过氧化物诱导LO2细胞凋亡时 Fas mRNA表达及Ca2+流变化的单细胞分析
作者：卢绮萍 吴在德 李东
单位：卢绮萍(广州军区武汉总医院普通外科 430070，武汉)；吴在德 李东(同济医科大学)
关键词：脱噬作用；基因表达；肝细胞；钙
中华医学杂志000324 摘 要：目的 探讨过氧化物所致肝细胞凋亡时Fas 基因表达与Ca2+流变化的相互关系。方法 应用全细胞膜片钳单细胞逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行H2O2诱导人类正常肝细胞LO2细胞Fas mRNA表达的单细胞分析，应用全细胞膜片钳显微荧光单细胞胞浆游离钙浓度([Ca2+]i)测量技术、流式细胞术、扫描电镜观察同期瞬时Ca2+流变化及早期凋亡(Annexin-V+)细胞指数和细胞膜变化。结果 H2O2作用2 h单个LO2细胞电泳图分析可见Fas1 mRNA特异性扩增条带；单细胞Ca2+流测定R值明显增强(P<0.01, t=22.2424), [Ca2+]i 骤升为1 115 nmol/L±227 nmol/L，与对照组的149 nmol/L±23 nmol/L比较差异有显著性意义(P<0.01, t=13.37), Annexin-V+细胞指数亦明显上升(P<0.01, t=48.41), 细胞膜起泡。结论 H2O2诱导LO2细胞凋亡时细胞内Ca2+失衡可能导致Fas死亡基因的活化。
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Single cell analysis of H2O2 mediated Fas mRNA expression and Ca2+ influx in LO2 cells
LU Qiping WU Zaide LI Dong.
(Department of General Surgery, Wuhan General Hospital, Guangzhou Command of PLA, Wuhan 430070, China)
Abstract：Objective To investigate whether apoptotic injury is induced by Fas mRNA expression mediated by H2O2 and concerned with intracellular Ca2+ unbalance at a single cell level. Methods Fas mRNA expression in human hepatocyte (LO2 cell) was analyzed by whole-cell patch-clamp combined with single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Cytosolic Ca2+ concentration was measured with another whole-cell patch-clamp combined with single-cell microfluorescence [Ca2+]i measurement at the same time. The index of early phase apoptotic cells (Annexin-V+ cells) measured with flow cytometry (FCM) and the hepatocytic morphological changes were observed by scanning electron microscopy. Results Fas mRNA of LO2 cells cultured with H2O2 (10 μmol/L) was expressed at 2 h. The single cell [Ca2+]i analyzed by another whole-cell patchclamp increased to 1 115 nmol/L±227 nmol/L (P<0.01, t=13.37); at the same time, an elevated Ca2+ wave was recorded. The index of Annexin-V+ cells was as high as 16.18±0.65 (P<0.01, t=48.41), and the membrane surface protuberances were observed. Conclusions The activation of Fas mRNA, as a major apoptotic factor mediated by H2O2 in LO2 cells, is probably associated with the imbalance of intracellular Ca2+.
