N-乙酰半胱氨酸对硫代乙酰胺致大鼠肝衰竭的防治作用
作者：王佩 吴锡铭
单位：杭州 310014 杭州市第六人民医院药理室
关键词：
中国现代应用药学000405 摘要 目的：观察N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对硫代 乙酰胺(Thioacetamide,TAA)引起大鼠暴发性肝衰竭(Fulminant Hepatic Failure,FHF)的预 防治疗作用。方法：取SD♂大鼠分6组，除正常对照组外，均ip TAA 300 mg/kg，给药组同时ip NAC 24h后取血及肝脏，进行血清生化、血浆一氧化氮(Nitric oxide ,NO)、肝脏还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)分析及组织学观察。结 果：NAC能改善肝脏功能和组织形态，增加血浆NO和肝脏GSH的含量，与TAA模型组比 较，有显著性差异。结论：NAC可能通过促进NO和GSH的合成而发挥对FHF 的防治作用。
, 百拇医药
Therapeutic effects of N-acetylcysteine on thioacetamide-induced fu lminant hepatic failure in rats
Wang Pei(Wang P)，Wu Ximing(Wu XM)
(Department of Clinical Pharmacology,Hangzhou Sixth Hospital,Hangzhou 310014)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investig ate therapeutic effects of N-acetylcysteine(NAC) on thioacetamide(TAA)-induced f ulminant hepatic failure(FHF) in rats.METHODS:Experimental animals w ere male SD rats.They were divided into six groups.Everyone,except a normal cont rol group,were ip TAA 300mg/kg,at time,ip NAC.Taking blood and liver,carry ont t he tests of serum biochemical,plasma nitric oxide(NO),analysis of reduced glutat hione(GSH) in liver and histological examination carry out the tests of 24h afte r the initiation of tre atment.RESULTS:Compared with the model group,NAC improved liver func tion and histopathologic features,and raised GSH content in liver and NO concent ration in blood.CONCLUSION:It was that deduced the therapeutic effec t of NAC on FHF is accomplished by its facilitating GSH and NO synthesis.
, 百拇医药
KEY WORDS N-acetylcysteine,thioacetamide,fulminant hepatic failure, nitric oxide,glutathione
N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)能 有效防治醋氨酚过量致动物暴发性肝衰竭(Fulminant Hepatic Failure,FHF)，并提高存活 率。关于对其它肝毒剂引起动物FHF的防治作用尚未见文献报道，本文用NAC对硫代乙酰胺致 大鼠FHF模型的影响进行了实验，并对NAC抗肝损害的机理作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 试药
N-乙酰半胱氨酸 99%HPLC 测定，mp108℃(上海生化药厂)；硫代乙酰 胺(Thioacetamide,TAA)99%，mp 112～114℃(上海化学试剂总厂)；促肝细胞生长素(Hepato cyte Growth Promoting Factors,pHGF，广东阳江药厂)；邻苯二甲醛(O-phthaldialdehyde ,OPTA,Sigma)；硫酸奎宁(上海化学试剂总厂)；其余试剂均为分析纯。
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1.2 动物
