抑癌基因P16及其在肿瘤研究中的进展
作者：戴文斌 任占平
单位：戴文斌(广西柳州市人民医院 柳州 545001)；任占平(广西柳州市人民医院 柳州 545001)
关键词：肿瘤；抑癌基因P16；医学肿瘤学
右江民族医学院学报0003118 中图分类号：R730.1 文献标识码：A
文章编号：1001-5817(2000)03-0476-02
近年来的研究表明，细胞周期调控体系对维持正常细胞周期是必需的，而调控体系中的任一环节异常均可导致调控紊乱，细胞增殖异常、肿瘤发生。P16是近年发现的一种抑癌基因，作为一个细胞周期调控的关键因子其抑癌作用和频繁的变异在多种肿瘤中得到了证实。现将此基因研究的最新进展综述如下：
, 百拇医药
1 P16基因的结构和功能
最近，Kamb[1]及Serrano[2]分别领导的科研小组发现了一种新型的抑癌基因，即P16基因，又称MIS1或CDKN2(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor)。P16基因定位于9p21不到40kb的范围内。由三个外显子和两个内含子组成，三个外显子长度分别为126bp，307bp和11bp，编码一个16KD的蛋白，即P16蛋白。
在细胞周期中，正常细胞是否进入分裂周期以及分裂周期能否成功完成主要取决于其能否顺利通过若干个关卡，其中最重要的就是G1/S和G2/M转换。在这些转换过程中，CDK起重要作用，可通过调节诸重要底物(如pRb)的磷酸化促进G1/S和G2/M转换，导致细胞增殖。肿瘤抑制基因的主要功能是，在细胞增殖周期的某个环节上对细胞分裂和生长进行适当控制，使细胞按正常程序性周期分裂、生长、死亡，防止周期失调而导致细胞无限制地增殖。
, 百拇医药
P16既是正常细胞周期有效调控者(负反馈调节作用)，又是抑制肿瘤生长的关键成分。P16蛋白能与细胞周期素D(cyclin D)竞争结合细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDKs)中的CDK4和CDK6，抑制其活性，使其一系列底物(如pRb)保持持续去磷酸化高活性，而不能解除pRb对转录因子E2F等的抑制，从而阻止细胞G1期进入S期，直接抑制细胞增殖。相反，当P16基因发生突变、缺失等异常改变时，P16蛋白不能正常表达，使细胞增殖失控，而向癌变发展。此外，在正常细胞中存在着一个负反馈网络[3]，即磷酸化pRb增加时，可引起P16基因表达增强，增加的CDK41与cyclinD竞争结合CDK4而抑制CDK4活性抑制细胞增殖。如果细胞是由于Rb基因丢失或突变而非磷酸化，使之功能丧失，CDK41含量减少，则不能通过这一负反馈循环起生长抑制作用。因而，P16在上述某一个环节的异常，均可导致细胞异常增殖，肿瘤发生。
, 百拇医药
2 P16基因与肿瘤的关系
P16基因在人类多种原发性肿瘤和细胞系中发生变异，包括神经胶质瘤、黑色素瘤、头颈部肿瘤、肺癌、食管癌、膀胱癌、胰腺癌、肾肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、成骨肉瘤等，突变率30%～80%，主要变异形式有纯合性缺失、杂合性缺失、点突变、移码突变、插入、甲基化等[4]。Lee等[5]在研究9株胃癌细胞系和36例原发性胃癌中发现，细胞系中有2例P16基因纯合性缺失，点突变和插入突变各1例；原发性胃癌中仅有1例发现有P16基因重排，没有发现缺失和突变。此外，2株无P16基因缺失和突变的胃癌细胞系发现P16基因5'CPG岛的甲基化，且已甲基化的细胞系用5-aza-2'-dexycytidine处理后5'CPG部位脱甲基化，P16基因恢复正常转录。由此表明通过异常DNA甲基化引起不正常mRNA转录可能是P16基因失活的另一条途径，而由此可导致肿瘤的发生、发展。同时结果表明，原发性胃癌P16基因变异频率(1/36)明显低于细胞系(6/9)。Kamb等认为是原发性肿瘤中存在的正常组织污染，阻碍了P16基因的检测[3]，且得到了一些实验的支持。国内，武玉东等[6]在对51例膀胱移行细胞癌P16基因的研究中发现，11例(21.2%)存在P16基因缺失，仅1例肿瘤于P16基因外显子2出现点突变，19例(36.5%)肿瘤发现P16基因5'CPG岛甲基化，且P16基因缺失多见于早期、高分化肿瘤，而5'CPG岛的甲基化多见于晚期、低分化肿瘤。