汉坦病毒(Hantavirus)研究进展
姚智慧(综述) 董关木(审校)
关键词： 汉坦病毒 汉坦病毒病 基因特征 基因重组
汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，在临床上引起肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征。自1978年李镐汪等从疫区的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来[1]，各国学者相继分离到不同型别的汉坦病毒。特别是1993年美国西部暴发流行致死性极高(50%)的汉坦病毒肺综合征[2]，引起了国际上的广泛重视。
1 新发现的汉坦病毒和汉坦病毒病
根据正式的病例报告表明汉坦病毒引起的汉坦病毒病在全球大部分地区均有发生，而通过血清流行病学和分子流行病学的调查证实了汉坦病毒在全球更广泛的分布。
, http://www.100md.com
肾综合征出血热临床上以发热、出血和肾损害为主要特征，它包括朝鲜出血热，流行性出血热和流行性肾病，每年在欧洲和亚洲有近10万病例发生。较早的报道可追溯到苏联在1913和1932年，日本军队1932在满洲里，瑞典在1934年的暴发流行[3]。引起肾综合征出血热的汉坦病毒包括汉坦病毒(HTNV)，汉城病毒(SEOV)，Dobrava-Belgrade病毒(DOBV)和Pumala病毒(PUUV)，分别引起重度，中度和轻度的临床症状。携带HTNV的黑线姬鼠主要在东亚到东欧，携带DOBV的黄颈喉姬鼠出现在南斯拉夫地区和其邻近地区，携带PUUV的欧洲棕背鼠 平存在于西北欧地区，而由褐家鼠携带的SEOV在世界范围内广泛存在[4，5]。1993年汉坦病毒肺综合征(HPS)首先在美国的四角地区暴发流行，临床上早期出现发热、寒战和肌痛，然后是突发性的呼吸阻塞，严重者导致死亡，引起了过半数病人的死亡，震惊了美国的公共卫生官员和病毒学家。随后的研究表明造成该病的病原是由鹿鼠携带的Sin Nombre virus(SNV)，其抗原性和基因特征完全不同于引起肾综合征出血热的汉坦病毒。而后又从美国的其它地区的HPS病人中分离到不同的病毒，包括白足鼠传播的New York virus(NYV)，棉鼠携带的Black Creek Canal virus(BCCV)，米鼠携带的Bayou virus(BAY)和Mononahela病毒[6～9]。同时在美国还分离到另外的5株未见引起HPS的病毒。1995年至1996年间，智利也出现了4例汉坦病毒引起的成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，1997年又有21人感染Andes virus(AND)13人死亡[10]。1996年末阿根廷暴发了由Andes virus(AND)导致的HPS流行，17人发病，9人死亡[11]。1993年至今已遍及美洲的啮齿类动物分离到至少20株病毒，其中的一半是HPS的致病病原[9]。南美其它地区如巴西，巴拉圭，玻利维亚，智利等国也相继报道了HPS病例的发生或流行[12～14]。迄今为止，美国已有29个州有HPS病例的发生或流行，确认的病例达到173例，北美超过250例，整个美洲地区病例已近500例，死亡率近45%[15]。
, 百拇医药
2 汉坦病毒人到人间的传播途径的证据
迄今，在HFRS及在美国发生的HPS中，尚未发现人-人传播现象，而近年在南美国家发现在HPS病人间存在此种现象，引起国内外极大兴趣和关注。
Vitek的最新报告表明存在人到人间新的传播途径的可能性。1996年9月22日至12月5日间，在阿根廷南部暴发了20例HPS。首发患者发病1个月内，其母亲和私人医生相继患病，1个月后医生的妻子也患了病，而后医生的妻子旅行到首都又传染了她的医生，由此引起了不断的传播。对第一例人病生活的地方的啮齿类动物调查表明，该地区为低啮齿类动物分布且未发现有动物感染病毒的证据。所发生的病例中有5个是内科医生，其中的3个直接参加了HPS病人的临床治疗。另外有2人除接触病人外未到过任何汉坦病毒污染的地区[16，17]。随后Paclula等人应用套式和半套式逆转录PCR病人的组织、血清或血液标本，比较了G1氨基酸末端G1a,G1可变区G1b和G2编码序列以及S片段3’末端的非编码区(NCR)的序列，结果表明，16个病例的G1a,G1b,G2和S片段的3’NCR的完全相同，而这些人均有密切接触史(同居、治疗、同旅行或夫妻关系等)。而远离该地区啮齿类动物感染病毒的序列分析表明，动物中的病毒与上述人感染的病毒不同[18]。
, http://www.100md.com
另外，智利南部一对已死亡的夫妻其两个孩子和1个侄子均患病。巴西的SNV感染的病例中两人同居一室密切接触染病而死亡。另1个例子是4岁的孩子得病后12天其母亲感染而死亡，而这些病例均无啮齿类动物接触史。
Bharadwaj等报道在智利首都附近1个14岁女孩在休假期间患HPS，但在她发病前未接触任何鼠类，而在治疗过程中使用吸痰器时，从痰样中检测到了特异性的Andes病毒的RNA，因此也认为可能有人-人间传播，并推测可能存在经口传播的可能性[19]。
以上的流行病学和直接的遗传学证据均强烈支持人到人的传播。数据表明可能存在3人和4人的传播链中仅有1个是啮齿类到人的传播，推测人到人的传播可能是通过非肠道的或经污染物，感染性的液滴(包括气溶胶)或性传播。
3 汉坦病毒抗原性和基因特征
, 百拇医药
汉坦病毒与布尼亚病毒科其它属病毒的主要区别在于其RNA分子3’端独特的保守序列(AUCAUCAUCUG)，构成了汉坦病毒的基因特征。汉坦病毒是单股负链RNA病毒含有L、M、S 3个基因片段，长度分是约6.5kb，3.6kb，1.7kb。三个基因片段均由单一的长开放读码框架(ORF)组成，分别以病毒RNA为膜板从3’-5’方向转录相对应的mRNA(3’-5’),然后翻译合成相对应的基因产物即病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(L)，包膜糖蛋白(G1和G2)，病毒核壳蛋白(NP)[20]。汉坦病毒的定性需通过抗原性和遗传学相结合方法来确证。空斑减少中和试验(PRNT)是区分汉坦病毒抗原性的最敏感的方法，根据已报道的资料，应用PRNT至少可将汉坦病毒分为9个血清型即HTN、SEO、PUU、Prospect Hill(PH)、DOB、Thailand、Thotta palayam(TPM)、SN和BCC病毒[21，22]。通过遗传学的方法可将汉坦病毒分为至少15个型别，即除PRNT的9个血清型外还有Khabarovsk(KHB)、Tula(TUL)、New York(NY)、E1 Moro Canyon(ELMC)、Bayou(BAY)、Andes(AND)6个型(见表1)。汉坦病毒间的遗传学关系反应了其抗原特性，虽很难确定其遗传学和抗原性的直接关系，但PRNT可以测定M片段基因产物即G1和G2包膜蛋白的差异。比较推测的G1和G2氨基酸序列可以提供汉坦病毒间抗原性和遗传学差异的线索[3]。
