双位酶免疫法测定NT-3cDNA/CHO细胞上清中rNT-3含量
季爱民 李梅 张忠义 邹恒琴
摘 要 目的：定量测定NT-3cDNA/CHO细胞培养上清中基因重组NT-3的含量。方法：利用NT-3的MoAb,建立了双位EIA法。结果：该法检测限为5.0pg/ml,批内差的变异系数为6.2%～11.4%(n=6),批间差变异系数为5.4%～8.2%(n=6)。4株阳性细胞培养上清中有高水平的目的产物。结论：该EIA法简单准确;用该法成功筛选到一最高表达基因重组NT-3的单克隆细胞株。
关键词：神经营养蛋白-3 抗NT-3单克隆抗体3W3 双位酶免疫测定法(EIA)
神经营养蛋白-3(Neurotrophin-3,简称NT-3)是神经营养因子家族成员之一。NT-3能促进中枢及外周神经系统多种神经元的生存与发育[1]。由于天然NT-3含量少,不能通过纯化获得其天然产物,为此我们利用基因重组技术,建立了能高水平表达基因重组NT-3的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系；为了定量筛选阳性细胞株,利用NT-3的单克隆抗体3W3,建立了双位酶免疫分析法(two-site enzyme immunoassay, EIA),测定了四株阳性细胞的表达水平,得到了最高表达目的蛋白的细胞株,也为测定其它生物样品中NT-3的含量提供了方法。
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1 实验材料与仪器 NT-3cDNA/CHO细胞株(自建);基因重组大鼠NT-3标准品(CHO细胞表达,日本Takeya Komiya博士赠,Takeda Chemical Industries公司);NT-3单克隆抗体3W3(日本Takeya Komiya博士赠,Takeda Chemical Industries公司);邻苯二胺(OPD,市售);羊抗鼠-HRP二抗(华美生物工程公司产品);酶联仪(第四军医大学)。
2 实验方法
2.1 建立双位EIA工作曲线 用0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释3W3,使浓度为0.5μg/ml;96孔酶联板每孔中加入100μl该溶液包被,4℃孵育过夜;用PBS洗板3次;加入含25%脱脂奶粉的PBS进行封闭,室温放置4h;PBS洗板3次;用PBS+10%脱脂奶粉稀释NT-3标准品,使成系列浓度为0,5pg/ml,10pg/ml,100pg/ml,200pg/ml,500pg/ml,800pg/ml,1000pg/ml,酶联板每孔中分别加入100μl样品,4℃孵化4h;PBS洗板3次;加入用PBS稀释的5μg/ml的3W3,室温孵化过夜;PBS洗涤3次;加入用PBS按1∶400稀释的羊抗鼠-HRP 100μl,室温孵化4h;洗涤后加入100μl含邻苯二胺的反应底物,酶联仪上测定吸收度值,检测波长为492nm。
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2.2 制备样品 用脂质体法将含大鼠NT-3cDNA的表达质粒和空载体分别转染CHO细胞后,经抗生素加压培养,得到了四株NT-3cDNA/CHO阳性单克隆细胞(I，II，III及IV)及一株空载体/CHO单克隆细胞(V)(另文述)。将这五株细胞同代扩增后,每瓶按1×106细胞数接种,待细胞生长融合后,更换为8ml无血清培养基,正常CHO细胞按同法培养。等细胞培养48及72h后,收集培养上清,去离子水充分透析后,再用去离子水稀释至原体积的1000倍为样品待测。
2.3 测定样品 方法同工作曲线,上述样品更换NT-3标准,空载体/CHO细胞培养上清为阴性对照。
3 结 果
3.1 双位EIA方法测定NT-3工作曲线 本方法中,NT-3标准品的浓度在10～1000pg/ml的范围内,经4次重复测定结果表明,NT-3的浓度与吸收度值呈良好的线性关系,线性方程:A=0.00108C-0.0166,r=0.986,P<0.01。基因重组NT-3的检测限为5pg/ml。