提示P16基因的缺失和甲基化可能分别是膀胱瘤发展过程中的早、晚期事件。大量资料表明，P16基因与肿瘤临床病理学特征存在密切的关系。吕有勇等[7]用Southern、Norther杂交和PCR技术分析了85例胃癌和5株人胃癌细胞系，发现细胞系中的1株(MKN45)有基因缺失，有2株(PAMC82和BGC823)杂交信号减弱，表达下调；胃癌组织标本检测到P16基因的缺失率为23.1%，而P16基因缺失的病例都属于低分化、有淋巴结转移的进展期胃癌，提示P16基因异常是胃癌癌变的晚期事件，可能与胃癌细胞分化、转移有关。孙梅等[8]对前期工作中确定有mtsl/P16基因表达下调的1株人胃癌细胞系，即PAMC82(由于P16基因高甲基化导致表达水平异常)导入外源性P16基因，结果在裸鼠中的致瘤性显著降低，抑制了肿瘤细胞的恶性增殖和促进细胞分化，同时也提示P16与胃癌的进展有关。石永玉等[9]在研究48例非小细胞性肺癌中发现P16蛋白表达缺失率为52.1%(25/48)，其中2例发生基因突变，P16蛋白表达缺失与癌细胞分化程度及淋巴结转移有关。
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许多研究表明，P16基因的异常与其他基因异常有着互补或相辅相成的关系，例如P16基因缺失的肿瘤，其Rb基因正常；P16基因正常的肿瘤，又常有Rb基因缺失或cyclinD1或CDK4的扩增。Shapiro等[10]在研究32例原发性肺癌和14株细胞系中发现P16和Rb基因表达之间存在相反关系。孟照刚等[11]研究了66例乳腺癌，亦发现P16与pRb表达之间存在显著的负相关，即表达正常野生型Rb蛋白的细胞常有P16表达缺失，而P16表达水平正常的细胞又常有Rb基因表达水平的下降。说明CDK41-Rb通路的高频失活可能是肿瘤形成的重要事件。Okamoto等报道在人肺、食管、肝、结肠和胰腺的肿瘤细胞中明显的有P16ink4与cyclinD1表达量相反关系[12]，提示两者可能存在相互抑制倾向。Igaki等研究了13株食管鳞状细胞癌细胞系中cyclinD1扩增，发现5株出现cyclinD1基因扩增合并P16基因缺失，7株有P16基因缺失而无cyclinD1基因扩增[3]，表明cyclinD1基因扩增过表达及或P16基因缺失，均可使细胞异常生长，导致癌变。有人认为P16基因的失活可能同CDK4增加有关，在过度表达CDK4的神经胶质瘤细胞中可查到纯合性P16基因缺失，提示二者之间可能存在一定调控关系。Wang等[14]对19例黑色素瘤研究，发现CDK4蛋白的阳性率为58%，P16为16%，而良性皮肤痣，CDK4全部为阴性，P16为61%，在部分细胞中发现CDK4与P16蛋白表达之间存在相反关系，提示黑色素瘤细胞中CDK4的过表达是其一个特征，同时也可能反映了CDK4的过表达能自发地促进黑色素瘤细胞的增生。Shiozawa等[15]在研究CDK4和P16在子宫内膜癌中的表达可观测到CDK4核阳性的肿瘤细胞P16阴性，反之亦然，提示这两种蛋白阳性表达之间存在相反关系。但He等[16]在研究45神经胶质瘤和18例细胞系中发现，细胞系中的2例(2/18)和原发性肿瘤中的6例(6/45)同时有P16阳性表达和CDK4基因扩增过表达。P16基因表达缺失与CDK4扩增过表达的关系尚待进一步研究。
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3 P16基因的应用前景
随着人们对细胞周期调控机制研究的不断深入，P16基因在肿瘤发生、发展过程中的作用逐渐被阐明。鉴于P16基因的本身的一些特点，有着广阔的应用前景。首先，P16基因长度仅为P53基因的1/4，便于重组和导入，作为基因诊断治疗易操作；其次，P16直接抑制CDK4的活性，是目前为止发现的唯一一个直接作用于细胞周期的抑癌基因，具有专一性、直接性。根据P16基因作用机理，应用人工合成野生型P16基因替代患者体内变异的P16基因或通过增加患者体内的P16蛋白，加强对CDK4的竞争结合，达到阻止癌细胞增殖的目的，甚至可用其表达蛋白制作抗肿瘤疫苗，从基因、免疫等方面用于肿瘤治疗。而将P16基因改变与肿瘤临床病理学特征结合，可广泛检测P16用于判断病人预后。
, 百拇医药