, 百拇医药
表1汉坦病毒血清型和基因型
基因型
血清
型
引发的
疾病
代表株
宿主
地理分布
Hantaan
(HTN)
HTN
HFRS
, http://www.100md.com
76-118,Z10
A9,HV-114
Apodemus agrtarius
中国、俄罗斯、朝鲜
Seoul
(SEO)
SEO
HFRS
HR8039
R22,SR-11
Rattus norvegicus
世界范围
, 百拇医药
Puumala
(PUU)
PUU
HFRS
CG1820
K27
Clethrionomys
glareolus
欧洲、俄罗斯、斯堪的纳维亚
Dobrava-
Belgrade(DOB)
DOB
, http://www.100md.com
HFRS
Plitvice
Fojnica
Apodemus
flavicollis
巴尔干地区
Thailand
(THAI)
THAI
nd
749
Bandicota
, 百拇医药
indica
泰国
Prospect
hill(PH)
PH
nd
PHV-1
Microtus
pennsylvanicus
美国、加拿大
Khabarovsk
KHB
, 百拇医药
nd
MF-43
Microtus fortis
俄罗斯
Thottapalayam(TPM)
TPM
nd
TPMV
Suncus murinus
印度
Tula
(TUL)
, 百拇医药
TUL
nd
Moravia
Microtus arvalis
欧洲
Sin Nombre
(SN)
SN
HPS
NMh10
Peromyscus maniculatus
美国、加拿大、墨西哥
, http://www.100md.com
New York
(NY)
NY
HPS
NY-1
Peromyscus
leucopus
美国
Black Creek
Canal(BCC)
BCC
HPS
, 百拇医药 BCCV
Sigmodon
hispidus
美国
E1 Moro Canyon(ELMC)
ELMC
nd
RM-97
Reithrodontomys
megalotis
美国、墨西哥
Bayou
, 百拇医药
(BAY)
BAY
HPS
Bayou
Oryzomys
palustris
美国
Andes
(AND)
AND
HPS
Andes
Oligoryzomys
, 百拇医药
Longicaudatus
阿根廷
nd:None described
4 汉坦病毒致病性的分子基础
宿主的HLA基因与疾病谱的关系近年来受到学者们的重视。Mustouen 等人的研究表明带有HLA-B8基因的人引发更严重的疾病如更低的血压，更高的肌酸[23]，Plyusnin用PCR还证实其尿液中有更多的病毒存在[24]。而带有HLA-B27基因的人仅引起中度的疾病。应用PFLP方法研究了肾中有TNF-α表达的感染病人的TNF1和2等位基因(-308和-238位)表明HLA-A1-B8-DR3单元型基因与其有关。TNF2等位基因与高水平的TNF产生以及与病人随之发生的休克有关。由于HLA-A1-B8-DR3 MHC单元型与胰岛素依赖型的糖尿病和其它病毒源性的自动免疫性疾病相关联，由此认为分子模拟也许可以解释这一单元型与PUUV感染的肾病相关[25]。
, http://www.100md.com
M.Frese 等应用含表达MxA的Vero细胞与HTNV共感染，结果表明，在病毒复制的早期MxA蛋白抑制了病毒蛋白的合成。而应用PUUV分别对含表达MxA的U-937细胞和含表达MxA的Vero细胞进一步研究表明含表达的U-P37细胞无明显的抗病毒作用而含表达MxA的Vero细胞则具有抗病毒的作用，这一结果说明MxA蛋白的抗病毒作用可依宿主的不同而不同[26]。
Gavrilovskaya 等应用整联蛋白(integrins)转染的细胞系定量测定SNV，NY-1和PHV病毒感染，结果含有αⅡbβ3或αvβ3整联蛋白的CHO和CHO-VNRC细胞均可引起致病性的SNV，NY-1感染增强，而对非感染性的PHV则无病毒感染细胞的增加，表明含 αⅡbβ3或αvβ3整联蛋白介导致病性的SNV，NY-1病毒的细胞进入。进一步试验显示β3整联蛋白抗体，配体，玻连蛋白(vitronectin)可以抑制SNV，NY-1病毒，而PHV不能被β3特异性抗体和玻连蛋白抑制却可被β1特异性抗体和纤连蛋白(fibronectin)抑制，表明致病性和非致病性的汉坦病毒应用不同的整联蛋白进入细胞。但PHV并不感染α3β1和α5β1的CHO细胞，因此PHV也许依赖其它未存在于CHO细胞中的α整联蛋白亚单位或其它细胞表面蛋白。再进一步的研究表明，病毒进入细胞不依赖于二价阳离子，不能被精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸肽所阻断，而是被配体结合缺陷的αⅡbβ3整联蛋白的突变所介导，因此SNV，NY-1病毒进入细胞不依赖于β3整联蛋白结合于其生理配体。这些结果表明整联蛋白是汉坦病毒的细胞受体，汉坦病毒的致病性与整联蛋白的应用相关[27]。
, 百拇医药
5 汉坦病毒基因重组及其应用
5.1 噬菌体肽库技术于抗原表位分析的应用 噬菌体肽库技术是将外源肽和蛋白质基因插入改造过的噬菌体载体中，通过亲和法筛选使含外源基因的噬菌体得到千、万倍的富集，表达具有良好生物学活性的外源肽或蛋白质，明确其氨基酸序列，从而应用于病毒蛋白质结构分析，抗原表位分析，受体研究以及抗病毒多肽药的筛选。Heiskanen等将此技术应用于PUUV中和位点的分析[28]。他们从7氨基酸肽库中应用抗糖蛋白G2特异性单抗4G2，1C9，分别竞争性的筛选出具有与单抗结合位点相同的，模拟抗体功能的3组14种和1组3种多肽，序列分析表明，第六位的脯氨酸是抑制病毒所必需，而第二位的色氨酸和第四位的苯丙氨酸为结合位点所必需。通过序列同源性分析还发现，这些肽与某些人体，鼠源或牛源的蛋白序列有同源性，为研究汉坦病毒与受体细胞作用的分子机理提供了可能。
5.2 噬菌体显示文库技术筛选抗汉坦病毒的单抗 噬菌体显示文库技术可以用作筛选鼠源或人源单抗。Salonen等[29]将血清中含PUU抗体的病人脾细胞cDNA文库扩增的轻重链基因重组到噬菌体显示载体，用特异性重组抗原或纯化病毒抗原筛选出可表达糖蛋白和核蛋白特异Fab片段的噬菌体显示文库，包括7个核蛋白特异和1个糖蛋白G2特异的Fab片段。7个核蛋白特异的Fab片段中，2个仅与PUU反应，3个可与TUL、SN、PH、KHB呈交叉反应，而与DOB、SEO、HTN无反应，另外2个与所用的8个型病毒均无反应，表明核蛋白上至少有3组不同的抗原表位，从而可用于汉坦病毒的诊断和抗原分型。