取SD♂大鼠，体重(200±20)g，随机分成6组，实验前禁食12 h。除正常对照组外，各组动物同时ip 6% TAA 300mg/kg，给药组分别于中毒前1h ip NAC 2 5，50和100mg/kg，阳性对照组ip pHGF 60mg/kg，阴性对照组ip生理盐水，给药组中毒后1h 分别ip NAC 12.5,25和50mg/kg,以后每2h ip同剂量NAC。中毒24h后,颈动脉取血,分别测定A LT,AST,T-Bili及一氧化氮(Nitric oxide,NO)。同时取肝组织两份，一份作病理组织学观察 ，另一份置液氮中贮存待测还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)。
1.3 荧光分析法测定NO和GSH
1.3.1 NO浓度的测定[1] 取血浆20μl,加磷酸盐缓冲液(pH7.4)280μl, 硫酸奎宁溶液(1×10-6mol/l)3ml混合后再加入1mol/l盐酸溶液0.1ml及NAC溶液(1.6 ×10-2mol/L)0.3ml,摇匀后经荧光分光光度计(日立F-4000)于激发波长334nm,发射波 长445nm处测定荧光强度,根据NO的标准曲线计算血浆中NO浓度。
, 百拇医药
1.3.2 还原型GSH含量的测定 称取肝脏100mg 加KCl-Tris缓冲液1ml匀 浆,每0.5ml匀浆液加0.05ml浓过氯酸,用Biofuge 15R离心机离心(3800×g,30min,0℃),取0. 1ml上清液加含EDTA的亚沸蒸馏水至5ml,再加磷酸钠溶液(0.1mol/L,pH 8.0)2.5ml，0.1% OP TA甲醇溶液0.5ml,室温反应15～20min,于激发波长350nm,发射波长420nm处测定荧光强度,按 照GSH的标准曲线计算肝脏中GSH含量。
1.4 统计学方法
实验结果求 均数与标准差，显著性检t检验。
2 结 果
2.1 对TAA引起大鼠ALT,AST及T-Bili升高 的影响
用日立7060全自动生化分析仪测定血清ALT,AST,T-Bili,结果给药组和阳性对照组 均明显低于阴性对照组,其中高剂量给药组的降低幅度分别为3,6.6,3 倍,并呈剂量倚赖(图1 ,2)。
, 百拇医药
图1 NAC对TAA引起大鼠肝衰竭血浆ALT，AST的影响/x±s,n=8
A-正常组；B-对照组；C-pHGF 60mg/kg;D-NAC 25mg/kg;E-NAC 50mg/kg;F-NAC 10 0mg/kg；与对照组比较，***P<0.01
2.2 对FHF大鼠血浆NO的影响
应用NAC治疗TAA诱发的急性肝衰竭大鼠在 24h经荧光法测定血浆NO含量,结果各组血浆NO水平均有不同幅度增高,给药组血浆NO水平随 剂量增加而升高,其中高剂量组与阴性对照组血浆NO浓度(mmol/L))分别为65±6和46±10， 两组间有显著差异(P<0.01),并呈剂量依赖(图3)。
图2 NAC对TAA引起大鼠肝衰竭血浆T-Bili的影响/x±s,n=8
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A-正常组；B-对照组；C-pHGF 60mg/kg;D-NAC 50mg/kg;E-NAC 25mg/kg;F-NA C 100mg/kg；与对照组比较，***P<0.001
图3 NAC对TAA引起大鼠肝衰竭血浆NO含量的影响/x±s,n=8
A-正常组；B-对照组；C-pHGF 60mg/kg;D-NAC 25mg/kg; E-NAC 50mg/kg;F-NAC 100mg/kg；与对照组比较，*P>0.05，**P<0 .05，***P<0.01
2.3 对FHF大鼠肝脏GSH含量的影响
由TAA引起的FHF大鼠肝脏GSH显著低 于正常大鼠,给药组GSH则呈剂量依赖性增高,与阴性对照组比较均有显著性差异(P<0.01), 高剂量组的肝脏GSH含量(μg/g)为367±20,接近于正常组水平400±41(P<0.05),见图4。
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图4 NAC对TAA中毒大鼠肝脏GSH含量的影响/x± s,n=8
A-正常组；B-对照组；C-pHGF 60mg/kg;D-NAC 25mg/kg;E-NAC 50m g/kg;F-NAC 100mg/kg；与对照组比较，*P>0.05，**P<0.05，*** P<0.01
2.4 对肝组织形态的影响
肝病理切片按照细胞溶解性坏死程度分为3级 ∶+，表示肝小叶中有1/4肝细胞溶解性坏死及炎症细胞浸润；++，表示有1/3肝细胞溶解性 坏死及炎症细胞浸润；+++，表示有1/2肝细胞溶解性坏死及炎症细胞浸润。结果由TAA中毒2 4h后大鼠肝损伤主要呈细胞带状坏死及淋巴细胞浸润，给药组均见明显改善，病理改变也随 剂量的增加而减轻，高剂量组病损程度平均为1.5级(表1)。
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表1 腹腔注射NAC对TAA(ip 300)中毒大鼠肝脏组织形态 的影响/n=8 组 别
肝脏病变程度
平均级数
正常组
-
-
