝基化。Lancaster曾运用Fick氏第二扩散定律对血管壁中NO扩散性质进行分析[5]，认为血管中游离NO将被Hb捕获, 以致NO水平降至GC的Km值以下。如果血管局部产生的NO被血液Hb捕捉，就不表现出舒血管效应，那么，Hb-SNO在脱氧时释放NO就有重要意义。总之，激活GC的NO可能是局部产生的，也可以由Hb-SNO等供体释放，究竟哪种来源为主，可能依赖于血管类型。
RSNO较NO的半寿期长，且具有NO抗血小板粘附及聚集的效应。Mendelsohn等认为RSNO通过释放NO激活GC，引起血小板内cGMP水平升高，抑制人血小板粘附于纤维胶原蛋白和人内皮细胞，也降低大鼠体内ADP诱导的血小板聚集作用[6]。即RSNO具有防止血小板粘连聚集作用。GSNO的血小板抑制活性大于NO和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine, SNAP)，GSNO是目前有效的药用NO供体之一。
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RSNO曾被认为是非肾上腺能非胆碱能(NANC)神经的递质。Gibson和Barbier等报道GSNO是小鼠肛尾肌和大鼠胃底部NANC神经释放的递质[7,8]。NANC神经支配的平滑肌舒张作用能被NOS抑制剂阻断，然而能消除外源性NO舒张效应的NO捕捉剂对此无影响。如生成超氧离子的物质能灭活外源性NO，对NANC诱导的大鼠胃底部和小鼠肛尾肌的舒张作用没有影响。Liu等指出[9]RSNO可能参与阴茎勃起，也可能与调节支气管平滑肌张力有关。不过，RSNO直接作为NANC神经递质的观点未能被广泛接受。
3 RSNO的测定方法
3.1 RSNO的性质 RSNO水溶液在330～350nm和540～600nm有吸收峰[1,10]，利用光吸收特性可能来监测实验条件，RSNO生成或分解状态，也可用于定量分析。
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RSNO通过S-N键均裂产生NO和相应二硫化合物(RSSR)[10]。根据这一性质采用检测NO及其NO代谢产物(NO2—，NO3—)的一系列分析技术间接测定RSNO。不过，室温条件下RSNO水溶液比较稳定。用金属离子，如10-6mol/L铜离子能有效地加速RSNO分解。Dicks等认为发生有效催化作用的是Cu(Ⅰ)而不是Cu(Ⅱ)[11]。Gordge等报道[12]，选择性Cu(Ⅰ络合剂能降低RSNO抗血小板聚集作用。
可见光和紫外光(UV)也加速RSNO分解.。可见光引起GSNO释放NO，因此用于体外GSNO研究的生物材料应避光培养[13]。UV分解RSNO对分析测定RSNO极有意义，等基于UV分解-S-N键的特点，建立了一种有效的RSNO检测系统。
目前，RSNO的测定方法有直接测定法和间接测定法。一般而言，适合NO分析测定的方法可用于RSNO的间接测定，诸如化学发光法、NO2—与NO3—法、高铁血红蛋白法，电子自旋共振波谱法、电化学法等[14]，本文不再赘述。以下介绍几种直接测定RSNO的分析方法。
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3.2 光解-化学发光法[15](photolysis-chemilumi-nescence) 该方法建立在NO化学发光法基础之上，包括光解断裂S-NO键和化学发光法检测NO两个过程。样本通过HPLC或GC分离系统进入光分解器，利用UV(如365nm)使RSNO中的S-NO键均裂产生NO，NO随隋性气体进入化学发光仪与臭氧(O3)发生化学反应生成激发态NO2(NO2*)，后者以光子形式释放能量返回基态，采用敏感的光电倍增管检测该过程中光子发射强度，以此确定NO含量。
NO+O3→NO2*+O2
NO2*→NO2+hv
根据化学发光仪检测前是否经过光解作用可以区别游离NO与RSNO和其它的NO衍生物，该法检测下限为10-9mol/L，变异系数<2%，可以满足生理性和药理条件下细胞、血桨中的RSNO的测定。由于光解-化学发光法综合地利用了HPLC或GC的高分辨率，UV特异性断裂RSNO分子中S-N键、NO与O3高反应特异性和化学发光法的高灵敏度。所以，目前认为该方法是测定RSNO的最佳方法之一。