, 百拇医药
5.3 核蛋白表达及其在诊断中的应用 核蛋白是汉坦病毒最主要的结构蛋白，其在宿主体内的表达量最高，现已将其插入到多种基因表达系统，包括原核，真核，病毒载体以及昆虫细胞表达系统中表达，得到了有强特异性的抗原，并用之于建立多种血清学方法应用于临床诊断。将HTN和PUU全S片段编码基因在大肠杆菌表达，将PUU全S片段编码基因克隆于杆状病毒系统并在其插入细胞中高效表达，纯化后的产物均可用以测定不同来源的病人血清中的IgG和IgM抗体[30～33]。Elgh等人将翻译汉坦病毒S片段1到117氨基酸的基因(Ns)在大肠杆菌表达。氨基酸序列比较表明HTN、SEO、DOB间的Ns及PUU和SN间的Ns同源率较高，而HTN，SEO和DOB与PUU和SN间Ns同源率则较低。纯化的产物应用于ELISA方法检测不同地区不同病毒来源的血清，结果对高同源的病毒有高滴度的反应，对低同源的病毒则为低滴度的反应[34]。M.Morii等人将翻译HTN和SEOS片段155到429氨基酸的基因在杆状病毒载体系统中表达，Western blot显示了型特异性的结果，而用IFA方法可以确证恢复期的血清，但相对于用全核蛋白来讲抗体滴度为低[35]。这些结果表明基因表达的抗原可以作为汉坦病毒临床快速简便诊断用的抗原，尤其是依据氨基酸差异较大的短片段设计的表达产物可用作汉坦病毒的型别确定。Sjolander等人比较了天然的、大肠杆菌、杆状病毒分别表达的全S片段和N末端截短了的基因产物在临床诊断时的差异[36]，结果显示以天然的、大肠杆菌、杆状病毒的表达全S片段产物为抗原的抗μ链ELISA方法与用大肠杆菌表达的全S片段产物固相吸收方法检测具有同样的高敏感和高特异，而基于N末端截短了的基因表达产物敏感性则较低。在测定PUU特异性IgG时，单克隆抗体捕获的天然和杆状病毒表达的全S片段产物ELISA方法具有高敏感和高特异性，而大肠杆菌表达全S片段产物不能检测所有的标本，其截短了的N末端大肠杆菌表达产物比之其它抗原敏感性明显为低。
, 百拇医药
5.4 重组疫苗研究 目前已完成了103株汉坦病毒的S和M及L片段共138个全飘基因序列测定，已将目的基因插入到不同的载体中得到有效表达。这是研究汉坦病毒重组疫苗的前提和关键所在。Schmaljohn等人将76-118的S和M基因插入到痘苗病毒载体和杆状病毒[37]。用杆状病毒表达的产物免疫动物结果表明全M片段的重组体不仅可测到中和抗体而且对病毒的攻击有保护作用，而表达部分M片段的重组体测不到中和抗体，但对病毒的攻击有部分保护作用；NP的表达产物尽管无中和抗体但确有保护作用，同时还说明含有全部结构蛋白基因可产生最好的保护作用。含S和M的痘苗病毒重组体在动物中也有类似的反应，接种人体后有一定的保护作用。最近，Ulrich等人将PUUV的S片段的N端1-45，38-82或75-119位氨基酸对应的核苷酸片段插入到含有HBV核心颗粒载体中制备嵌合体[38]，只有表达1-45位氨基酸的嵌合体免疫动物后有80%的动物得到保护，提示NP蛋白的主要保护区位于1-45位氨基酸。
上述表明，汉坦病毒的研究已取得许多突破性进展，然而由于汉坦病毒的多变异性，新的型别不断的发现，特别是HPS类伴高死亡率，而对该病尚无特效的治疗药物，给该病的预防和治疗提出了一个又一个新的课题。近年来，分子生物学的飞速发展，给病毒学的研究带来了质的飞跃，我们有理由相信，在今后不长的时间内，通过对汉坦病毒与人类宿主基因关系的研究将会得到有效的抗汉坦病毒基因工程药物，而应用感染性克隆，基因重排，基因嵌合等技术将有可能成功研究用于预防汉坦病毒的基因工程疫苗。
, http://www.100md.com
作者单位：中国药品生物制品检定所(北京，100050)
参考文献
1.Lee H,Lee P,Johnson K.lsolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic feve.J infect Dis,1978,137:298.
2.Nichol ST,Speropoulou CF,Morzunov S,et al.Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness.Science,1993,262:914.
3.Schmaljohn C and Hjelle B.Hantavirses:a global disease problem.Emerging Infectious Disease,1997,3(2):95.
, http://www.100md.com
4.Hjelle B.Frequently-asked-questions about hanta virus pulmonary syndrome and hemorrhagic fever with renal syndrome.1996.
5.Clement C,Heyman P,Mckenna P,et al.The hantaviruses of Europe:from the bedside to bench.Emerging Infectious Disease,1997,3(2):205.
6.Hjelle B,Lee SW,Song W,et al.Molecular linkage of hantavirus pulmonary syndrome to the white-footed mouse,Peromyscus leucopus:genetic characterization of the M genome of New York virus,J Med Virol,1995,46:35.
, 百拇医药
7.Rollin PE,Ksiazek TG,Elliott LH,et al.lsolation of Black Creek Canal virus,a new hantavirus from Sigmodon hispidus in Florida.J Med Virol,1995,69(12):8137.
8.Torrez-Martinez N,Bharadwaj M,Goade D,et al.Bayou virus-associated hantavirus pulmonary syndrome in eastern Texas:Identification of the Rice Rat,Oryzomys palustris,as reservoir host,Emerging Infectious Disease,1998,4(1):105.