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-
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0
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TAA 300mg/kg
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2.6
pHGF 60mg/kg+TAA
++
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2.0*1
NAC 25mg/kg+TAA
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+
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+ +
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2.1*1
NAC 50mg/kg+TAA
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1.8*2
NAC 100mg/kg+TAA
++
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1.5*3
注：与对照组(TAA+生理盐水)组比较， *1P>0.05,*2P<0.05,*3P<0.01；-：正常，+：轻微 ，++：中度，+++：严重，采用ridit分析比较显著性
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3 讨 论
TAA引起大鼠肝脏中毒的机理主要是干扰RNA从胞核到胞浆的转运过程，并使细胞膜内钙聚集 ，影响膜的通透性，通过细胞离子周围变形而导致肝细胞坏死。NAC能使TAA致大鼠肝衰竭的 血液化学明显改善，病理组织改变相应减轻，并呈剂量依赖性地提高肝细胞还原型GSH的含 量及血浆NO浓度。说明NAC可增加体内GSH的贮存，这与文献报道一致[2]。有研究 表明[3,4]，NAC在体内与NO生成亚硝基硫醇(S-nitrosothiol,SNT)，后者作为NO分 子载体能促进收缩的微循环血管扩张，有效增加血液对组织氧输送和释放，纠正缺氧，防止 肝细胞进一步坏死。这一效应进一步为NAC能激活鸟苷酸环化酶，升高血浆cGMP水平所证实 [5]。NO对细胞内Ca2+有调节作用，当细胞内Ca2+过高时，NO可不依 赖cGMP 而降低细胞内的Ca2+，从而避免因Ca2+在细胞内过量而产生损害，提 示NAC 对TAA引起大鼠肝衰竭的防治作用与NO效应有关。总之，NAC可能通过促进GSH的合成 和NO生物活性的体现而发挥对FHF的防治作用，至于这两种作用的相互比重如何，尚待研究 。
, 百拇医药
杭州市自然科学基金资助项目，编号 ：98123B22
参考文献
[1]Gaber G,Allon N.Spectrofluorometric method for NO determination.Anal Biochem,1994,220∶16.
[2]Bruno MK,Cohen SD.Antidotal effectiveness of N-ac etylcysteine in reversing acetaminophen-induced hepatotoxicity.Biochem Pharmacol ,1988,37∶4329.
[3]Myers PR,Minor RLJ,et al.Vasorela xant properties of the endothelium-derived relaxing factor more closely resemble S-nitrosocysteine than nitric oxide.Nature,1990,345∶161.
, http://www.100md.com
[4]Pallmer RMJ,Ferrige AG.Nitric oxide release accou nts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor.Nature,19 87,327∶524.
[5]Harrison P,Wendon J.Evidence of increased guanyla te cyclase activation by acetylcysteine in fulminant hepatic failure.Hepatology, 1996,23(5)∶1067.
[6]Garg VC,Hassid A.Nitric oxide decrease cytosolic free calcium in BALA/C3T3 fibroblast by a cyclic GMP-independent mechanism.J Bio l Chem,1991,266∶9.