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Key words：Apoptosis； Gene expression; Hepatocyte; Calcium
为探讨过氧化物所致肝细胞凋亡时Fas基因活化机制及意义，我们应用全细胞膜片钳单细胞逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行H2O2诱导人类正常肝细胞(LO2细胞)Fas mRNA表达的单细胞分析，用全细胞膜片钳显微荧光单细胞胞浆游离钙浓度([Ca2+]i) 测量技术分析同期LO2细胞Ca2+流变化，用膜联蛋白荧光素(Annexin-V-Fluos)标记流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测早期凋亡细胞(Annexin-V+细胞)指数，用电镜技术观察细胞膜形态学变化。
材料与方法
一、细胞模型
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用RPMI/1640培养基培养的第3代LO2细胞(购自武汉大学细胞保藏中心)制备细胞悬液，分别置于3 cm细胞培养皿中(2×106个/ml)，皿池内放置两片0.5 cm经多聚赖氨酸处理的小玻片。实验组(LH组)将H2O2(10 μmol/L)与LO2细胞共同孵育2 h后进行有关项目检测。设正常LO2细胞及同期未处理组(L组)LO2细胞为对照。
二、检测项目及方法
1.Fas mRNA表达的单细胞分析：全细胞膜片钳单细胞RT-PCR技术。在6 μm微电极玻管内置入1×RT反应缓冲液10 μl，RNasin 5 U (美国SABC公司)，在CEZ-2400型全细胞膜片钳系统(日本Nihon Konden公司)倒置显微镜监视下将电极伸入培养皿内接近并置入细胞，吸取细胞内容物(图1)，将其转移至一置于冰上的0.5 ml EP管内逆转录反应体系中。20 μl反应体系溶液中含有脱氧寡核苷酸 (dNTPs) 2.5 mmol/L, DNase-RNase free 2 U，RNasin 20 U。将EP管置于37℃水浴孵育30 min，再转至95℃水浴5 min，使DNase失活。当管内温度降至室温时加入逆转录酶(AMV) 20 U， 6聚寡核苷酸引物1 μg。阴性对照则以3 d H2O替代AMV。立即置于42℃水浴孵育1.5 h。逆转录反应结束后取5 μl样品作为模板, 应用480型PCR扩增仪(美国PE公司)扩增Fas cDNA基因片段, PCR总反应体系50 μl中含有10×buffer反应缓冲液5 μl, dNTPs 2.5 mmol/L, Taq DNA聚合酶0.5 μl, Fas mRNA 上游及下游引物各100 pmol, 引物序列为：5′sense：5′-TGGCTTTGTCTTCTTCTTTTG-3′ (720～740); 3′antisense: 5′-TCATCTATTTTGGCTTCATTG-3′(956～976), 257 bp。以β-actin为内参照，引物序列为：5′sense：5′-AGCTGCGTGTGGCTCCCGAG-3′(319～348), 3′antisense: 5′-TCTCCTTAATGTCACGCACG-3′(665～684), 365 bp。反应循环温度及时间为94℃ 7 min→50℃ 40 s→72℃ 1 min，循环30次，最后一次循环延伸时间增加7 min。取出5 μl PCR反应后样品作为模板进行第2次扩增，反应循环温度及时间条件与第1次相同，循环25次。反应结束后取8 μl样品在质量分数为0.015的琼脂糖凝胶电泳中检测反应结果，重复5次。
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图1 用膜片钳微电极吸取单个LO2细胞质中
mRNA ×1 000
2.单细胞[Ca2+]i测量：用PBS洗涤附有LO2细胞的小玻片，置入培养皿，加入细胞外液0.5 ml (NaCl 140 mmol/L, CsCl 5.4 mmol/L, BaCl2 10.8 mmol/L, D-Glucose 10 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, pH=7.3 )与Fura-2/AM(美国Sigma公司)1.25 μmol/L 37℃共同孵育30 min，应用EPC-9型全细胞膜片钳系统(德国HEKA Lambert公司) 联合显微荧光[Ca2+]i测量装置(德国Carl Zeizz公司) 记录单个活细胞瞬时Ca2+流变化和R值 (R=F1/F2, F1、F2分别为340 nm、380 nm波长激发的细胞荧光强度值), 用X-Chart软件将R值转换成数字化信号, 经Macintosh Quadra 650计算机(美国Apple Company公司) I Cor Pro 软件分析得出[Ca2+]i。每组测定10个细胞。