9.Mills JN and Childs JE.Ecologic studies of rodent reservoirs:Their relevance for human health,Emerging lnfectious Disease,1998,4(4):525.
, 百拇医药
10.CDC.Hantavirus pulmonary syndrome-Chile.MMWR 1997,46(40):949.
11.Lopez N,Padula P,Rossi C,et al.Genetic identification of a new hantavirus causing severe pulmonary syndrome in Argentina.Virology,1996,220:223.
12.Zaparoli MA,Lversson LB,Rosa MD,et al.Investigation on case-contacts of human disease caused by hantavirus in Juquitiba,state of Sao Paulo,Brazil,Am J Trop Med Hyg ,1995,53(suppl):232.
, 百拇医药
13.Williams MA,Bryan RT,Mills JN,et al.An outbreak of hantavirus pulmonary syndrome among Mennonite colonies in western Paraguay.Am J Trop Med Hyg,1997,57:277.
14.Espinoza R,Vial P,Noriega LM,et al.Hantavirus pulmonary syndrome in a Chilean patient with recent travel in Bolivia.Emerging Infectious Disease,1998,4(1):93.
15.Childs J,Shope RE,Fish D,et al.Emerging zoonoses,Emerging Infectious Disease,1998,4(3):453.
, 百拇医药
16.Vitek CR,Breiman RF,Ksiazek TG,et al.Evidence against person-to-peson transmission of hantavirus to health care workers.Clin Infect Dis,1996,22:824.
17.Wells RM,Estani SS,Yadon ZE,et al.A unusual hantavirus outbreak in Southern Argentina:person-to-person transmission?Emerging Infectious Disease,1997,3(2):171.
18.Padula PJ,Edelstein A,Miguel SDL,et al.Hantavirus pulmonary syndrome outbreak in Argentina:molecular evidence for person-to-person transmission of Andes virus,Virology,1998,241:323.
, http://www.100md.com
19.Bharadwaj M,Vial P,Botten J,et al.Andes vrus-associated HPS in Chile:Presence of viral RNA in Tracheal aspirate suggests potential route for interpersonal transmission.The fouth international conference on HFRS and hantaviruses,USA,170.
20.Yanagihara R and Gajdusek.Hemorrhagic fever with renal syndrome:A historical perspective and review of recent advances,Handbook of viral and Rickettsial hemorrhagic fevers.CRC press,1988,155.
, http://www.100md.com
21.Chu YK,Rossi C,LeDuc J,et al.Serological relationships among viruses in the hantavirus genus,family Bunyaviridae.Virology,1994,198:196.
22.Chu YK,Jennings G,Schmaljohn A,et al.Cross-neutralization of hantaviruses with immune sera from e-xperimentally-infected animal and from hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome patients.J Infect Dis,1995,172:1581.
23.Mustonen J,Partanen J,Kanerva M,et al.Association of HLA B27 with benign clinical course of nephopathia epidemica cause by puumala hantavirus,Scand J lmmunol,1998,47(3):277.
, 百拇医药
24.Plyusnin A,Horling J,Kanerva M,et al.Puumala Hantavirus genome in patients with nephropathia epidemica:Correlation of PCR positivity with HLA haplotype and link to viral sequences in local rodents,J Clin Microbiol,1997,35(5):1090.
25.Mcnicholl J.Host genes and infectious diseases,Emerging Infectious diseases,Emerging Infectious Disease,1998,4(3):423.
26.Frese M,Kochs G,Feldmann H,et al.Inhibition of Bunyavirus,Phleboviruses,and Hantaviruses by human MxA rpotein,Journal of Virology,1996,70(2):915.
, 百拇医药
27.Gavrilovskaya IN,Shepley M,Shaw R,et al:β3 integrins mediate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure,Proc Natl Acad Sci,1998,95:7074.
28.Heiskanen T,Lundkvist A,Vaheri A,et al.Phage-displayed peptide targeting on puumala hantavirus neutralization site.J Virol,1997,71(5):3879.
29.Salanen EM,Parren PWHI,Graus YF,et al.Human recombinant puumala virus antibodies:cross-reaction with other hantavirus and use in diagnostics.J Gen Virol,1998,79:659.
, 百拇医药
30.Zoller L,Yang S,Gott P，et al.Use of recombinant nucleocapsid proteins of the hantaan and nephropathia epidemica serotypes of hantaviruses as immunodiagnostic antigens,Journal of Medical Virology,1993,39:200.
31.Kallio-Kokko H,Vapalahti O,Hedman K,et al.Puumala virus antibody and immunoglobulin G avidity assays based on a recombinant nucleocapsid antigen.J Clin Microbiol,1993,31(3):677.
32.Vapalahti O,Lundkvist A,Kallio-Kokko H,et al.Antigenic properties and diagnostic potential of puumala virus nucleocapsid protein expressed in insect cells.J Clin Microbiol,1996,34(1):119.
, http://www.100md.com
33.Kallio-Kokko H,Vapalahti O,Lundkvist A,et al.Evaluation of puumala virus IgG and IgM Enzyme immunoassays based on recombinant baculovirus-expressed nucleocapsid protein for early nephropathia epidemica diagnosis.Clin Diagn Virol,1998,10(1):83.
34.Elgh F,Lundkvist A,Alexeyev OA,et al:Serological diagnosis of hantavirus infections by an enzyme-linked imunosorbent assay based on detection of immnoglobulin G and M responses to recombinant nucleocapsid proteins of five viral serotypes,Journal of Clinical Microbiology,1997,35(5):1122.
, http://www.100md.com
35.Morii M,Yoshimatsu K,Arikawa J,et al:Antigenic characterization of hantaan and seoul virus nucleocapsid proteins expressed by recombinant baculovirs:Application of a truncated protein,lacking an antigenic region common to the two viruses,as a serotyping antigen,Journal of Clinical Microbiology,1998,36(9):2514.
36.Sjolander KB,Elgh F,Kallio-Kokko H,et al.Evaluation of serological methods for diagnosis of puumala hantavirus infection(nephropathia epidemica).J Clin Microbiol,1997,35(12):3264.
, 百拇医药
37.Schmajion CS,Darrymple JM,McClain D,et al.Expressed antigens of hantaviruses as potential vaccines for hemorrhagic fever with renal syndrome,in Modern Vaccinology(Edi Kustak).Plenum Medical press,New York,1994:253.