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本文对所建立的双位EIA法进行了方法回收率测定,正常CHO无血清培养上清充分透析后,加入NT-3标准品,使浓度为100,200,500及800pg/ml,每个浓度测6次,结果平均绝对回收率为105.5%,说明本文建立的EIA方法测定结果准确。
本文对所建立的EIA检测系统进行了精确性评估,测定了4个不同的NT-3浓度,结果本法批内差的变异系数为6.2%～11.4%(n=6),批间差变异系数为5.4%～8.2%(n=6),说明本法的测定是非常可靠的,见表1。
表1 EIA法测定NT-3的批内批间差(x±s，n=6)
样 品
NT-3含量/pg.ml-1
变异系数
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批内差
1
19.3±2.2
11.4
2
103.4±9.8
9.5
3
269.6±18.3
6.8
4
524.3±32.5
6.2
, 百拇医药
批间差
1
19.4±1.6
8.2
2
102.1±6.8
6.7
3
255.7±14.3
5.6
4
503.4±27.2
5.4
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3.2 NT-3cDNA/CHO细胞上清中NT-3的浓度 本文用所建双位EIA法,测定了4株NT-3cDNA/CHO单克隆细胞及一株阴性对照CHO细胞培养上清中基因重组NT-3的水平,各细胞培养上清均稀释1000倍,测定结果表明阴性对照CHO细胞培养上清中未检测到NT-3,阳性细胞培养上清中都有较高水平的NT-3,而Ⅲ号阳性细胞培养上清中NT-3的含量最高,故选择Ⅲ号阳性细胞株为工程细胞株,大量扩增备用,见表2。表2 不同细胞株上清中NT-3的含量(pg/ml)
细胞克隆
NT-3含量
Ⅰ
262.6
Ⅱ
283.8
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Ⅲ
324.3
Ⅳ
297.5
Ⅴ
0
4 讨 论
4.1 在建立能表达基因重组外源蛋白的细胞系时,往往得到多个单克隆细胞株,因此有必要建立适当的方法筛选到最高表达水平目的蛋白的细胞株;经常利用生物功能的方法筛选,但该法需建立细胞或动物模型,比较麻烦;本文建立的双位EIA法测定细胞培养上清中rNT-3的含量,方便快速,灵敏度高,不需要纯化即可直接测定目的蛋白含量,可快速筛选到最高表达水平的细胞株。
4.2CHO细胞分泌基因重组NT-3时,NT-3是以同源二聚体的形式出现的,所以用双位EIA法可直接测定其含量[2]。
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4.3 比较人、小鼠及大鼠体内成熟NT-3氨基酸序列时发现,三者完全一样[1]。用大鼠NT-3cDNA表达的蛋白,可以完全代替人体内的NT-3蛋白,这为用抗人NT-3的单克隆抗体3W3来测定鼠NT-3蛋白奠定了理论基础。
4.4 虽然NT-3与家族成员神经生长因子(NGF)及脑源性神经营养因子(BDNF)间氨基酸序列的同源性超过50%,但用3W3为抗体建立的EIA法,测定NT-3含量时,与NGF及BDNF无交差反应性[3]。 基金项目：广东省自然科学基金资助项目(960364)
作者简介：季爱民,男,32岁。博士,副主任药师,药剂学专业硕士生导师
作者单位：广州 510282 第一军医大学珠江医院药材科
参考文献
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1 Maisonpierre PC,Belluscio L,Squinto S,et al.Neurotrophin-3:a neurotrophic factor related to NGF and BDNF.Science，1990，247∶1446.
2 Shintani A,Watanabe T,Kuroshima K,et al.Monoclonal antibodies against human Neurotrophin-3.Biochemical and Biophysical Research Communications，1993;194(3)∶1500.