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3.早期凋亡细胞(Annexin-V+)指数测定：收集细胞，PBS洗涤，离心，与Annexin-V-Fluos(美国Gibco公司)37℃共同孵育15 min, 加0.4 ml孵育液，用FACSort流式细胞仪Cell Quest软件定量分析Annexin-V+指数，并取0.5 ml细胞悬液在荧光显微镜下观察细胞形态。
4.细胞膜超微结构形态观察：将另一片附有LO2细胞的小玻片置入2.5 %戊二醛溶液中固定4 h, 常规制备扫描电镜标本，应用日本S450扫描电镜观察细胞膜结构。
三、数据处理
用SAS计算机软件系统进行基本统计量计算，组间比较t检验。
结果
正常对照组和L组细胞2 h时电泳图分析均未见Fas mRNA特异性扩增条带出现；单细胞[Ca2+]i测定可见F1/F2两峰差距较大，说明R值小，细胞荧光值低，[Ca2+]i为144 nmol/L±34 nmol/L、150 nmol/L±23 nmol/L(P>0.05)；Annexxin-V+指数为0.4±0.8、0.4±0.9(P>0.05)，荧光显微镜下极少见Annexin-V+。LH组可见经H2O2处理的LO2细胞有清晰的Fas mRNA特异性条带显示(图2)；[Ca2+]i测定F1/F2两峰差距缩短(图3)，即R值大，细胞荧光值强，单细胞[Ca2+]i骤升为1 115 nmol/L±227 nmol/L(P<0.01)；Annexin-V+指数上升为16.2±0.7(P<0.01)；荧光显微镜下见绿色光环状的Annexin-V+(图4)；电镜下见细胞膜小泡形成(图5)。
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图2 H2O2作用于LO2细胞后Fas mRNA表达
图3 H2O2作用于LO2细胞后[Ca2+]i变化
图4 LH组2 h，荧光显微镜下可见细胞凋亡早期膜翻转现象——Annexin-V+细胞出现
图5 LH组2 h，电镜下可见LO2细胞膜上出现膜小泡 ×100
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讨论
我们在既往实验与临床研究中，曾对脂质过氧化自由基和细胞内Ca2+超载在肝缺血再灌注细胞损伤中的作用、意义进行了长期较为深入的研究，发现再灌注期当[Ca2+]i>10-6 nmol/L时可出现不可我们在既往实验与临床研究中，曾对脂质过氧化自由基和细胞内Ca2+超载在肝缺血再灌注细胞损伤中的作用、意义进行了长期较为深入的研究，发现再灌注期当[Ca2+]i>10-6 nmol/L时可出现不可逆性肝细胞损伤病理变化[1，2]；在最近的研究中又发现，H2O2作用于肝细胞后2 h左右，[Ca2+]i持续>400 nmol/L，可触发Ca2+振荡而产生细胞凋亡现象[3]。由此证实，Ca2+超载不仅是细胞死亡的“最后共同通路”，而且在过氧化物所致细胞凋亡的发生发展中也起到重要作用。由于过氧化损伤和细胞内Ca2+超载均为导致肝缺血再灌注损伤的重要主导因素，因而，我们在本实验中应用了两套分别与PCR技术和显微荧光[Ca2+]i定量探测技术相结合的全细胞膜片钳系统，以及流式细胞术和电镜技术，在H2O2作用于肝细胞后2 h，[Ca2+]i持续>400 nmol/L这一时限点，在单个活细胞基因表达水平，进一步探讨过氧化物引起LO2细胞内Ca2+超载导致细胞损伤的可能分子机制。因全细胞膜片钳单细胞RT-PCR技术不需要进行组织或群体细胞总RNA提取，实验中直接利用膜片钳微电极以适当吸力及时获取悬浮活细胞胞质中的mRNA后，在随机引物引发下cDNA合成立即开始，再随之实施2次PCR，使用微电极获取的信息量较弱的单细胞特定基因Fas mRNA目的序列得以扩增，故其合成的cDNA产物能够在一定程度上直接反映出胞浆原始Fas mRNA表达水平，基因表达信息获取更为直接、完全、准确。
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本研究结果表明，H2O2作用于LO2细胞后，在[Ca2+]i急剧上升、Annexin-V+指数明显增高、LO2细胞出现细胞凋亡早期特征性膜变化(诸如荧光显微镜下出现绿色光环的Annexin-V+，电镜下可见细胞膜起泡等)时，有Fas mRNA特异性扩增条带出现，由此提示，Fas死亡基因活化有可能介导了过氧化物触发的LO2细胞凋亡，而这一自主性细胞死亡程序的活化很可能与Ca2+有关。文献[4]报告细胞[Ca2+]i升高可致DNA片段化，但由于细胞类型不同，其凋亡发生的信号传导通路亦不同。肝细胞凋亡时Fas mRNA与Ca2+流变化的关系尚不十分明了。由于Fas信号传导通路的Ⅱ型途径要经过线粒体膜实现其级联反应[5，6]，而具有旺盛代谢功能的肝细胞其线粒体尤为丰富，推测H2O2引起LO2细胞产生应激反应时线粒体内膜Ca2+跨膜进入胞浆使胞浆Ca2+浓度升高，同时有可能触发Fas信号传导通路的Ⅱ型途径激活。此时，作为非兴奋细胞的肝细胞, 激动剂引起的受体介导性Ca2+内流是通过钙池耗竭而诱发的[7]，因而，H2O2作用于LO2细胞也可能使内质网钙池释放Ca2+致胞浆[Ca2+]i升高，当内贮钙池Ca2+耗尽则通过某种结构如骨架蛋白结构变化间接或直接与质膜联络, 使Ca2+通道开启，外Ca2+内流[8]，胞浆内骤然升高的[Ca2+]i可使细胞骨架蛋白裂解变性导致细胞凋亡特征性膜变化出现。由此分析，在肝细胞，这种H2O2所致胞内Ca2+平衡失调很可能介导了胞浆段Fas死亡基因高表达，引起死亡信号传导通路的活化，并使其编码的Fas穿膜糖蛋白生成，进而导致细胞凋亡。故采取有效措施稳定细胞膜及线粒体、内质网膜结构，抑制外钙内流及内钙释放所引起的胞浆[Ca2+]i升高，有可能减少Fas mRNA及其Fas穿膜蛋白的高表达所触发的细胞损伤作用, 阻断其死亡信号传导通路，这对于防止多种原因诸如创伤、休克等引起缺血再灌注时过氧化物大量生成及Ca2+超载所致肝细胞损伤具有重要意义。