38.Ulrich R,Lundkvist A,Meisel H,et al.Chimaeric HBV core particles carrying a defined segment of puumala hantavirus nucleocapsid protein evoke protective immunity in an animal model.Vaccine,1997,16(2/3):272., 百拇医药
关键词： 汉坦病毒 汉坦病毒病 基因特征 基因重组
汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，在临床上引起肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征。自1978年李镐汪等从疫区的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来[1]，各国学者相继分离到不同型别的汉坦病毒。特别是1993年美国西部暴发流行致死性极高(50%)的汉坦病毒肺综合征[2]，引起了国际上的广泛重视。
1 新发现的汉坦病毒和汉坦病毒病
根据正式的病例报告表明汉坦病毒引起的汉坦病毒病在全球大部分地区均有发生，而通过血清流行病学和分子流行病学的调查证实了汉坦病毒在全球更广泛的分布。
, http://www.100md.com
肾综合征出血热临床上以发热、出血和肾损害为主要特征，它包括朝鲜出血热，流行性出血热和流行性肾病，每年在欧洲和亚洲有近10万病例发生。较早的报道可追溯到苏联在1913和1932年，日本军队1932在满洲里，瑞典在1934年的暴发流行[3]。引起肾综合征出血热的汉坦病毒包括汉坦病毒(HTNV)，汉城病毒(SEOV)，Dobrava-Belgrade病毒(DOBV)和Pumala病毒(PUUV)，分别引起重度，中度和轻度的临床症状。携带HTNV的黑线姬鼠主要在东亚到东欧，携带DOBV的黄颈喉姬鼠出现在南斯拉夫地区和其邻近地区，携带PUUV的欧洲棕背鼠 平存在于西北欧地区，而由褐家鼠携带的SEOV在世界范围内广泛存在[4，5]。1993年汉坦病毒肺综合征(HPS)首先在美国的四角地区暴发流行，临床上早期出现发热、寒战和肌痛，然后是突发性的呼吸阻塞，严重者导致死亡，引起了过半数病人的死亡，震惊了美国的公共卫生官员和病毒学家。随后的研究表明造成该病的病原是由鹿鼠携带的Sin Nombre virus(SNV)，其抗原性和基因特征完全不同于引起肾综合征出血热的汉坦病毒。而后又从美国的其它地区的HPS病人中分离到不同的病毒，包括白足鼠传播的New York virus(NYV)，棉鼠携带的Black Creek Canal virus(BCCV)，米鼠携带的Bayou virus(BAY)和Mononahela病毒[6～9]。同时在美国还分离到另外的5株未见引起HPS的病毒。1995年至1996年间，智利也出现了4例汉坦病毒引起的成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，1997年又有21人感染Andes virus(AND)13人死亡[10]。1996年末阿根廷暴发了由Andes virus(AND)导致的HPS流行，17人发病，9人死亡[11]。1993年至今已遍及美洲的啮齿类动物分离到至少20株病毒，其中的一半是HPS的致病病原[9]。南美其它地区如巴西，巴拉圭，玻利维亚，智利等国也相继报道了HPS病例的发生或流行[12～14]。迄今为止，美国已有29个州有HPS病例的发生或流行，确认的病例达到173例，北美超过250例，整个美洲地区病例已近500例，死亡率近45%[15]。
, 百拇医药
2 汉坦病毒人到人间的传播途径的证据
迄今，在HFRS及在美国发生的HPS中，尚未发现人-人传播现象，而近年在南美国家发现在HPS病人间存在此种现象，引起国内外极大兴趣和关注。
Vitek的最新报告表明存在人到人间新的传播途径的可能性。1996年9月22日至12月5日间，在阿根廷南部暴发了20例HPS。首发患者发病1个月内，其母亲和私人医生相继患病，1个月后医生的妻子也患了病，而后医生的妻子旅行到首都又传染了她的医生，由此引起了不断的传播。对第一例人病生活的地方的啮齿类动物调查表明，该地区为低啮齿类动物分布且未发现有动物感染病毒的证据。所发生的病例中有5个是内科医生，其中的3个直接参加了HPS病人的临床治疗。另外有2人除接触病人外未到过任何汉坦病毒污染的地区[16，17]。随后Paclula等人应用套式和半套式逆转录PCR病人的组织、血清或血液标本，比较了G1氨基酸末端G1a,G1可变区G1b和G2编码序列以及S片段3’末端的非编码区(NCR)的序列，结果表明，16个病例的G1a,G1b,G2和S片段的3’NCR的完全相同，而这些人均有密切接触史(同居、治疗、同旅行或夫妻关系等)。而远离该地区啮齿类动物感染病毒的序列分析表明，动物中的病毒与上述人感染的病毒不同[18]。
, http://www.100md.com
另外，智利南部一对已死亡的夫妻其两个孩子和1个侄子均患病。巴西的SNV感染的病例中两人同居一室密切接触染病而死亡。另1个例子是4岁的孩子得病后12天其母亲感染而死亡，而这些病例均无啮齿类动物接触史。
Bharadwaj等报道在智利首都附近1个14岁女孩在休假期间患HPS，但在她发病前未接触任何鼠类，而在治疗过程中使用吸痰器时，从痰样中检测到了特异性的Andes病毒的RNA，因此也认为可能有人-人间传播，并推测可能存在经口传播的可能性[19]。
以上的流行病学和直接的遗传学证据均强烈支持人到人的传播。数据表明可能存在3人和4人的传播链中仅有1个是啮齿类到人的传播，推测人到人的传播可能是通过非肠道的或经污染物，感染性的液滴(包括气溶胶)或性传播。
3 汉坦病毒抗原性和基因特征
, 百拇医药
汉坦病毒与布尼亚病毒科其它属病毒的主要区别在于其RNA分子3’端独特的保守序列(AUCAUCAUCUG)，构成了汉坦病毒的基因特征。汉坦病毒是单股负链RNA病毒含有L、M、S 3个基因片段，长度分是约6.5kb，3.6kb，1.7kb。三个基因片段均由单一的长开放读码框架(ORF)组成，分别以病毒RNA为膜板从3’-5’方向转录相对应的mRNA(3’-5’),然后翻译合成相对应的基因产物即病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(L)，包膜糖蛋白(G1和G2)，病毒核壳蛋白(NP)[20]。汉坦病毒的定性需通过抗原性和遗传学相结合方法来确证。空斑减少中和试验(PRNT)是区分汉坦病毒抗原性的最敏感的方法，根据已报道的资料，应用PRNT至少可将汉坦病毒分为9个血清型即HTN、SEO、PUU、Prospect Hill(PH)、DOB、Thailand、Thotta palayam(TPM)、SN和BCC病毒[21，22]。通过遗传学的方法可将汉坦病毒分为至少15个型别，即除PRNT的9个血清型外还有Khabarovsk(KHB)、Tula(TUL)、New York(NY)、E1 Moro Canyon(ELMC)、Bayou(BAY)、Andes(AND)6个型(见表1)。汉坦病毒间的遗传学关系反应了其抗原特性，虽很难确定其遗传学和抗原性的直接关系，但PRNT可以测定M片段基因产物即G1和G2包膜蛋白的差异。比较推测的G1和G2氨基酸序列可以提供汉坦病毒间抗原性和遗传学差异的线索[3]。