3 Stine Soderstrom，Ted Ebendal.The levels of NT-3 protein in the brain determined by enzyme immunoassay show a pattern distinct from nerve growth factor.Neuroscience Letters，1995，189∶5., http://www.100md.com
摘 要 目的：定量测定NT-3cDNA/CHO细胞培养上清中基因重组NT-3的含量。方法：利用NT-3的MoAb,建立了双位EIA法。结果：该法检测限为5.0pg/ml,批内差的变异系数为6.2%～11.4%(n=6),批间差变异系数为5.4%～8.2%(n=6)。4株阳性细胞培养上清中有高水平的目的产物。结论：该EIA法简单准确;用该法成功筛选到一最高表达基因重组NT-3的单克隆细胞株。
关键词：神经营养蛋白-3 抗NT-3单克隆抗体3W3 双位酶免疫测定法(EIA)
神经营养蛋白-3(Neurotrophin-3,简称NT-3)是神经营养因子家族成员之一。NT-3能促进中枢及外周神经系统多种神经元的生存与发育[1]。由于天然NT-3含量少,不能通过纯化获得其天然产物,为此我们利用基因重组技术,建立了能高水平表达基因重组NT-3的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系；为了定量筛选阳性细胞株,利用NT-3的单克隆抗体3W3,建立了双位酶免疫分析法(two-site enzyme immunoassay, EIA),测定了四株阳性细胞的表达水平,得到了最高表达目的蛋白的细胞株,也为测定其它生物样品中NT-3的含量提供了方法。
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1 实验材料与仪器 NT-3cDNA/CHO细胞株(自建);基因重组大鼠NT-3标准品(CHO细胞表达,日本Takeya Komiya博士赠,Takeda Chemical Industries公司);NT-3单克隆抗体3W3(日本Takeya Komiya博士赠,Takeda Chemical Industries公司);邻苯二胺(OPD,市售);羊抗鼠-HRP二抗(华美生物工程公司产品);酶联仪(第四军医大学)。
2 实验方法
2.1 建立双位EIA工作曲线 用0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释3W3,使浓度为0.5μg/ml;96孔酶联板每孔中加入100μl该溶液包被,4℃孵育过夜;用PBS洗板3次;加入含25%脱脂奶粉的PBS进行封闭,室温放置4h;PBS洗板3次;用PBS+10%脱脂奶粉稀释NT-3标准品,使成系列浓度为0,5pg/ml,10pg/ml,100pg/ml,200pg/ml,500pg/ml,800pg/ml,1000pg/ml,酶联板每孔中分别加入100μl样品,4℃孵化4h;PBS洗板3次;加入用PBS稀释的5μg/ml的3W3,室温孵化过夜;PBS洗涤3次;加入用PBS按1∶400稀释的羊抗鼠-HRP 100μl,室温孵化4h;洗涤后加入100μl含邻苯二胺的反应底物,酶联仪上测定吸收度值,检测波长为492nm。
, 百拇医药
2.2 制备样品 用脂质体法将含大鼠NT-3cDNA的表达质粒和空载体分别转染CHO细胞后,经抗生素加压培养,得到了四株NT-3cDNA/CHO阳性单克隆细胞(I，II，III及IV)及一株空载体/CHO单克隆细胞(V)(另文述)。将这五株细胞同代扩增后,每瓶按1×106细胞数接种,待细胞生长融合后,更换为8ml无血清培养基,正常CHO细胞按同法培养。等细胞培养48及72h后,收集培养上清,去离子水充分透析后,再用去离子水稀释至原体积的1000倍为样品待测。
2.3 测定样品 方法同工作曲线,上述样品更换NT-3标准,空载体/CHO细胞培养上清为阴性对照。
3 结 果
3.1 双位EIA方法测定NT-3工作曲线 本方法中,NT-3标准品的浓度在10～1000pg/ml的范围内,经4次重复测定结果表明,NT-3的浓度与吸收度值呈良好的线性关系,线性方程:A=0.00108C-0.0166,r=0.986,P<0.01。基因重组NT-3的检测限为5pg/ml。