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志谢 同济医科大学医学实验中心李之望在膜片钳技术工作中给予指导和帮助。广州军区武汉总医院医学实验中心李德忠在电镜工作方面予以协助
基金项目：国家自然科学基金项目(39770938)；湖北省重点科技发展计划项目(972P1208)
参考文献：
1 卢绮萍，史陈让，吴笑春, 等. 用Fura-2单细胞显微荧光术动态观察肝缺血再灌注细胞内游离钙浓度. 中华实验外科杂志,1993, 10:115-117.
2 卢绮萍，史陈让, 吴在德, 等. 丹参防治肝缺血再灌注肝细胞内钙超载的实验与临床研究. 中华外科杂志,1996, 34:98-101.
3 卢绮萍，田磊, 吴在德. H2O2诱导人类LO2、EVC304细胞凋亡时Ca2+流变化的对比研究. 中华实验外科杂志, 1999, 16:147-149.
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4 MoConkey DJ, Orrenius S. The role of calcium in the regulation of apoptosis. J Leukocyte Biol, 1996, 59: 775-783.
5 Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, et al. Two CD 95(APO-1/Fas) signaling pathways. EMBO J, 1998, 17: 1675-1687.
6 Petit PX, Goubern M, Diolez P, et al. Disruption of the outer mitochondrial membrane as a result of large amplitube swelling: the impact of irreversible permeability transcription. FEBS Lett, 1998, 426: 111-116.
7 Putney JW, Bird G, Sr J. The inositol phosphate-calcium signalling system in nonexcitable cells. Endocr Rev, 1993, 14: 610-631.
8 Khan AA, Steiner JP, Klein MG. IP3 receptor: localization to plasma membrane of T cell receptor. Science, 1992, 257: 815-818.
收稿日期：1998-11-20, http://www.100md.com
单位：卢绮萍(广州军区武汉总医院普通外科 430070，武汉)；吴在德 李东(同济医科大学)
关键词：脱噬作用；基因表达；肝细胞；钙
中华医学杂志000324 摘 要：目的 探讨过氧化物所致肝细胞凋亡时Fas 基因表达与Ca2+流变化的相互关系。方法 应用全细胞膜片钳单细胞逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行H2O2诱导人类正常肝细胞LO2细胞Fas mRNA表达的单细胞分析，应用全细胞膜片钳显微荧光单细胞胞浆游离钙浓度([Ca2+]i)测量技术、流式细胞术、扫描电镜观察同期瞬时Ca2+流变化及早期凋亡(Annexin-V+)细胞指数和细胞膜变化。结果 H2O2作用2 h单个LO2细胞电泳图分析可见Fas1 mRNA特异性扩增条带；单细胞Ca2+流测定R值明显增强(P<0.01, t=22.2424), [Ca2+]i 骤升为1 115 nmol/L±227 nmol/L，与对照组的149 nmol/L±23 nmol/L比较差异有显著性意义(P<0.01, t=13.37), Annexin-V+细胞指数亦明显上升(P<0.01, t=48.41), 细胞膜起泡。结论 H2O2诱导LO2细胞凋亡时细胞内Ca2+失衡可能导致Fas死亡基因的活化。
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Single cell analysis of H2O2 mediated Fas mRNA expression and Ca2+ influx in LO2 cells
LU Qiping WU Zaide LI Dong.