收稿日期：1999-01-29, 百拇医药
单位：杭州 310014 杭州市第六人民医院药理室
关键词：
中国现代应用药学000405 摘要 目的：观察N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对硫代 乙酰胺(Thioacetamide,TAA)引起大鼠暴发性肝衰竭(Fulminant Hepatic Failure,FHF)的预 防治疗作用。方法：取SD♂大鼠分6组，除正常对照组外，均ip TAA 300 mg/kg，给药组同时ip NAC 24h后取血及肝脏，进行血清生化、血浆一氧化氮(Nitric oxide ,NO)、肝脏还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)分析及组织学观察。结 果：NAC能改善肝脏功能和组织形态，增加血浆NO和肝脏GSH的含量，与TAA模型组比 较，有显著性差异。结论：NAC可能通过促进NO和GSH的合成而发挥对FHF 的防治作用。
, 百拇医药
Therapeutic effects of N-acetylcysteine on thioacetamide-induced fu lminant hepatic failure in rats
Wang Pei(Wang P)，Wu Ximing(Wu XM)
(Department of Clinical Pharmacology,Hangzhou Sixth Hospital,Hangzhou 310014)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investig ate therapeutic effects of N-acetylcysteine(NAC) on thioacetamide(TAA)-induced f ulminant hepatic failure(FHF) in rats.METHODS:Experimental animals w ere male SD rats.They were divided into six groups.Everyone,except a normal cont rol group,were ip TAA 300mg/kg,at time,ip NAC.Taking blood and liver,carry ont t he tests of serum biochemical,plasma nitric oxide(NO),analysis of reduced glutat hione(GSH) in liver and histological examination carry out the tests of 24h afte r the initiation of tre atment.RESULTS:Compared with the model group,NAC improved liver func tion and histopathologic features,and raised GSH content in liver and NO concent ration in blood.CONCLUSION:It was that deduced the therapeutic effec t of NAC on FHF is accomplished by its facilitating GSH and NO synthesis.
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KEY WORDS N-acetylcysteine,thioacetamide,fulminant hepatic failure, nitric oxide,glutathione
N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)能 有效防治醋氨酚过量致动物暴发性肝衰竭(Fulminant Hepatic Failure,FHF)，并提高存活 率。关于对其它肝毒剂引起动物FHF的防治作用尚未见文献报道，本文用NAC对硫代乙酰胺致 大鼠FHF模型的影响进行了实验，并对NAC抗肝损害的机理作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 试药
N-乙酰半胱氨酸 99%HPLC 测定，mp108℃(上海生化药厂)；硫代乙酰 胺(Thioacetamide,TAA)99%，mp 112～114℃(上海化学试剂总厂)；促肝细胞生长素(Hepato cyte Growth Promoting Factors,pHGF，广东阳江药厂)；邻苯二甲醛(O-phthaldialdehyde ,OPTA,Sigma)；硫酸奎宁(上海化学试剂总厂)；其余试剂均为分析纯。
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1.2 动物
取SD♂大鼠，体重(200±20)g，随机分成6组，实验前禁食12 h。除正常对照组外，各组动物同时ip 6% TAA 300mg/kg，给药组分别于中毒前1h ip NAC 2 5，50和100mg/kg，阳性对照组ip pHGF 60mg/kg，阴性对照组ip生理盐水，给药组中毒后1h 分别ip NAC 12.5,25和50mg/kg,以后每2h ip同剂量NAC。中毒24h后,颈动脉取血,分别测定A LT,AST,T-Bili及一氧化氮(Nitric oxide,NO)。同时取肝组织两份，一份作病理组织学观察 ，另一份置液氮中贮存待测还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)。
