wp53和Bcl-2综合表达与喉癌放射治疗疗效关系
作者：杨怀安 朴哲孝治 高坂知节
单位：杨怀安(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科)；朴哲孝治 高板知节(日本东北大学病院耳鼻咽喉科)
关键词：喉肿瘤/放射疗法；wp53基因；Bcl-2基因；预后
中华放射肿瘤学杂志000314 【摘要】 目的 探讨wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达与放射治疗疗效的相互关系。方法 应用抗wp53和Bcl-2基因蛋白单克隆抗体，采用DACO CSA System法染色技术，对70例喉鳞癌组织标本进行了免疫组织化学染色分析。将wp53和Bcl-2基因蛋白表达程度分 4个级别，应用χ2检验放射治疗疗效与基因蛋白表达程度是否相关，应用相关系数探讨各自及综合表达程度与疗效间的相关强度。结果 喉癌wp53和Bcl-2基因蛋白表达程度均可分为++++、+++、++及 +表达，基因蛋白表达程度与放射治疗疗效间明显相关，综合表达相关性更好。结论 wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达与放射治疗疗效间具有明显相关性，可以把喉癌 wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达作为喉癌放射治疗预后判定及指导临床治疗的参考指标。
, 百拇医药
Correlation between dual expression of wp53 & Bcl-2 gene proteins and the outcome of radiotherapy of laryngeal carcinoma
YANG Huaian,HOZAWA Koji, TAKASAKA Tomonori.
(Department of Otology,Rhinology and Larygology,China Medical University First Hospital,Shenyang 110001,China)
【Abstract】 Objective To determine the correlation between the combined wp53 and Bcl-2 gene protein expressions and the radiotherapeutic effect of laryngeal carcinoma . Methods In 70 cases of laryngeal cancer,histological expressions of wp53 and Bcl-2 gene proteins were examined with the monoclonal antibody technique and DACO CSA system immunohistochemical stain. The wp53 and Bcl-2 gene protein expressions were rated into four levels: ++++,+++,++ or +. The correlation between expressive intensity and radiation effect was tested with χ2 and Cramer methods. Result It was evident that each gene protein expression was significantly related to the outcome of radiotherapy, especially the dual expressions being more so. Conclusion Evident correlation is found between wp53 and Bcl-2 gene protein expressions and radiation effects. The dual expression may be taken as the criteria to predict the prognosis of radiation therapy of laryngeal carcinoma by suggesting the treatment scheme.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms/radiotherapy;wp53 gene ; Bcl-2 gene;Prognosis
近年来随着对细胞凋亡基因的了解以及放射线诱导细胞凋亡的研究逐渐深入，研究表明作为抑制细胞凋亡的 Bcl-2及诱导细胞凋亡的wp53基因(野生型p53 )基因表达对肿瘤放射治疗疗效具有一定影响。作者探讨了喉癌 wp53及 Bcl-2基因表达强度分型以及基因表达程度与放射治疗疗效的关系。
1 材料与方法
1.1 病例选择：选择 1985年至1995年间日本东北大学病院诊断为喉鳞癌，并行单纯放射治疗的70例喉癌患者。有效组40例中T1期 31例(声门上型 9例，声门型 22例)，T2期 9例(声门上型 2例，声门型 7例)；无效组 30例中T1期 25例(声门上型 7例，声门型 18例)，T2期 4例(声门上型 1例，声门型 3例)，T3期声门上型1例[按照1987年国际抗癌联盟(UICC)喉癌分期标准分期]。有效组定为 5年内无复发者，无效组定为放射治疗未治愈或 5年内复发者。
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1.2 治疗方法：采用单纯60Co γ射线治疗，剂量为 60 ～ 70 Gy，2 Gy/d，连续5 d天后休 2 d。对于放射治疗无效或复发病例进一步行全喉及部分喉切除术。