(Department of General Surgery, Wuhan General Hospital, Guangzhou Command of PLA, Wuhan 430070, China)
Abstract：Objective To investigate whether apoptotic injury is induced by Fas mRNA expression mediated by H2O2 and concerned with intracellular Ca2+ unbalance at a single cell level. Methods Fas mRNA expression in human hepatocyte (LO2 cell) was analyzed by whole-cell patch-clamp combined with single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Cytosolic Ca2+ concentration was measured with another whole-cell patch-clamp combined with single-cell microfluorescence [Ca2+]i measurement at the same time. The index of early phase apoptotic cells (Annexin-V+ cells) measured with flow cytometry (FCM) and the hepatocytic morphological changes were observed by scanning electron microscopy. Results Fas mRNA of LO2 cells cultured with H2O2 (10 μmol/L) was expressed at 2 h. The single cell [Ca2+]i analyzed by another whole-cell patchclamp increased to 1 115 nmol/L±227 nmol/L (P<0.01, t=13.37); at the same time, an elevated Ca2+ wave was recorded. The index of Annexin-V+ cells was as high as 16.18±0.65 (P<0.01, t=48.41), and the membrane surface protuberances were observed. Conclusions The activation of Fas mRNA, as a major apoptotic factor mediated by H2O2 in LO2 cells, is probably associated with the imbalance of intracellular Ca2+.
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Key words：Apoptosis； Gene expression; Hepatocyte; Calcium
为探讨过氧化物所致肝细胞凋亡时Fas基因活化机制及意义，我们应用全细胞膜片钳单细胞逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行H2O2诱导人类正常肝细胞(LO2细胞)Fas mRNA表达的单细胞分析，用全细胞膜片钳显微荧光单细胞胞浆游离钙浓度([Ca2+]i) 测量技术分析同期LO2细胞Ca2+流变化，用膜联蛋白荧光素(Annexin-V-Fluos)标记流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测早期凋亡细胞(Annexin-V+细胞)指数，用电镜技术观察细胞膜形态学变化。
材料与方法
一、细胞模型
, http://www.100md.com
用RPMI/1640培养基培养的第3代LO2细胞(购自武汉大学细胞保藏中心)制备细胞悬液，分别置于3 cm细胞培养皿中(2×106个/ml)，皿池内放置两片0.5 cm经多聚赖氨酸处理的小玻片。实验组(LH组)将H2O2(10 μmol/L)与LO2细胞共同孵育2 h后进行有关项目检测。设正常LO2细胞及同期未处理组(L组)LO2细胞为对照。
二、检测项目及方法