总之，P16基因的研究将为了解肿瘤的发生、发展机制，有效地指导恶性肿瘤的预防、诊治和预测预后提供新的思路。
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types [J]. Science，1994；264(15)：436
2，Serrano M, Hannon GJ and Beach D.A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4 [J]. Nature，1993；366(16)：704
, 百拇医药
3，袁玉刚，韩德民.抑癌基因P16与头颈部肿瘤[J].国外医学(耳鼻咽喉科分册)，1998；22(1)：11
4，刘德胜，于鸿琴，袁锡兰.肿瘤抑制基因P16与头颈部肿瘤[J].国外医学(肿瘤学分册)，1998；25(1)：30
5，Lee YY, Kang SH, Seo JY, et al. Alterations of P16INK4A and P15INK4B Genes in gastric carcinomas [J]. Cencer，1997；80(10)：1889
6，武玉东，吴海，马腾骧，等.膀胱移行细胞癌中P16基因的改变[J].中国病理学杂志，1999；28(1)：39
7，吕有勇，高崇峰，崔建涛，等.胃癌中MTS1/P16基因缺失及表达异常的研究[J].中华肿瘤杂志，1996；18(3)：189
, 百拇医药
8，孙梅，吕有勇.外源性P16基因表达可抑制胃癌细胞的恶性增殖[J].中华肿瘤杂志，1997；19(6)：410
9，石永玉，魏海明，孟红，等.非小细胞肺癌中抑癌基因P16/MTS1的基因突变和表达缺失[J].肿瘤，1999；19(1)：27
10，Shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inactivation and P16INK4 expression in primary lung cancers and cell lines[J].Cancer Res，1995；55：505
11，孟昭刚，赵彤，陈艺华.人乳腺癌P16、Rb基因表达及其相关性的研究[J].中华肿瘤杂志，1999；21(1)：75
, 百拇医药
12，胡向阳，饶慧蓉.细胞周期调控基因cyclinD1、P16与肿瘤[J].临床与实验病理学杂志，1997；13(4)：360
13，孙宝华，武忠弼，阮幼冰.细胞周期蛋白与肿瘤[J].国外医学(分子生物学分册)，1996；18(6)：278
14，Wang XL, Uhara H, Yamazaki Y, et al. Immunohistochemical detection of CDK4 and P16INK4 proteins in cutaneous malignant melanoma [J]. British Journal of Dermatology，1996；134：269
15，Shiozawa T, Nikaido T, Shimizu M, et al. Immunohistochemical analysis of the expression of CDK4 and P16INK4 in human endometrioid-type endometrial carcinoma [J]. Cancer，1997；80(12)：2250
16，He J, Olson JJ, James CD. Lack of P16INK4 or retinoblastoma protein(pRb), or amplification-associated overexpression of CDK4 is observed in distinct of malignant glial tumors and cell lines [J]. Cancer Res，1995；55：4833
(1999-05-03收稿), 百拇医药
单位：戴文斌(广西柳州市人民医院 柳州 545001)；任占平(广西柳州市人民医院 柳州 545001)
关键词：肿瘤；抑癌基因P16；医学肿瘤学
右江民族医学院学报0003118 中图分类号：R730.1 文献标识码：A
