来氟米特水溶液化学稳定性的研究
朱全刚 胡晋红 孙华君
摘 要 目的：研究广泛pH范围内来氟米特的化学稳定性。方法：建立来氟米特的HPLC测定方法，测定不同温度下不同pH值时来氟米特分解的速度常数，得到不同pH值时的分解活化能及不同温度下的最稳定pH值。结果：常温(20～40℃)下来氟米特最稳定的pH范围是2.85～4.56，活化能数值恰在此范围内出现极大值。最稳定的pH范围随温度升高而向低pH值方向移动，当温度大于60℃时，最稳定pH值为1.80以下。结论：适当调整溶液的pH值可以显著改善来氟米特的化学稳定性,为其制剂学研究提供了部分依据。
关键词：来氟米特 药物稳定性 经典恒温法 高效液相色谱，反相
来氟米特(leflunomide，LFM)是新型的具有抗炎及免疫抑制作用的异唑类衍生物，其作用机制不同于已知的其他抗炎及免疫抑制药物，对多种自身免疫性疾病有治疗作用。Ⅱ期临床试验显示LFM治疗类风湿性关节炎效果显著，现正在欧、美进行Ⅲ期临床试验[1]。但LFM是一种前体药物，在人及动物体内转化成活性开环代谢物A77 1726(图1)[2]，使LFM水溶液呈不稳定性，关于其分解的活化能(E)及最稳定pH值的研究未见报道。我们采用经典恒温法对LFM水溶液的化学稳定性进行研究，以反相HPLC法测定其含量，为新药LFM的制剂学研究提供理论依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 仪器和试药 Waters Maxima 820系统，包括Waters 510泵，Waters 486可变波长紫外检测器，U6K 进样器(美国Waters公司);UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);CS501型超级恒温器(重庆实验设备厂);pH S-3D型pH计(上海三信仪表厂)。LFM(药物合成室提供);萘(色谱纯，上海试剂一厂);甲醇(色谱纯，上海化学试剂研究所)。其他试剂均为分析纯。
1.2 LFM供试液的配制 实验在pH1.80～7.34内进行，约每隔1pH单位作一个数据点。缓冲液按英国药典(1993年版)方法配制，pH1.80～4.56用醋酸盐，pH5.88～7.34用磷酸盐，pH精确度±0.03。配制一定pH值的15.28μg/ml LFM溶液，立即封装于2ml安瓿。
图1 来氟米特及A77 1726的化学结构
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Fig 1 Chemical structure of leflunomide and A77 1726
1.3 加速实验 将供试液立即置于恒温水浴中，定时取样，每次10支，冰箱骤冷，终止反应，打碎混匀。加速实验温度为66,71,77,82及87℃，温度控制±0.5℃。
1.4 LFM的含量测定方法
1.4.1 色谱条件 色谱柱ODS C18柱(4.6mm×150mm,10μm，大连化学物理研究所)，流动相为甲醇∶水∶磷酸(67∶33∶0.006)，流速1.0ml/min，检测波长260nm，灵敏度0.01 AUFS，萘为内标，进样量20μl。色谱图见图2。
1.4.2 标准曲线的制备 准确配制质量浓度为16.4 μg/ml的萘储备液和质量浓度为38.2μg/ml的LFM储备液。精密量取LFM储备液0.025,0.050,0.100,0.250,0.500,1.000,2.000ml至10ml量瓶中，加入萘储备液1.000ml，用流动相稀释成0.095 5，0.191，0.382，0.955，1.91，3.82，7.64μg/ml的标准液。以LFM的质量浓度(ρ)对其与内标的峰面积比(R)进行回归，得标准曲线方程ρ=-0.0020+0.6989R，r=0.9999(n=7)。
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1.4.3 供试液的含量测定 精取供试液0.2ml，加内标萘储备液0.1ml，用流动相稀释至1.0ml，进样测定。
图2 LFM和萘的HPLC图
Fig 2 HPLC of LFM and naphthalene
A:LFM；B:Naphthalene
2 结 果
2.1 不同pH值时的Arrhenius方程 实验得到不同pH时各温度下的分解速度常数k值，用lgk对1/T(T为热力学温度)回归，得Arrhenius方程，并根据方程计算出不同pH值的分解活化能E及248 K(25℃)的t1/2，见表1。
表1 不同pH时LFM分解的Arrhenius方程
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Tab 1 Arrhenius equation of leflunomide for different pH values
pH Values
Arrhenius equation
r
E (kJ/mol)
t1/2(t/h)
1.80
lgk= 0.395 7-1.050 5×103×1/T
-0.9910
20.1131