1.Fas mRNA表达的单细胞分析：全细胞膜片钳单细胞RT-PCR技术。在6 μm微电极玻管内置入1×RT反应缓冲液10 μl，RNasin 5 U (美国SABC公司)，在CEZ-2400型全细胞膜片钳系统(日本Nihon Konden公司)倒置显微镜监视下将电极伸入培养皿内接近并置入细胞，吸取细胞内容物(图1)，将其转移至一置于冰上的0.5 ml EP管内逆转录反应体系中。20 μl反应体系溶液中含有脱氧寡核苷酸 (dNTPs) 2.5 mmol/L, DNase-RNase free 2 U，RNasin 20 U。将EP管置于37℃水浴孵育30 min，再转至95℃水浴5 min，使DNase失活。当管内温度降至室温时加入逆转录酶(AMV) 20 U， 6聚寡核苷酸引物1 μg。阴性对照则以3 d H2O替代AMV。立即置于42℃水浴孵育1.5 h。逆转录反应结束后取5 μl样品作为模板, 应用480型PCR扩增仪(美国PE公司)扩增Fas cDNA基因片段, PCR总反应体系50 μl中含有10×buffer反应缓冲液5 μl, dNTPs 2.5 mmol/L, Taq DNA聚合酶0.5 μl, Fas mRNA 上游及下游引物各100 pmol, 引物序列为：5′sense：5′-TGGCTTTGTCTTCTTCTTTTG-3′ (720～740); 3′antisense: 5′-TCATCTATTTTGGCTTCATTG-3′(956～976), 257 bp。以β-actin为内参照，引物序列为：5′sense：5′-AGCTGCGTGTGGCTCCCGAG-3′(319～348), 3′antisense: 5′-TCTCCTTAATGTCACGCACG-3′(665～684), 365 bp。反应循环温度及时间为94℃ 7 min→50℃ 40 s→72℃ 1 min，循环30次，最后一次循环延伸时间增加7 min。取出5 μl PCR反应后样品作为模板进行第2次扩增，反应循环温度及时间条件与第1次相同，循环25次。反应结束后取8 μl样品在质量分数为0.015的琼脂糖凝胶电泳中检测反应结果，重复5次。
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图1 用膜片钳微电极吸取单个LO2细胞质中
mRNA ×1 000
2.单细胞[Ca2+]i测量：用PBS洗涤附有LO2细胞的小玻片，置入培养皿，加入细胞外液0.5 ml (NaCl 140 mmol/L, CsCl 5.4 mmol/L, BaCl2 10.8 mmol/L, D-Glucose 10 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, pH=7.3 )与Fura-2/AM(美国Sigma公司)1.25 μmol/L 37℃共同孵育30 min，应用EPC-9型全细胞膜片钳系统(德国HEKA Lambert公司) 联合显微荧光[Ca2+]i测量装置(德国Carl Zeizz公司) 记录单个活细胞瞬时Ca2+流变化和R值 (R=F1/F2, F1、F2分别为340 nm、380 nm波长激发的细胞荧光强度值), 用X-Chart软件将R值转换成数字化信号, 经Macintosh Quadra 650计算机(美国Apple Company公司) I Cor Pro 软件分析得出[Ca2+]i。每组测定10个细胞。
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3.早期凋亡细胞(Annexin-V+)指数测定：收集细胞，PBS洗涤，离心，与Annexin-V-Fluos(美国Gibco公司)37℃共同孵育15 min, 加0.4 ml孵育液，用FACSort流式细胞仪Cell Quest软件定量分析Annexin-V+指数，并取0.5 ml细胞悬液在荧光显微镜下观察细胞形态。
4.细胞膜超微结构形态观察：将另一片附有LO2细胞的小玻片置入2.5 %戊二醛溶液中固定4 h, 常规制备扫描电镜标本，应用日本S450扫描电镜观察细胞膜结构。
三、数据处理
用SAS计算机软件系统进行基本统计量计算，组间比较t检验。
结果
正常对照组和L组细胞2 h时电泳图分析均未见Fas mRNA特异性扩增条带出现；单细胞[Ca2+]i测定可见F1/F2两峰差距较大，说明R值小，细胞荧光值低，[Ca2+]i为144 nmol/L±34 nmol/L、150 nmol/L±23 nmol/L(P>0.05)；Annexxin-V+指数为0.4±0.8、0.4±0.9(P>0.05)，荧光显微镜下极少见Annexin-V+。LH组可见经H2O2处理的LO2细胞有清晰的Fas mRNA特异性条带显示(图2)；[Ca2+]i测定F1/F2两峰差距缩短(图3)，即R值大，细胞荧光值强，单细胞[Ca2+]i骤升为1 115 nmol/L±227 nmol/L(P<0.01)；Annexin-V+指数上升为16.2±0.7(P<0.01)；荧光显微镜下见绿色光环状的Annexin-V+(图4)；电镜下见细胞膜小泡形成(图5)。