文章编号：1001-5817(2000)03-0476-02
近年来的研究表明，细胞周期调控体系对维持正常细胞周期是必需的，而调控体系中的任一环节异常均可导致调控紊乱，细胞增殖异常、肿瘤发生。P16是近年发现的一种抑癌基因，作为一个细胞周期调控的关键因子其抑癌作用和频繁的变异在多种肿瘤中得到了证实。现将此基因研究的最新进展综述如下：
, 百拇医药
1 P16基因的结构和功能
最近，Kamb[1]及Serrano[2]分别领导的科研小组发现了一种新型的抑癌基因，即P16基因，又称MIS1或CDKN2(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor)。P16基因定位于9p21不到40kb的范围内。由三个外显子和两个内含子组成，三个外显子长度分别为126bp，307bp和11bp，编码一个16KD的蛋白，即P16蛋白。
在细胞周期中，正常细胞是否进入分裂周期以及分裂周期能否成功完成主要取决于其能否顺利通过若干个关卡，其中最重要的就是G1/S和G2/M转换。在这些转换过程中，CDK起重要作用，可通过调节诸重要底物(如pRb)的磷酸化促进G1/S和G2/M转换，导致细胞增殖。肿瘤抑制基因的主要功能是，在细胞增殖周期的某个环节上对细胞分裂和生长进行适当控制，使细胞按正常程序性周期分裂、生长、死亡，防止周期失调而导致细胞无限制地增殖。
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P16既是正常细胞周期有效调控者(负反馈调节作用)，又是抑制肿瘤生长的关键成分。P16蛋白能与细胞周期素D(cyclin D)竞争结合细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDKs)中的CDK4和CDK6，抑制其活性，使其一系列底物(如pRb)保持持续去磷酸化高活性，而不能解除pRb对转录因子E2F等的抑制，从而阻止细胞G1期进入S期，直接抑制细胞增殖。相反，当P16基因发生突变、缺失等异常改变时，P16蛋白不能正常表达，使细胞增殖失控，而向癌变发展。此外，在正常细胞中存在着一个负反馈网络[3]，即磷酸化pRb增加时，可引起P16基因表达增强，增加的CDK41与cyclinD竞争结合CDK4而抑制CDK4活性抑制细胞增殖。如果细胞是由于Rb基因丢失或突变而非磷酸化，使之功能丧失，CDK41含量减少，则不能通过这一负反馈循环起生长抑制作用。因而，P16在上述某一个环节的异常，均可导致细胞异常增殖，肿瘤发生。
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2 P16基因与肿瘤的关系
P16基因在人类多种原发性肿瘤和细胞系中发生变异，包括神经胶质瘤、黑色素瘤、头颈部肿瘤、肺癌、食管癌、膀胱癌、胰腺癌、肾肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、成骨肉瘤等，突变率30%～80%，主要变异形式有纯合性缺失、杂合性缺失、点突变、移码突变、插入、甲基化等[4]。Lee等[5]在研究9株胃癌细胞系和36例原发性胃癌中发现，细胞系中有2例P16基因纯合性缺失，点突变和插入突变各1例；原发性胃癌中仅有1例发现有P16基因重排，没有发现缺失和突变。此外，2株无P16基因缺失和突变的胃癌细胞系发现P16基因5'CPG岛的甲基化，且已甲基化的细胞系用5-aza-2'-dexycytidine处理后5'CPG部位脱甲基化，P16基因恢复正常转录。由此表明通过异常DNA甲基化引起不正常mRNA转录可能是P16基因失活的另一条途径，而由此可导致肿瘤的发生、发展。同时结果表明，原发性胃癌P16基因变异频率(1/36)明显低于细胞系(6/9)。Kamb等认为是原发性肿瘤中存在的正常组织污染，阻碍了P16基因的检测[3]，且得到了一些实验的支持。国内，武玉东等[6]在对51例膀胱移行细胞癌P16基因的研究中发现，11例(21.2%)存在P16基因缺失，仅1例肿瘤于P16基因外显子2出现点突变，19例(36.5%)肿瘤发现P16基因5'CPG岛甲基化，且P16基因缺失多见于早期、高分化肿瘤，而5'CPG岛的甲基化多见于晚期、低分化肿瘤。提示P16基因的缺失和甲基化可能分别是膀胱瘤发展过程中的早、晚期事件。