, 百拇医药
表1汉坦病毒血清型和基因型
基因型
血清
型
引发的
疾病
代表株
宿主
地理分布
Hantaan
(HTN)
HTN
HFRS
, http://www.100md.com
76-118,Z10
A9,HV-114
Apodemus agrtarius
中国、俄罗斯、朝鲜
Seoul
(SEO)
SEO
HFRS
HR8039
R22,SR-11
Rattus norvegicus
世界范围
, 百拇医药
Puumala
(PUU)
PUU
HFRS
CG1820
K27
Clethrionomys
glareolus
欧洲、俄罗斯、斯堪的纳维亚
Dobrava-
Belgrade(DOB)
DOB
, http://www.100md.com
HFRS
Plitvice
Fojnica
Apodemus
flavicollis
巴尔干地区
Thailand
(THAI)
THAI
nd
749
Bandicota
, 百拇医药
indica
泰国
Prospect
hill(PH)
PH
nd
PHV-1
Microtus
pennsylvanicus
美国、加拿大
Khabarovsk
KHB
, 百拇医药
nd
MF-43
Microtus fortis
俄罗斯
Thottapalayam(TPM)
TPM
nd
TPMV
Suncus murinus
印度
Tula
(TUL)
, 百拇医药
TUL
nd
Moravia
Microtus arvalis
欧洲
Sin Nombre
(SN)
SN
HPS
NMh10
Peromyscus maniculatus
美国、加拿大、墨西哥
, http://www.100md.com
New York
(NY)
NY
HPS
NY-1
Peromyscus
leucopus
美国
Black Creek
Canal(BCC)
BCC
HPS
, 百拇医药 BCCV
Sigmodon
hispidus
美国
E1 Moro Canyon(ELMC)
ELMC
nd
RM-97
Reithrodontomys
megalotis
美国、墨西哥
Bayou
, 百拇医药
(BAY)
BAY
HPS
Bayou
Oryzomys
palustris
美国
Andes
(AND)
AND
HPS
Andes
Oligoryzomys
, 百拇医药
Longicaudatus
阿根廷
nd:None described
4 汉坦病毒致病性的分子基础
宿主的HLA基因与疾病谱的关系近年来受到学者们的重视。Mustouen 等人的研究表明带有HLA-B8基因的人引发更严重的疾病如更低的血压，更高的肌酸[23]，Plyusnin用PCR还证实其尿液中有更多的病毒存在[24]。而带有HLA-B27基因的人仅引起中度的疾病。应用PFLP方法研究了肾中有TNF-α表达的感染病人的TNF1和2等位基因(-308和-238位)表明HLA-A1-B8-DR3单元型基因与其有关。TNF2等位基因与高水平的TNF产生以及与病人随之发生的休克有关。由于HLA-A1-B8-DR3 MHC单元型与胰岛素依赖型的糖尿病和其它病毒源性的自动免疫性疾病相关联，由此认为分子模拟也许可以解释这一单元型与PUUV感染的肾病相关[25]。
, http://www.100md.com
M.Frese 等应用含表达MxA的Vero细胞与HTNV共感染，结果表明，在病毒复制的早期MxA蛋白抑制了病毒蛋白的合成。而应用PUUV分别对含表达MxA的U-937细胞和含表达MxA的Vero细胞进一步研究表明含表达的U-P37细胞无明显的抗病毒作用而含表达MxA的Vero细胞则具有抗病毒的作用，这一结果说明MxA蛋白的抗病毒作用可依宿主的不同而不同[26]。
Gavrilovskaya 等应用整联蛋白(integrins)转染的细胞系定量测定SNV，NY-1和PHV病毒感染，结果含有αⅡbβ3或αvβ3整联蛋白的CHO和CHO-VNRC细胞均可引起致病性的SNV，NY-1感染增强，而对非感染性的PHV则无病毒感染细胞的增加，表明含 αⅡbβ3或αvβ3整联蛋白介导致病性的SNV，NY-1病毒的细胞进入。进一步试验显示β3整联蛋白抗体，配体，玻连蛋白(vitronectin)可以抑制SNV，NY-1病毒，而PHV不能被β3特异性抗体和玻连蛋白抑制却可被β1特异性抗体和纤连蛋白(fibronectin)抑制，表明致病性和非致病性的汉坦病毒应用不同的整联蛋白进入细胞。但PHV并不感染α3β1和α5β1的CHO细胞，因此PHV也许依赖其它未存在于CHO细胞中的α整联蛋白亚单位或其它细胞表面蛋白。再进一步的研究表明，病毒进入细胞不依赖于二价阳离子，不能被精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸肽所阻断，而是被配体结合缺陷的αⅡbβ3整联蛋白的突变所介导，因此SNV，NY-1病毒进入细胞不依赖于β3整联蛋白结合于其生理配体。这些结果表明整联蛋白是汉坦病毒的细胞受体，汉坦病毒的致病性与整联蛋白的应用相关[27]。
, 百拇医药
5 汉坦病毒基因重组及其应用
5.1 噬菌体肽库技术于抗原表位分析的应用 噬菌体肽库技术是将外源肽和蛋白质基因插入改造过的噬菌体载体中，通过亲和法筛选使含外源基因的噬菌体得到千、万倍的富集，表达具有良好生物学活性的外源肽或蛋白质，明确其氨基酸序列，从而应用于病毒蛋白质结构分析，抗原表位分析，受体研究以及抗病毒多肽药的筛选。Heiskanen等将此技术应用于PUUV中和位点的分析[28]。他们从7氨基酸肽库中应用抗糖蛋白G2特异性单抗4G2，1C9，分别竞争性的筛选出具有与单抗结合位点相同的，模拟抗体功能的3组14种和1组3种多肽，序列分析表明，第六位的脯氨酸是抑制病毒所必需，而第二位的色氨酸和第四位的苯丙氨酸为结合位点所必需。通过序列同源性分析还发现，这些肽与某些人体，鼠源或牛源的蛋白序列有同源性，为研究汉坦病毒与受体细胞作用的分子机理提供了可能。
5.2 噬菌体显示文库技术筛选抗汉坦病毒的单抗 噬菌体显示文库技术可以用作筛选鼠源或人源单抗。Salonen等[29]将血清中含PUU抗体的病人脾细胞cDNA文库扩增的轻重链基因重组到噬菌体显示载体，用特异性重组抗原或纯化病毒抗原筛选出可表达糖蛋白和核蛋白特异Fab片段的噬菌体显示文库，包括7个核蛋白特异和1个糖蛋白G2特异的Fab片段。7个核蛋白特异的Fab片段中，2个仅与PUU反应，3个可与TUL、SN、PH、KHB呈交叉反应，而与DOB、SEO、HTN无反应，另外2个与所用的8个型病毒均无反应，表明核蛋白上至少有3组不同的抗原表位，从而可用于汉坦病毒的诊断和抗原分型。