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本文对所建立的双位EIA法进行了方法回收率测定,正常CHO无血清培养上清充分透析后,加入NT-3标准品,使浓度为100,200,500及800pg/ml,每个浓度测6次,结果平均绝对回收率为105.5%,说明本文建立的EIA方法测定结果准确。
本文对所建立的EIA检测系统进行了精确性评估,测定了4个不同的NT-3浓度,结果本法批内差的变异系数为6.2%～11.4%(n=6),批间差变异系数为5.4%～8.2%(n=6),说明本法的测定是非常可靠的,见表1。
表1 EIA法测定NT-3的批内批间差(x±s，n=6)
样 品
NT-3含量/pg.ml-1
变异系数
, 百拇医药
批内差
1
19.3±2.2
11.4
2
103.4±9.8
9.5
3
269.6±18.3
6.8
4
524.3±32.5
6.2
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批间差
1
19.4±1.6
8.2
2
102.1±6.8
6.7
3
255.7±14.3
5.6
4
503.4±27.2
5.4
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3.2 NT-3cDNA/CHO细胞上清中NT-3的浓度 本文用所建双位EIA法,测定了4株NT-3cDNA/CHO单克隆细胞及一株阴性对照CHO细胞培养上清中基因重组NT-3的水平,各细胞培养上清均稀释1000倍,测定结果表明阴性对照CHO细胞培养上清中未检测到NT-3,阳性细胞培养上清中都有较高水平的NT-3,而Ⅲ号阳性细胞培养上清中NT-3的含量最高,故选择Ⅲ号阳性细胞株为工程细胞株,大量扩增备用,见表2。表2 不同细胞株上清中NT-3的含量(pg/ml)
细胞克隆
NT-3含量
Ⅰ
262.6
Ⅱ
283.8
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Ⅲ
324.3
Ⅳ
297.5
Ⅴ
0
4 讨 论
4.1 在建立能表达基因重组外源蛋白的细胞系时,往往得到多个单克隆细胞株,因此有必要建立适当的方法筛选到最高表达水平目的蛋白的细胞株;经常利用生物功能的方法筛选,但该法需建立细胞或动物模型,比较麻烦;本文建立的双位EIA法测定细胞培养上清中rNT-3的含量,方便快速,灵敏度高,不需要纯化即可直接测定目的蛋白含量,可快速筛选到最高表达水平的细胞株。
4.2CHO细胞分泌基因重组NT-3时,NT-3是以同源二聚体的形式出现的,所以用双位EIA法可直接测定其含量[2]。
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4.3 比较人、小鼠及大鼠体内成熟NT-3氨基酸序列时发现,三者完全一样[1]。用大鼠NT-3cDNA表达的蛋白,可以完全代替人体内的NT-3蛋白,这为用抗人NT-3的单克隆抗体3W3来测定鼠NT-3蛋白奠定了理论基础。
4.4 虽然NT-3与家族成员神经生长因子(NGF)及脑源性神经营养因子(BDNF)间氨基酸序列的同源性超过50%,但用3W3为抗体建立的EIA法,测定NT-3含量时,与NGF及BDNF无交差反应性[3]。 基金项目：广东省自然科学基金资助项目(960364)
作者简介：季爱民,男,32岁。博士,副主任药师,药剂学专业硕士生导师
作者单位：广州 510282 第一军医大学珠江医院药材科
参考文献
, http://www.100md.com
1 Maisonpierre PC,Belluscio L,Squinto S,et al.Neurotrophin-3:a neurotrophic factor related to NGF and BDNF.Science，1990，247∶1446.
2 Shintani A,Watanabe T,Kuroshima K,et al.Monoclonal antibodies against human Neurotrophin-3.Biochemical and Biophysical Research Communications，1993;194(3)∶1500.
3 Stine Soderstrom，Ted Ebendal.The levels of NT-3 protein in the brain determined by enzyme immunoassay show a pattern distinct from nerve growth factor.Neuroscience Letters，1995，189∶5., http://www.100md.com