1.3 染色方法：选择治疗前活检的经福尔马林固定、石蜡包埋的喉癌组织标本，采用鼠抗人wp53和 Bcl-2 单克隆抗体(Novocastra Laboratories Ltd产品)，工作液稀释度为 1∶20。用免疫组织化学染色试剂盒[DACO CSA(catalyzed signal amplification ) System，DACO日本株式会社产品]检测标本wp53和Bcl-2 基因表达情况。在光学显微镜下Bcl-2基因蛋白染色阳性者细胞浆呈黄褐色，染色阴性者细胞浆无色；wp53基因蛋白染色阳性者细胞核呈黄褐色，染色阴性者细胞核呈淡蓝色。
1.4 结果判定：随机选择 10个高倍视野，计数1 000个肿瘤细胞，当阳性肿瘤细胞占总数的76%～100%时定为++++，wp53评 4分，Bcl-2评 1分；当阳性肿瘤细胞占总数的51%～75%时定为+++，wp53评 3分，Bcl-2评 2分；当阳性肿瘤细胞占总数的26%～50%时定为++，wp53评 2分，Bcl-2评 3分；当阳性肿瘤细胞占总数的0%～25%时定为 +，wp53评 1分，Bcl-2评 4分。综合表达强度为同一癌组织wp53及 Bcl-2 基因蛋白表达强度评分之和，最高分为 8分，最低分为 2分。
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1.5 统计方法：喉癌射线治疗疗效与各基因表达程度间是否相关应用χ2检验，应用Cramer(修正)列联系数(C)进行相关程度检验。
2 结果
wp53及Bcl-2基因蛋白表达在喉癌组织中均为从无表达到全部表达不等。表 1为喉癌放射治疗疗效与Bcl-2基因蛋白表达程度的关系。喉癌放射治疗疗效与Bcl-2基因蛋白表达程度明显相关，χ2= 19.2 > χ20.01(3),相关系数C=0.91。
表1 喉癌放射治疗疗效与Bcl-2基因蛋白表达程度的关系 分组
总例数
++++
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+
例数
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有效
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1
5
表2为喉癌放射治疗疗效与wp53基因蛋白表达程度的关系。喉癌放射治疗疗效与wp53基因蛋白表达程度明显相关，χ2= 17.0 > χ20.01(3),相关系数C = 0.89。表2 喉癌放射治疗疗效与wp53基因蛋白表达程度的关系 分组
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表3为喉癌放射治疗疗效与wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达程度的关系。喉癌放射治疗疗效与wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达程度明显相关， χ2= 26.6 > χ20.01(5)，相关系数C=0.95。表3 喉癌放射治疗疗效与wp53和Bcl-2基因蛋白
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综合表达程度的关系 分组
总例数
8分
7分
6分
5分
4分
3分
2分
有效
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3 讨论
喉癌放射治疗已有多年，人们很早就发现放射治疗疗效个体差异很大，并对影响放射治疗疗效的诸多因素如肿瘤大小、生长部位及增殖能力等进行了研究[1，2]。它们与放射治疗疗效虽有相关性，但临床上常出现例外病例。近年来随着分子生物学理论及其技术在医疗研究中的不断应用，证实放射线能够引起细胞凋亡，细胞凋亡依赖于wp53基因蛋白并受Bcl-2基因蛋白水平调控，因此有可能作为判定肿瘤放射治疗疗效的参考指标[3-5]。作者应用针对人wp53及Bcl-2 基因产物蛋白单克隆抗体对 70例接受单纯放射治疗的喉癌患者进行了回顾性研究，发现虽然都是喉鳞癌，但 wp53及Bcl-2 基因蛋白表达在喉癌组织中从无表达到全部表达不等, 差异很大。在Bcl-2基因蛋白强度表达组中放射治疗有效的所占比例较低，而在Bcl-2基因阴性表达组中放射治疗有效的所占比例较高，说明随着 Bcl-2基因表达程度降低放射治疗疗效提高，放射治疗疗效与 Bcl - 2基因蛋白表达呈负相关(相关系数 C＝0.91)。而wp53基因蛋白表达则相反，放射治疗有效组 wp53基因蛋白表达较高，放射治疗无效组wp53基因蛋白表达较低，放射治疗疗效与wp53基因蛋白表达呈正相关(相关系数 C＝0.89)。结果表明放射治疗疗效与wp53及Bcl-2基因表达具有相关性，但相关系数略低。从表3看，得分越高有效组所占比例越大，得分越低无效组所占比例越大。两者不但相关，并明显的提高了相关系数。因此显示出同单一基因蛋白表达相比， 2种基因蛋白综合表达与喉癌放射治疗疗效具有更高的相关性和准确性。
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当然，喉癌放射治疗疗效是受多种因素影响决定的，如能应用相关因素对喉癌放射治疗疗效进行多因素综合判定，将会提高判定准确率，对预后及选择治疗方案(放射治疗或切除等)具有重要的临床意义。
参考文献
1，朝仓光司,志藤文明,坪田大，他.喉头癌放射线照射后再发症例のレ-ザ-手术.耳鼻临床,1996,89:1249-1252.
2，Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer,1983,31:13-20.
3，Yamada T, Ohyama H. Radiation-induced interphase death of rat thymocytes is internally programmed(apoptosis).Int J Radiat Biol, 1988, 53:65-75.
4，Caelles C,Helmberg A, Karin M. p53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation of p53-targetgenes. Nature,1994,370:220-223.