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933.69
2.85
lgk=12.288 9-4.926 3×103×1/T
-0.9986
94.3201
12107.13
3.76
lgk=13.055 7-5.036 0×103×1/T
-0.9949
96.4205
4834.62
, 百拇医药
4.56
lgk=14.138 3-5.448 1×103×1/T
-0.9904
104.3106
9838.93
5.88
lgk=12.591 9-4.661 4×103×1/T
-0.9656
89.2483
778.24
6.84
, 百拇医药
lgk=14.702 6-5.166 3×103×1/T
-0.9947
98.9152
298.34
7.34
lgk=13.846 5-4.831 4×103×1/T
-0.9911
92.5031
161.06
2.2 不同pH值时不同温度下的速度常数k 根据Arrhenius方程推算出不同pH值时20，40，60，70，80及90℃下的速度常数k，作lgk-pH图，见图3。常温(20～40℃)下反应速度常数k出现极小值的pH值是2.85～4.56(图3)，LFM的分解活化能数值亦在此范围内出现极大值(表1)，此点符合化学反应动力学的一般情况，即Arrhenius方程中指前因子A(亦称频率因子)相近时，活化能高，反应速度小。LFM的分解反应速度随温度升高而加剧，稳定的pH值范围随温度升高而向低pH值方向移动，当温度大于60℃时，最稳定pH值为1.80以下(图3)。
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图3 不同pH时不同温度下的速度常数k
Fig 3 Rate constant for different pH values at different temperatures
○：20℃；●：40℃；□：60℃；■：70℃；△：80℃；▲：90℃
3 讨 论
LFM的含量测定方法国内未见报道，国外报道可采用HPLC法测定[3]，但不详细。本研究选用在LFM最大吸收峰260nm附近也有较强紫外吸收的萘为内标，适当调整流动相的比例，内标萘的保留时间约9.11min，LFM的保留时间约5.92min，两峰分离完全，无杂质干扰峰，检测限达0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.76%(n= 5)和0.86%(n= 5)，方法回收率为99.66%(RSD=0.80%)。 降解产物A77 1726的最大吸收波长在290nm附近， 该实验条件下未出现其他的色谱峰，不干扰LFM的测定，我们将在以后的实验中建立A77 1726的含量测定方法。本法的建立为进一步开展LFM的制剂学、药代动力学、药效学等的研究提供了一种简便、可靠的分析手段。
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有关LFM水溶液的稳定性研究，由于专利或新药保护等问题，国外未见有类似文献报道。本实验发现LFM的分解是受pH值影响的一级反应，其分解活化能与pH值有关。但在pH1.80时，指前因子A和活化能E都特别小，此时活化能与其他pH值条件下的活化能不具可比性。由于活化能所反映的是速度常数k随温度T的变化率(dlnk/dT=E/RT2)[4]，pH1.80时k随温度T的变化率最小，因而此时活化能亦最小，这同时说明pH1.80条件下LFM的稳定性受温度的影响最小。总之，就温度而言，LFM水溶液的最稳定pH值可取1.80或更低;但就样品的常温贮存和实验操作的一般要求而言，LFM水溶液的最稳定pH值可取2.85～4.56,此时溶液的t1/2最长。实验过程中曾对LFM在较强碱性条件下的稳定性作过观察，因其分解迅速而未做进一步的研究。
致谢 本实验得到本校药学院药剂学教研室蒋雪涛教授的指导。
全军“九五”医学科研规划重点课题，项目编号98M077
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作者单位：第二军医大学长海医院药学部，上海，200433
作者简介：朱全刚，男，1968年10月生，硕士，主管药师
参 考 文 献
[1] 朱全刚，胡晋红，孙华君.新型抗炎及免疫调节药来氟米特.中国新药杂志，1998,7(增刊)：17
[2] Silva HT,Morris RE.Leflunomide and malononitrilamides.Am J Med Sci，1997，313(5):289
[3] Lucien J,Dias VC,LeGatt DF,et al.Blood distribution and single-dose pharmacokinetics of leflunomide.Ther Drug Monit，1995,17(5):454
[4] 殷恭宽.药物的稳定性.见：殷恭宽 主编.物理药学.北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社，1993.354, 百拇医药