, 百拇医药
5.3 核蛋白表达及其在诊断中的应用 核蛋白是汉坦病毒最主要的结构蛋白，其在宿主体内的表达量最高，现已将其插入到多种基因表达系统，包括原核，真核，病毒载体以及昆虫细胞表达系统中表达，得到了有强特异性的抗原，并用之于建立多种血清学方法应用于临床诊断。将HTN和PUU全S片段编码基因在大肠杆菌表达，将PUU全S片段编码基因克隆于杆状病毒系统并在其插入细胞中高效表达，纯化后的产物均可用以测定不同来源的病人血清中的IgG和IgM抗体[30～33]。Elgh等人将翻译汉坦病毒S片段1到117氨基酸的基因(Ns)在大肠杆菌表达。氨基酸序列比较表明HTN、SEO、DOB间的Ns及PUU和SN间的Ns同源率较高，而HTN，SEO和DOB与PUU和SN间Ns同源率则较低。纯化的产物应用于ELISA方法检测不同地区不同病毒来源的血清，结果对高同源的病毒有高滴度的反应，对低同源的病毒则为低滴度的反应[34]。M.Morii等人将翻译HTN和SEOS片段155到429氨基酸的基因在杆状病毒载体系统中表达，Western blot显示了型特异性的结果，而用IFA方法可以确证恢复期的血清，但相对于用全核蛋白来讲抗体滴度为低[35]。这些结果表明基因表达的抗原可以作为汉坦病毒临床快速简便诊断用的抗原，尤其是依据氨基酸差异较大的短片段设计的表达产物可用作汉坦病毒的型别确定。Sjolander等人比较了天然的、大肠杆菌、杆状病毒分别表达的全S片段和N末端截短了的基因产物在临床诊断时的差异[36]，结果显示以天然的、大肠杆菌、杆状病毒的表达全S片段产物为抗原的抗μ链ELISA方法与用大肠杆菌表达的全S片段产物固相吸收方法检测具有同样的高敏感和高特异，而基于N末端截短了的基因表达产物敏感性则较低。在测定PUU特异性IgG时，单克隆抗体捕获的天然和杆状病毒表达的全S片段产物ELISA方法具有高敏感和高特异性，而大肠杆菌表达全S片段产物不能检测所有的标本，其截短了的N末端大肠杆菌表达产物比之其它抗原敏感性明显为低。
, 百拇医药
5.4 重组疫苗研究 目前已完成了103株汉坦病毒的S和M及L片段共138个全飘基因序列测定，已将目的基因插入到不同的载体中得到有效表达。这是研究汉坦病毒重组疫苗的前提和关键所在。Schmaljohn等人将76-118的S和M基因插入到痘苗病毒载体和杆状病毒[37]。用杆状病毒表达的产物免疫动物结果表明全M片段的重组体不仅可测到中和抗体而且对病毒的攻击有保护作用，而表达部分M片段的重组体测不到中和抗体，但对病毒的攻击有部分保护作用；NP的表达产物尽管无中和抗体但确有保护作用，同时还说明含有全部结构蛋白基因可产生最好的保护作用。含S和M的痘苗病毒重组体在动物中也有类似的反应，接种人体后有一定的保护作用。最近，Ulrich等人将PUUV的S片段的N端1-45，38-82或75-119位氨基酸对应的核苷酸片段插入到含有HBV核心颗粒载体中制备嵌合体[38]，只有表达1-45位氨基酸的嵌合体免疫动物后有80%的动物得到保护，提示NP蛋白的主要保护区位于1-45位氨基酸。
上述表明，汉坦病毒的研究已取得许多突破性进展，然而由于汉坦病毒的多变异性，新的型别不断的发现，特别是HPS类伴高死亡率，而对该病尚无特效的治疗药物，给该病的预防和治疗提出了一个又一个新的课题。近年来，分子生物学的飞速发展，给病毒学的研究带来了质的飞跃，我们有理由相信，在今后不长的时间内，通过对汉坦病毒与人类宿主基因关系的研究将会得到有效的抗汉坦病毒基因工程药物，而应用感染性克隆，基因重排，基因嵌合等技术将有可能成功研究用于预防汉坦病毒的基因工程疫苗。
, http://www.100md.com
作者单位：中国药品生物制品检定所(北京，100050)
参考文献
1.Lee H,Lee P,Johnson K.lsolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic feve.J infect Dis,1978,137:298.
2.Nichol ST,Speropoulou CF,Morzunov S,et al.Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness.Science,1993,262:914.
3.Schmaljohn C and Hjelle B.Hantavirses:a global disease problem.Emerging Infectious Disease,1997,3(2):95.
, http://www.100md.com
4.Hjelle B.Frequently-asked-questions about hanta virus pulmonary syndrome and hemorrhagic fever with renal syndrome.1996.
5.Clement C,Heyman P,Mckenna P,et al.The hantaviruses of Europe:from the bedside to bench.Emerging Infectious Disease,1997,3(2):205.
6.Hjelle B,Lee SW,Song W,et al.Molecular linkage of hantavirus pulmonary syndrome to the white-footed mouse,Peromyscus leucopus:genetic characterization of the M genome of New York virus,J Med Virol,1995,46:35.
, 百拇医药
7.Rollin PE,Ksiazek TG,Elliott LH,et al.lsolation of Black Creek Canal virus,a new hantavirus from Sigmodon hispidus in Florida.J Med Virol,1995,69(12):8137.
8.Torrez-Martinez N,Bharadwaj M,Goade D,et al.Bayou virus-associated hantavirus pulmonary syndrome in eastern Texas:Identification of the Rice Rat,Oryzomys palustris,as reservoir host,Emerging Infectious Disease,1998,4(1):105.