大量资料表明，P16基因与肿瘤临床病理学特征存在密切的关系。吕有勇等[7]用Southern、Norther杂交和PCR技术分析了85例胃癌和5株人胃癌细胞系，发现细胞系中的1株(MKN45)有基因缺失，有2株(PAMC82和BGC823)杂交信号减弱，表达下调；胃癌组织标本检测到P16基因的缺失率为23.1%，而P16基因缺失的病例都属于低分化、有淋巴结转移的进展期胃癌，提示P16基因异常是胃癌癌变的晚期事件，可能与胃癌细胞分化、转移有关。孙梅等[8]对前期工作中确定有mtsl/P16基因表达下调的1株人胃癌细胞系，即PAMC82(由于P16基因高甲基化导致表达水平异常)导入外源性P16基因，结果在裸鼠中的致瘤性显著降低，抑制了肿瘤细胞的恶性增殖和促进细胞分化，同时也提示P16与胃癌的进展有关。石永玉等[9]在研究48例非小细胞性肺癌中发现P16蛋白表达缺失率为52.1%(25/48)，其中2例发生基因突变，P16蛋白表达缺失与癌细胞分化程度及淋巴结转移有关。
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许多研究表明，P16基因的异常与其他基因异常有着互补或相辅相成的关系，例如P16基因缺失的肿瘤，其Rb基因正常；P16基因正常的肿瘤，又常有Rb基因缺失或cyclinD1或CDK4的扩增。Shapiro等[10]在研究32例原发性肺癌和14株细胞系中发现P16和Rb基因表达之间存在相反关系。孟照刚等[11]研究了66例乳腺癌，亦发现P16与pRb表达之间存在显著的负相关，即表达正常野生型Rb蛋白的细胞常有P16表达缺失，而P16表达水平正常的细胞又常有Rb基因表达水平的下降。说明CDK41-Rb通路的高频失活可能是肿瘤形成的重要事件。Okamoto等报道在人肺、食管、肝、结肠和胰腺的肿瘤细胞中明显的有P16ink4与cyclinD1表达量相反关系[12]，提示两者可能存在相互抑制倾向。Igaki等研究了13株食管鳞状细胞癌细胞系中cyclinD1扩增，发现5株出现cyclinD1基因扩增合并P16基因缺失，7株有P16基因缺失而无cyclinD1基因扩增[3]，表明cyclinD1基因扩增过表达及或P16基因缺失，均可使细胞异常生长，导致癌变。有人认为P16基因的失活可能同CDK4增加有关，在过度表达CDK4的神经胶质瘤细胞中可查到纯合性P16基因缺失，提示二者之间可能存在一定调控关系。Wang等[14]对19例黑色素瘤研究，发现CDK4蛋白的阳性率为58%，P16为16%，而良性皮肤痣，CDK4全部为阴性，P16为61%，在部分细胞中发现CDK4与P16蛋白表达之间存在相反关系，提示黑色素瘤细胞中CDK4的过表达是其一个特征，同时也可能反映了CDK4的过表达能自发地促进黑色素瘤细胞的增生。Shiozawa等[15]在研究CDK4和P16在子宫内膜癌中的表达可观测到CDK4核阳性的肿瘤细胞P16阴性，反之亦然，提示这两种蛋白阳性表达之间存在相反关系。但He等[16]在研究45神经胶质瘤和18例细胞系中发现，细胞系中的2例(2/18)和原发性肿瘤中的6例(6/45)同时有P16阳性表达和CDK4基因扩增过表达。P16基因表达缺失与CDK4扩增过表达的关系尚待进一步研究。
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3 P16基因的应用前景
随着人们对细胞周期调控机制研究的不断深入，P16基因在肿瘤发生、发展过程中的作用逐渐被阐明。鉴于P16基因的本身的一些特点，有着广阔的应用前景。首先，P16基因长度仅为P53基因的1/4，便于重组和导入，作为基因诊断治疗易操作；其次，P16直接抑制CDK4的活性，是目前为止发现的唯一一个直接作用于细胞周期的抑癌基因，具有专一性、直接性。根据P16基因作用机理，应用人工合成野生型P16基因替代患者体内变异的P16基因或通过增加患者体内的P16蛋白，加强对CDK4的竞争结合，达到阻止癌细胞增殖的目的，甚至可用其表达蛋白制作抗肿瘤疫苗，从基因、免疫等方面用于肿瘤治疗。而将P16基因改变与肿瘤临床病理学特征结合，可广泛检测P16用于判断病人预后。
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总之，P16基因的研究将为了解肿瘤的发生、发展机制，有效地指导恶性肿瘤的预防、诊治和预测预后提供新的思路。