摘 要 目的：研究广泛pH范围内来氟米特的化学稳定性。方法：建立来氟米特的HPLC测定方法，测定不同温度下不同pH值时来氟米特分解的速度常数，得到不同pH值时的分解活化能及不同温度下的最稳定pH值。结果：常温(20～40℃)下来氟米特最稳定的pH范围是2.85～4.56，活化能数值恰在此范围内出现极大值。最稳定的pH范围随温度升高而向低pH值方向移动，当温度大于60℃时，最稳定pH值为1.80以下。结论：适当调整溶液的pH值可以显著改善来氟米特的化学稳定性,为其制剂学研究提供了部分依据。
关键词：来氟米特 药物稳定性 经典恒温法 高效液相色谱，反相
来氟米特(leflunomide，LFM)是新型的具有抗炎及免疫抑制作用的异唑类衍生物，其作用机制不同于已知的其他抗炎及免疫抑制药物，对多种自身免疫性疾病有治疗作用。Ⅱ期临床试验显示LFM治疗类风湿性关节炎效果显著，现正在欧、美进行Ⅲ期临床试验[1]。但LFM是一种前体药物，在人及动物体内转化成活性开环代谢物A77 1726(图1)[2]，使LFM水溶液呈不稳定性，关于其分解的活化能(E)及最稳定pH值的研究未见报道。我们采用经典恒温法对LFM水溶液的化学稳定性进行研究，以反相HPLC法测定其含量，为新药LFM的制剂学研究提供理论依据。
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1 材料和方法
1.1 仪器和试药 Waters Maxima 820系统，包括Waters 510泵，Waters 486可变波长紫外检测器，U6K 进样器(美国Waters公司);UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);CS501型超级恒温器(重庆实验设备厂);pH S-3D型pH计(上海三信仪表厂)。LFM(药物合成室提供);萘(色谱纯，上海试剂一厂);甲醇(色谱纯，上海化学试剂研究所)。其他试剂均为分析纯。
1.2 LFM供试液的配制 实验在pH1.80～7.34内进行，约每隔1pH单位作一个数据点。缓冲液按英国药典(1993年版)方法配制，pH1.80～4.56用醋酸盐，pH5.88～7.34用磷酸盐，pH精确度±0.03。配制一定pH值的15.28μg/ml LFM溶液，立即封装于2ml安瓿。
图1 来氟米特及A77 1726的化学结构
, 百拇医药
Fig 1 Chemical structure of leflunomide and A77 1726
1.3 加速实验 将供试液立即置于恒温水浴中，定时取样，每次10支，冰箱骤冷，终止反应，打碎混匀。加速实验温度为66,71,77,82及87℃，温度控制±0.5℃。
1.4 LFM的含量测定方法
1.4.1 色谱条件 色谱柱ODS C18柱(4.6mm×150mm,10μm，大连化学物理研究所)，流动相为甲醇∶水∶磷酸(67∶33∶0.006)，流速1.0ml/min，检测波长260nm，灵敏度0.01 AUFS，萘为内标，进样量20μl。色谱图见图2。
1.4.2 标准曲线的制备 准确配制质量浓度为16.4 μg/ml的萘储备液和质量浓度为38.2μg/ml的LFM储备液。精密量取LFM储备液0.025,0.050,0.100,0.250,0.500,1.000,2.000ml至10ml量瓶中，加入萘储备液1.000ml，用流动相稀释成0.095 5，0.191，0.382，0.955，1.91，3.82，7.64μg/ml的标准液。以LFM的质量浓度(ρ)对其与内标的峰面积比(R)进行回归，得标准曲线方程ρ=-0.0020+0.6989R，r=0.9999(n=7)。
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1.4.3 供试液的含量测定 精取供试液0.2ml，加内标萘储备液0.1ml，用流动相稀释至1.0ml，进样测定。
图2 LFM和萘的HPLC图
Fig 2 HPLC of LFM and naphthalene
A:LFM；B:Naphthalene
2 结 果
2.1 不同pH值时的Arrhenius方程 实验得到不同pH时各温度下的分解速度常数k值，用lgk对1/T(T为热力学温度)回归，得Arrhenius方程，并根据方程计算出不同pH值的分解活化能E及248 K(25℃)的t1/2，见表1。
表1 不同pH时LFM分解的Arrhenius方程
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Tab 1 Arrhenius equation of leflunomide for different pH values
pH Values
Arrhenius equation
r
E (kJ/mol)
t1/2(t/h)
1.80
lgk= 0.395 7-1.050 5×103×1/T
-0.9910
20.1131
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933.69
2.85
lgk=12.288 9-4.926 3×103×1/T
-0.9986