5，Hockenbery DM,Oltai ZN,Yin XM,et al. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis.Cell,1993,75:241-251.
(收稿日期：2000-01-25), http://www.100md.com
单位：杨怀安(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科)；朴哲孝治 高板知节(日本东北大学病院耳鼻咽喉科)
关键词：喉肿瘤/放射疗法；wp53基因；Bcl-2基因；预后
中华放射肿瘤学杂志000314 【摘要】 目的 探讨wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达与放射治疗疗效的相互关系。方法 应用抗wp53和Bcl-2基因蛋白单克隆抗体，采用DACO CSA System法染色技术，对70例喉鳞癌组织标本进行了免疫组织化学染色分析。将wp53和Bcl-2基因蛋白表达程度分 4个级别，应用χ2检验放射治疗疗效与基因蛋白表达程度是否相关，应用相关系数探讨各自及综合表达程度与疗效间的相关强度。结果 喉癌wp53和Bcl-2基因蛋白表达程度均可分为++++、+++、++及 +表达，基因蛋白表达程度与放射治疗疗效间明显相关，综合表达相关性更好。结论 wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达与放射治疗疗效间具有明显相关性，可以把喉癌 wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达作为喉癌放射治疗预后判定及指导临床治疗的参考指标。
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Correlation between dual expression of wp53 & Bcl-2 gene proteins and the outcome of radiotherapy of laryngeal carcinoma
YANG Huaian,HOZAWA Koji, TAKASAKA Tomonori.
(Department of Otology,Rhinology and Larygology,China Medical University First Hospital,Shenyang 110001,China)
【Abstract】 Objective To determine the correlation between the combined wp53 and Bcl-2 gene protein expressions and the radiotherapeutic effect of laryngeal carcinoma . Methods In 70 cases of laryngeal cancer,histological expressions of wp53 and Bcl-2 gene proteins were examined with the monoclonal antibody technique and DACO CSA system immunohistochemical stain. The wp53 and Bcl-2 gene protein expressions were rated into four levels: ++++,+++,++ or +. The correlation between expressive intensity and radiation effect was tested with χ2 and Cramer methods. Result It was evident that each gene protein expression was significantly related to the outcome of radiotherapy, especially the dual expressions being more so. Conclusion Evident correlation is found between wp53 and Bcl-2 gene protein expressions and radiation effects. The dual expression may be taken as the criteria to predict the prognosis of radiation therapy of laryngeal carcinoma by suggesting the treatment scheme.
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【Key words】 Laryngeal neoplasms/radiotherapy;wp53 gene ; Bcl-2 gene;Prognosis
近年来随着对细胞凋亡基因的了解以及放射线诱导细胞凋亡的研究逐渐深入，研究表明作为抑制细胞凋亡的 Bcl-2及诱导细胞凋亡的wp53基因(野生型p53 )基因表达对肿瘤放射治疗疗效具有一定影响。作者探讨了喉癌 wp53及 Bcl-2基因表达强度分型以及基因表达程度与放射治疗疗效的关系。
1 材料与方法
1.1 病例选择：选择 1985年至1995年间日本东北大学病院诊断为喉鳞癌，并行单纯放射治疗的70例喉癌患者。有效组40例中T1期 31例(声门上型 9例，声门型 22例)，T2期 9例(声门上型 2例，声门型 7例)；无效组 30例中T1期 25例(声门上型 7例，声门型 18例)，T2期 4例(声门上型 1例，声门型 3例)，T3期声门上型1例[按照1987年国际抗癌联盟(UICC)喉癌分期标准分期]。有效组定为 5年内无复发者，无效组定为放射治疗未治愈或 5年内复发者。
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1.2 治疗方法：采用单纯60Co γ射线治疗，剂量为 60 ～ 70 Gy，2 Gy/d，连续5 d天后休 2 d。对于放射治疗无效或复发病例进一步行全喉及部分喉切除术。