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图2 H2O2作用于LO2细胞后Fas mRNA表达
图3 H2O2作用于LO2细胞后[Ca2+]i变化
图4 LH组2 h，荧光显微镜下可见细胞凋亡早期膜翻转现象——Annexin-V+细胞出现
图5 LH组2 h，电镜下可见LO2细胞膜上出现膜小泡 ×100
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讨论
我们在既往实验与临床研究中，曾对脂质过氧化自由基和细胞内Ca2+超载在肝缺血再灌注细胞损伤中的作用、意义进行了长期较为深入的研究，发现再灌注期当[Ca2+]i>10-6 nmol/L时可出现不可我们在既往实验与临床研究中，曾对脂质过氧化自由基和细胞内Ca2+超载在肝缺血再灌注细胞损伤中的作用、意义进行了长期较为深入的研究，发现再灌注期当[Ca2+]i>10-6 nmol/L时可出现不可逆性肝细胞损伤病理变化[1，2]；在最近的研究中又发现，H2O2作用于肝细胞后2 h左右，[Ca2+]i持续>400 nmol/L，可触发Ca2+振荡而产生细胞凋亡现象[3]。由此证实，Ca2+超载不仅是细胞死亡的“最后共同通路”，而且在过氧化物所致细胞凋亡的发生发展中也起到重要作用。由于过氧化损伤和细胞内Ca2+超载均为导致肝缺血再灌注损伤的重要主导因素，因而，我们在本实验中应用了两套分别与PCR技术和显微荧光[Ca2+]i定量探测技术相结合的全细胞膜片钳系统，以及流式细胞术和电镜技术，在H2O2作用于肝细胞后2 h，[Ca2+]i持续>400 nmol/L这一时限点，在单个活细胞基因表达水平，进一步探讨过氧化物引起LO2细胞内Ca2+超载导致细胞损伤的可能分子机制。因全细胞膜片钳单细胞RT-PCR技术不需要进行组织或群体细胞总RNA提取，实验中直接利用膜片钳微电极以适当吸力及时获取悬浮活细胞胞质中的mRNA后，在随机引物引发下cDNA合成立即开始，再随之实施2次PCR，使用微电极获取的信息量较弱的单细胞特定基因Fas mRNA目的序列得以扩增，故其合成的cDNA产物能够在一定程度上直接反映出胞浆原始Fas mRNA表达水平，基因表达信息获取更为直接、完全、准确。
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本研究结果表明，H2O2作用于LO2细胞后，在[Ca2+]i急剧上升、Annexin-V+指数明显增高、LO2细胞出现细胞凋亡早期特征性膜变化(诸如荧光显微镜下出现绿色光环的Annexin-V+，电镜下可见细胞膜起泡等)时，有Fas mRNA特异性扩增条带出现，由此提示，Fas死亡基因活化有可能介导了过氧化物触发的LO2细胞凋亡，而这一自主性细胞死亡程序的活化很可能与Ca2+有关。文献[4]报告细胞[Ca2+]i升高可致DNA片段化，但由于细胞类型不同，其凋亡发生的信号传导通路亦不同。肝细胞凋亡时Fas mRNA与Ca2+流变化的关系尚不十分明了。由于Fas信号传导通路的Ⅱ型途径要经过线粒体膜实现其级联反应[5，6]，而具有旺盛代谢功能的肝细胞其线粒体尤为丰富，推测H2O2引起LO2细胞产生应激反应时线粒体内膜Ca2+跨膜进入胞浆使胞浆Ca2+浓度升高，同时有可能触发Fas信号传导通路的Ⅱ型途径激活。此时，作为非兴奋细胞的肝细胞, 激动剂引起的受体介导性Ca2+内流是通过钙池耗竭而诱发的[7]，因而，H2O2作用于LO2细胞也可能使内质网钙池释放Ca2+致胞浆[Ca2+]i升高，当内贮钙池Ca2+耗尽则通过某种结构如骨架蛋白结构变化间接或直接与质膜联络, 使Ca2+通道开启，外Ca2+内流[8]，胞浆内骤然升高的[Ca2+]i可使细胞骨架蛋白裂解变性导致细胞凋亡特征性膜变化出现。由此分析，在肝细胞，这种H2O2所致胞内Ca2+平衡失调很可能介导了胞浆段Fas死亡基因高表达，引起死亡信号传导通路的活化，并使其编码的Fas穿膜糖蛋白生成，进而导致细胞凋亡。故采取有效措施稳定细胞膜及线粒体、内质网膜结构，抑制外钙内流及内钙释放所引起的胞浆[Ca2+]i升高，有可能减少Fas mRNA及其Fas穿膜蛋白的高表达所触发的细胞损伤作用, 阻断其死亡信号传导通路，这对于防止多种原因诸如创伤、休克等引起缺血再灌注时过氧化物大量生成及Ca2+超载所致肝细胞损伤具有重要意义。
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志谢 同济医科大学医学实验中心李之望在膜片钳技术工作中给予指导和帮助。广州军区武汉总医院医学实验中心李德忠在电镜工作方面予以协助
基金项目：国家自然科学基金项目(39770938)；湖北省重点科技发展计划项目(972P1208)
参考文献：
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收稿日期：1998-11-20, http://www.100md.com