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types [J]. Science，1994；264(15)：436
2，Serrano M, Hannon GJ and Beach D.A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4 [J]. Nature，1993；366(16)：704
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3，袁玉刚，韩德民.抑癌基因P16与头颈部肿瘤[J].国外医学(耳鼻咽喉科分册)，1998；22(1)：11
4，刘德胜，于鸿琴，袁锡兰.肿瘤抑制基因P16与头颈部肿瘤[J].国外医学(肿瘤学分册)，1998；25(1)：30
5，Lee YY, Kang SH, Seo JY, et al. Alterations of P16INK4A and P15INK4B Genes in gastric carcinomas [J]. Cencer，1997；80(10)：1889
6，武玉东，吴海，马腾骧，等.膀胱移行细胞癌中P16基因的改变[J].中国病理学杂志，1999；28(1)：39
7，吕有勇，高崇峰，崔建涛，等.胃癌中MTS1/P16基因缺失及表达异常的研究[J].中华肿瘤杂志，1996；18(3)：189
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8，孙梅，吕有勇.外源性P16基因表达可抑制胃癌细胞的恶性增殖[J].中华肿瘤杂志，1997；19(6)：410
9，石永玉，魏海明，孟红，等.非小细胞肺癌中抑癌基因P16/MTS1的基因突变和表达缺失[J].肿瘤，1999；19(1)：27
10，Shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inactivation and P16INK4 expression in primary lung cancers and cell lines[J].Cancer Res，1995；55：505
11，孟昭刚，赵彤，陈艺华.人乳腺癌P16、Rb基因表达及其相关性的研究[J].中华肿瘤杂志，1999；21(1)：75
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12，胡向阳，饶慧蓉.细胞周期调控基因cyclinD1、P16与肿瘤[J].临床与实验病理学杂志，1997；13(4)：360
13，孙宝华，武忠弼，阮幼冰.细胞周期蛋白与肿瘤[J].国外医学(分子生物学分册)，1996；18(6)：278
14，Wang XL, Uhara H, Yamazaki Y, et al. Immunohistochemical detection of CDK4 and P16INK4 proteins in cutaneous malignant melanoma [J]. British Journal of Dermatology，1996；134：269
15，Shiozawa T, Nikaido T, Shimizu M, et al. Immunohistochemical analysis of the expression of CDK4 and P16INK4 in human endometrioid-type endometrial carcinoma [J]. Cancer，1997；80(12)：2250
16，He J, Olson JJ, James CD. Lack of P16INK4 or retinoblastoma protein(pRb), or amplification-associated overexpression of CDK4 is observed in distinct of malignant glial tumors and cell lines [J]. Cancer Res，1995；55：4833
(1999-05-03收稿), 百拇医药