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3.3 荧光光谱法[11](spectrofluorometric method ) RSNO(如GSNO)水溶液(pH1)在334nm和544nm有吸收峰，但摩尔吸光系数极低，分别为890和16，检测灵敏度远不能满足生理水平需要。为了提高检测灵敏度，Gabor等利用“内滤光效应”(innerfilter effect)，采用荧光光谱法测定RSNO含量。RSNO本身无荧光性质，Gabor选用硫酸喹啉作为荧光剂，因为硫酸喹啉与RSNO在334nm有最大重迭吸收峰。硫酸喹啉与RSNO吸收334nm波长符合Lambert-Beer定律，所以两者吸收光的相对量可通过334nm波长处吸收系数比值确定。RSNO影响硫酸喹啉对激发光的吸收，导致其发射光(453nm)强度变化。即在一定条件下，RSNO含量越大，硫酸喹啉发射荧光强度越小。由于NO与RSH生成RSNO是化学计量反应，所以该方法既适合检测生理条件细胞和体液中NO含量，又适合RSNO(如GSNO)和硫醇(如谷胱苷肽)含量的测定。
3.4 高效毛细管电泳(high-performance capiuary electrophoresis, HPCE) HPCE技术以高分辨率、快速、微量为其特点，在分析多种体液中大小成份方面已显出独特的优势[16]，在高电压(10～30kV)条件，HPCE也适合分离分析硫醇及相应RSNO和二硫化物。但是，目前用HPCE分析RSNO，其灵敏度还未达到人体生理水平，另外，分析不同的硫醇衍生物需要调整电场条件和缓冲液pH值，故还不能同时用来分析硫醇衍生物[17]。所以，HPCE测定RSNO尚需要进一步改进。可以预计，随着HPCE自动分析仪的推广与应用，测定分析条件的不断完善，HPCE技术将会更好地用于RSNO的研究。
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*作者简介：周剑涛，男，44岁，本科，学士。现任副主任技师，主持黄冈市临床检验中心工作及从事生物化学、生物化学检验技术教学。
**湖北省黄冈市一医院检验科
参考文献
1 Butler AR, Rhodes P, Anal Biochem,1997;249:1-9
2 Stamler JC.Cell,1994;78:931-936
3 Jia L, Bonaventura C, Bonaventura J, et al.Nature,1996;380:221-226
4 Rubanyi GM, Johns A, Wilcox D, et al. J Cardiovasc Pharmacol,1991,17:S41-S45
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5 Lancaster JR, Proc Natl Acad Sci USA,1994;91:8137-8141
6 Radomski MW, Rees DD, Dutra A, et al.Br J Pharmacol,1992;107:745-749
7 Gibson A, Babbedge R, Brave SR, et al .Br J Pharmacol,1992;107:715-721
8 Barbier AJM, Lefebve RA. Eur J Pharmacol,891992;219:331-334
9 Liu X, Gillespie JS, Martin W.Br J Pharmacol, 1994:111:1287-1295
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10 Gabor G, Allon N. Anal Biochem,1994;220:16-19
11 Dicks AP. Swift HR, Williams DLH, et al. J Chem Soc Perkin Trans ,1996;2:481-487
12 Gordge MP, Meyer DJ, Hothersall J, et al.Br J Pharmacol ,1995;114:1083-1089
13 Sexton DJ. Muruganandam A, Mckenney DJ, et al .Photochem Photobiol,1994;59:463-467
14 王成彬,沈文梅,田亚平。国外医学临床生物化学与检验学分册,1996;17(4):176-178
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15 Alpert C, Ramdev N, George D, et al. Anal Biochem ,1997;245:1-7
16 张庆殷,李丽珍,邹雄。医学临床生物化学与检验学分册,1997;18(3):123-125
17 Stamler JS, Loscalzo J. Anal Chem ,1992;64:779-785
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校对：马海茸, 百拇医药