9.Mills JN and Childs JE.Ecologic studies of rodent reservoirs:Their relevance for human health,Emerging lnfectious Disease,1998,4(4):525.
, 百拇医药
10.CDC.Hantavirus pulmonary syndrome-Chile.MMWR 1997,46(40):949.
11.Lopez N,Padula P,Rossi C,et al.Genetic identification of a new hantavirus causing severe pulmonary syndrome in Argentina.Virology,1996,220:223.
12.Zaparoli MA,Lversson LB,Rosa MD,et al.Investigation on case-contacts of human disease caused by hantavirus in Juquitiba,state of Sao Paulo,Brazil,Am J Trop Med Hyg ,1995,53(suppl):232.
, 百拇医药
13.Williams MA,Bryan RT,Mills JN,et al.An outbreak of hantavirus pulmonary syndrome among Mennonite colonies in western Paraguay.Am J Trop Med Hyg,1997,57:277.
14.Espinoza R,Vial P,Noriega LM,et al.Hantavirus pulmonary syndrome in a Chilean patient with recent travel in Bolivia.Emerging Infectious Disease,1998,4(1):93.
15.Childs J,Shope RE,Fish D,et al.Emerging zoonoses,Emerging Infectious Disease,1998,4(3):453.
, 百拇医药
16.Vitek CR,Breiman RF,Ksiazek TG,et al.Evidence against person-to-peson transmission of hantavirus to health care workers.Clin Infect Dis,1996,22:824.
17.Wells RM,Estani SS,Yadon ZE,et al.A unusual hantavirus outbreak in Southern Argentina:person-to-person transmission?Emerging Infectious Disease,1997,3(2):171.
18.Padula PJ,Edelstein A,Miguel SDL,et al.Hantavirus pulmonary syndrome outbreak in Argentina:molecular evidence for person-to-person transmission of Andes virus,Virology,1998,241:323.
, http://www.100md.com
19.Bharadwaj M,Vial P,Botten J,et al.Andes vrus-associated HPS in Chile:Presence of viral RNA in Tracheal aspirate suggests potential route for interpersonal transmission.The fouth international conference on HFRS and hantaviruses,USA,170.
20.Yanagihara R and Gajdusek.Hemorrhagic fever with renal syndrome:A historical perspective and review of recent advances,Handbook of viral and Rickettsial hemorrhagic fevers.CRC press,1988,155.
, http://www.100md.com
21.Chu YK,Rossi C,LeDuc J,et al.Serological relationships among viruses in the hantavirus genus,family Bunyaviridae.Virology,1994,198:196.
22.Chu YK,Jennings G,Schmaljohn A,et al.Cross-neutralization of hantaviruses with immune sera from e-xperimentally-infected animal and from hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome patients.J Infect Dis,1995,172:1581.
23.Mustonen J,Partanen J,Kanerva M,et al.Association of HLA B27 with benign clinical course of nephopathia epidemica cause by puumala hantavirus,Scand J lmmunol,1998,47(3):277.
, 百拇医药
24.Plyusnin A,Horling J,Kanerva M,et al.Puumala Hantavirus genome in patients with nephropathia epidemica:Correlation of PCR positivity with HLA haplotype and link to viral sequences in local rodents,J Clin Microbiol,1997,35(5):1090.
25.Mcnicholl J.Host genes and infectious diseases,Emerging Infectious diseases,Emerging Infectious Disease,1998,4(3):423.
26.Frese M,Kochs G,Feldmann H,et al.Inhibition of Bunyavirus,Phleboviruses,and Hantaviruses by human MxA rpotein,Journal of Virology,1996,70(2):915.
, 百拇医药
27.Gavrilovskaya IN,Shepley M,Shaw R,et al:β3 integrins mediate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure,Proc Natl Acad Sci,1998,95:7074.
28.Heiskanen T,Lundkvist A,Vaheri A,et al.Phage-displayed peptide targeting on puumala hantavirus neutralization site.J Virol,1997,71(5):3879.
29.Salanen EM,Parren PWHI,Graus YF,et al.Human recombinant puumala virus antibodies:cross-reaction with other hantavirus and use in diagnostics.J Gen Virol,1998,79:659.
, 百拇医药
30.Zoller L,Yang S,Gott P，et al.Use of recombinant nucleocapsid proteins of the hantaan and nephropathia epidemica serotypes of hantaviruses as immunodiagnostic antigens,Journal of Medical Virology,1993,39:200.
31.Kallio-Kokko H,Vapalahti O,Hedman K,et al.Puumala virus antibody and immunoglobulin G avidity assays based on a recombinant nucleocapsid antigen.J Clin Microbiol,1993,31(3):677.
32.Vapalahti O,Lundkvist A,Kallio-Kokko H,et al.Antigenic properties and diagnostic potential of puumala virus nucleocapsid protein expressed in insect cells.J Clin Microbiol,1996,34(1):119.
, http://www.100md.com
33.Kallio-Kokko H,Vapalahti O,Lundkvist A,et al.Evaluation of puumala virus IgG and IgM Enzyme immunoassays based on recombinant baculovirus-expressed nucleocapsid protein for early nephropathia epidemica diagnosis.Clin Diagn Virol,1998,10(1):83.
34.Elgh F,Lundkvist A,Alexeyev OA,et al:Serological diagnosis of hantavirus infections by an enzyme-linked imunosorbent assay based on detection of immnoglobulin G and M responses to recombinant nucleocapsid proteins of five viral serotypes,Journal of Clinical Microbiology,1997,35(5):1122.
, http://www.100md.com
35.Morii M,Yoshimatsu K,Arikawa J,et al:Antigenic characterization of hantaan and seoul virus nucleocapsid proteins expressed by recombinant baculovirs:Application of a truncated protein,lacking an antigenic region common to the two viruses,as a serotyping antigen,Journal of Clinical Microbiology,1998,36(9):2514.
36.Sjolander KB,Elgh F,Kallio-Kokko H,et al.Evaluation of serological methods for diagnosis of puumala hantavirus infection(nephropathia epidemica).J Clin Microbiol,1997,35(12):3264.
, 百拇医药
37.Schmajion CS,Darrymple JM,McClain D,et al.Expressed antigens of hantaviruses as potential vaccines for hemorrhagic fever with renal syndrome,in Modern Vaccinology(Edi Kustak).Plenum Medical press,New York,1994:253.
38.Ulrich R,Lundkvist A,Meisel H,et al.Chimaeric HBV core particles carrying a defined segment of puumala hantavirus nucleocapsid protein evoke protective immunity in an animal model.Vaccine,1997,16(2/3):272., 百拇医药