94.3201
12107.13
3.76
lgk=13.055 7-5.036 0×103×1/T
-0.9949
96.4205
4834.62
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4.56
lgk=14.138 3-5.448 1×103×1/T
-0.9904
104.3106
9838.93
5.88
lgk=12.591 9-4.661 4×103×1/T
-0.9656
89.2483
778.24
6.84
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lgk=14.702 6-5.166 3×103×1/T
-0.9947
98.9152
298.34
7.34
lgk=13.846 5-4.831 4×103×1/T
-0.9911
92.5031
161.06
2.2 不同pH值时不同温度下的速度常数k 根据Arrhenius方程推算出不同pH值时20，40，60，70，80及90℃下的速度常数k，作lgk-pH图，见图3。常温(20～40℃)下反应速度常数k出现极小值的pH值是2.85～4.56(图3)，LFM的分解活化能数值亦在此范围内出现极大值(表1)，此点符合化学反应动力学的一般情况，即Arrhenius方程中指前因子A(亦称频率因子)相近时，活化能高，反应速度小。LFM的分解反应速度随温度升高而加剧，稳定的pH值范围随温度升高而向低pH值方向移动，当温度大于60℃时，最稳定pH值为1.80以下(图3)。
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图3 不同pH时不同温度下的速度常数k
Fig 3 Rate constant for different pH values at different temperatures
○：20℃；●：40℃；□：60℃；■：70℃；△：80℃；▲：90℃
3 讨 论
LFM的含量测定方法国内未见报道，国外报道可采用HPLC法测定[3]，但不详细。本研究选用在LFM最大吸收峰260nm附近也有较强紫外吸收的萘为内标，适当调整流动相的比例，内标萘的保留时间约9.11min，LFM的保留时间约5.92min，两峰分离完全，无杂质干扰峰，检测限达0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.76%(n= 5)和0.86%(n= 5)，方法回收率为99.66%(RSD=0.80%)。 降解产物A77 1726的最大吸收波长在290nm附近， 该实验条件下未出现其他的色谱峰，不干扰LFM的测定，我们将在以后的实验中建立A77 1726的含量测定方法。本法的建立为进一步开展LFM的制剂学、药代动力学、药效学等的研究提供了一种简便、可靠的分析手段。
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有关LFM水溶液的稳定性研究，由于专利或新药保护等问题，国外未见有类似文献报道。本实验发现LFM的分解是受pH值影响的一级反应，其分解活化能与pH值有关。但在pH1.80时，指前因子A和活化能E都特别小，此时活化能与其他pH值条件下的活化能不具可比性。由于活化能所反映的是速度常数k随温度T的变化率(dlnk/dT=E/RT2)[4]，pH1.80时k随温度T的变化率最小，因而此时活化能亦最小，这同时说明pH1.80条件下LFM的稳定性受温度的影响最小。总之，就温度而言，LFM水溶液的最稳定pH值可取1.80或更低;但就样品的常温贮存和实验操作的一般要求而言，LFM水溶液的最稳定pH值可取2.85～4.56,此时溶液的t1/2最长。实验过程中曾对LFM在较强碱性条件下的稳定性作过观察，因其分解迅速而未做进一步的研究。
致谢 本实验得到本校药学院药剂学教研室蒋雪涛教授的指导。
全军“九五”医学科研规划重点课题，项目编号98M077
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作者单位：第二军医大学长海医院药学部，上海，200433
作者简介：朱全刚，男，1968年10月生，硕士，主管药师
参 考 文 献
[1] 朱全刚，胡晋红，孙华君.新型抗炎及免疫调节药来氟米特.中国新药杂志，1998,7(增刊)：17
[2] Silva HT,Morris RE.Leflunomide and malononitrilamides.Am J Med Sci，1997，313(5):289
[3] Lucien J,Dias VC,LeGatt DF,et al.Blood distribution and single-dose pharmacokinetics of leflunomide.Ther Drug Monit，1995,17(5):454
[4] 殷恭宽.药物的稳定性.见：殷恭宽 主编.物理药学.北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社，1993.354, 百拇医药