1.3 染色方法：选择治疗前活检的经福尔马林固定、石蜡包埋的喉癌组织标本，采用鼠抗人wp53和 Bcl-2 单克隆抗体(Novocastra Laboratories Ltd产品)，工作液稀释度为 1∶20。用免疫组织化学染色试剂盒[DACO CSA(catalyzed signal amplification ) System，DACO日本株式会社产品]检测标本wp53和Bcl-2 基因表达情况。在光学显微镜下Bcl-2基因蛋白染色阳性者细胞浆呈黄褐色，染色阴性者细胞浆无色；wp53基因蛋白染色阳性者细胞核呈黄褐色，染色阴性者细胞核呈淡蓝色。
1.4 结果判定：随机选择 10个高倍视野，计数1 000个肿瘤细胞，当阳性肿瘤细胞占总数的76%～100%时定为++++，wp53评 4分，Bcl-2评 1分；当阳性肿瘤细胞占总数的51%～75%时定为+++，wp53评 3分，Bcl-2评 2分；当阳性肿瘤细胞占总数的26%～50%时定为++，wp53评 2分，Bcl-2评 3分；当阳性肿瘤细胞占总数的0%～25%时定为 +，wp53评 1分，Bcl-2评 4分。综合表达强度为同一癌组织wp53及 Bcl-2 基因蛋白表达强度评分之和，最高分为 8分，最低分为 2分。
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1.5 统计方法：喉癌射线治疗疗效与各基因表达程度间是否相关应用χ2检验，应用Cramer(修正)列联系数(C)进行相关程度检验。
2 结果
wp53及Bcl-2基因蛋白表达在喉癌组织中均为从无表达到全部表达不等。表 1为喉癌放射治疗疗效与Bcl-2基因蛋白表达程度的关系。喉癌放射治疗疗效与Bcl-2基因蛋白表达程度明显相关，χ2= 19.2 > χ20.01(3),相关系数C=0.91。
表1 喉癌放射治疗疗效与Bcl-2基因蛋白表达程度的关系 分组
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表2为喉癌放射治疗疗效与wp53基因蛋白表达程度的关系。喉癌放射治疗疗效与wp53基因蛋白表达程度明显相关，χ2= 17.0 > χ20.01(3),相关系数C = 0.89。表2 喉癌放射治疗疗效与wp53基因蛋白表达程度的关系 分组
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表3为喉癌放射治疗疗效与wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达程度的关系。喉癌放射治疗疗效与wp53和Bcl-2基因蛋白综合表达程度明显相关， χ2= 26.6 > χ20.01(5)，相关系数C=0.95。表3 喉癌放射治疗疗效与wp53和Bcl-2基因蛋白
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综合表达程度的关系 分组
总例数
8分
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3 讨论
喉癌放射治疗已有多年，人们很早就发现放射治疗疗效个体差异很大，并对影响放射治疗疗效的诸多因素如肿瘤大小、生长部位及增殖能力等进行了研究[1，2]。它们与放射治疗疗效虽有相关性，但临床上常出现例外病例。近年来随着分子生物学理论及其技术在医疗研究中的不断应用，证实放射线能够引起细胞凋亡，细胞凋亡依赖于wp53基因蛋白并受Bcl-2基因蛋白水平调控，因此有可能作为判定肿瘤放射治疗疗效的参考指标[3-5]。作者应用针对人wp53及Bcl-2 基因产物蛋白单克隆抗体对 70例接受单纯放射治疗的喉癌患者进行了回顾性研究，发现虽然都是喉鳞癌，但 wp53及Bcl-2 基因蛋白表达在喉癌组织中从无表达到全部表达不等, 差异很大。在Bcl-2基因蛋白强度表达组中放射治疗有效的所占比例较低，而在Bcl-2基因阴性表达组中放射治疗有效的所占比例较高，说明随着 Bcl-2基因表达程度降低放射治疗疗效提高，放射治疗疗效与 Bcl - 2基因蛋白表达呈负相关(相关系数 C＝0.91)。而wp53基因蛋白表达则相反，放射治疗有效组 wp53基因蛋白表达较高，放射治疗无效组wp53基因蛋白表达较低，放射治疗疗效与wp53基因蛋白表达呈正相关(相关系数 C＝0.89)。结果表明放射治疗疗效与wp53及Bcl-2基因表达具有相关性，但相关系数略低。从表3看，得分越高有效组所占比例越大，得分越低无效组所占比例越大。两者不但相关，并明显的提高了相关系数。因此显示出同单一基因蛋白表达相比， 2种基因蛋白综合表达与喉癌放射治疗疗效具有更高的相关性和准确性。
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当然，喉癌放射治疗疗效是受多种因素影响决定的，如能应用相关因素对喉癌放射治疗疗效进行多因素综合判定，将会提高判定准确率，对预后及选择治疗方案(放射治疗或切除等)具有重要的临床意义。
参考文献
1，朝仓光司,志藤文明,坪田大，他.喉头癌放射线照射后再发症例のレ-ザ-手术.耳鼻临床,1996,89:1249-1252.
2，Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer,1983,31:13-20.
3，Yamada T, Ohyama H. Radiation-induced interphase death of rat thymocytes is internally programmed(apoptosis).Int J Radiat Biol, 1988, 53:65-75.
4，Caelles C,Helmberg A, Karin M. p53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation of p53-targetgenes. Nature,1994,370:220-223.
5，Hockenbery DM,Oltai ZN,Yin XM,et al. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis.Cell,1993,75:241-251.
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