1.3 荧光分析法测定NO和GSH
1.3.1 NO浓度的测定[1] 取血浆20μl,加磷酸盐缓冲液(pH7.4)280μl, 硫酸奎宁溶液(1×10-6mol/l)3ml混合后再加入1mol/l盐酸溶液0.1ml及NAC溶液(1.6 ×10-2mol/L)0.3ml,摇匀后经荧光分光光度计(日立F-4000)于激发波长334nm,发射波 长445nm处测定荧光强度,根据NO的标准曲线计算血浆中NO浓度。
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1.3.2 还原型GSH含量的测定 称取肝脏100mg 加KCl-Tris缓冲液1ml匀 浆,每0.5ml匀浆液加0.05ml浓过氯酸,用Biofuge 15R离心机离心(3800×g,30min,0℃),取0. 1ml上清液加含EDTA的亚沸蒸馏水至5ml,再加磷酸钠溶液(0.1mol/L,pH 8.0)2.5ml，0.1% OP TA甲醇溶液0.5ml,室温反应15～20min,于激发波长350nm,发射波长420nm处测定荧光强度,按 照GSH的标准曲线计算肝脏中GSH含量。
1.4 统计学方法
实验结果求 均数与标准差，显著性检t检验。
2 结 果
2.1 对TAA引起大鼠ALT,AST及T-Bili升高 的影响
用日立7060全自动生化分析仪测定血清ALT,AST,T-Bili,结果给药组和阳性对照组 均明显低于阴性对照组,其中高剂量给药组的降低幅度分别为3,6.6,3 倍,并呈剂量倚赖(图1 ,2)。
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图1 NAC对TAA引起大鼠肝衰竭血浆ALT，AST的影响/x±s,n=8
A-正常组；B-对照组；C-pHGF 60mg/kg;D-NAC 25mg/kg;E-NAC 50mg/kg;F-NAC 10 0mg/kg；与对照组比较，***P<0.01
2.2 对FHF大鼠血浆NO的影响
应用NAC治疗TAA诱发的急性肝衰竭大鼠在 24h经荧光法测定血浆NO含量,结果各组血浆NO水平均有不同幅度增高,给药组血浆NO水平随 剂量增加而升高,其中高剂量组与阴性对照组血浆NO浓度(mmol/L))分别为65±6和46±10， 两组间有显著差异(P<0.01),并呈剂量依赖(图3)。
图2 NAC对TAA引起大鼠肝衰竭血浆T-Bili的影响/x±s,n=8
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A-正常组；B-对照组；C-pHGF 60mg/kg;D-NAC 50mg/kg;E-NAC 25mg/kg;F-NA C 100mg/kg；与对照组比较，***P<0.001
图3 NAC对TAA引起大鼠肝衰竭血浆NO含量的影响/x±s,n=8
A-正常组；B-对照组；C-pHGF 60mg/kg;D-NAC 25mg/kg; E-NAC 50mg/kg;F-NAC 100mg/kg；与对照组比较，*P>0.05，**P<0 .05，***P<0.01
2.3 对FHF大鼠肝脏GSH含量的影响
由TAA引起的FHF大鼠肝脏GSH显著低 于正常大鼠,给药组GSH则呈剂量依赖性增高,与阴性对照组比较均有显著性差异(P<0.01), 高剂量组的肝脏GSH含量(μg/g)为367±20,接近于正常组水平400±41(P<0.05),见图4。
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图4 NAC对TAA中毒大鼠肝脏GSH含量的影响/x± s,n=8
A-正常组；B-对照组；C-pHGF 60mg/kg;D-NAC 25mg/kg;E-NAC 50m g/kg;F-NAC 100mg/kg；与对照组比较，*P>0.05，**P<0.05，*** P<0.01
2.4 对肝组织形态的影响
肝病理切片按照细胞溶解性坏死程度分为3级 ∶+，表示肝小叶中有1/4肝细胞溶解性坏死及炎症细胞浸润；++，表示有1/3肝细胞溶解性 坏死及炎症细胞浸润；+++，表示有1/2肝细胞溶解性坏死及炎症细胞浸润。结果由TAA中毒2 4h后大鼠肝损伤主要呈细胞带状坏死及淋巴细胞浸润，给药组均见明显改善，病理改变也随 剂量的增加而减轻，高剂量组病损程度平均为1.5级(表1)。
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表1 腹腔注射NAC对TAA(ip 300)中毒大鼠肝脏组织形态 的影响/n=8 组 别
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注：与对照组(TAA+生理盐水)组比较， *1P>0.05,*2P<0.05,*3P<0.01；-：正常，+：轻微 ，++：中度，+++：严重，采用ridit分析比较显著性
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TAA引起大鼠肝脏中毒的机理主要是干扰RNA从胞核到胞浆的转运过程，并使细胞膜内钙聚集 ，影响膜的通透性，通过细胞离子周围变形而导致肝细胞坏死。NAC能使TAA致大鼠肝衰竭的 血液化学明显改善，病理组织改变相应减轻，并呈剂量依赖性地提高肝细胞还原型GSH的含 量及血浆NO浓度。说明NAC可增加体内GSH的贮存，这与文献报道一致[2]。有研究 表明[3,4]，NAC在体内与NO生成亚硝基硫醇(S-nitrosothiol,SNT)，后者作为NO分 子载体能促进收缩的微循环血管扩张，有效增加血液对组织氧输送和释放，纠正缺氧，防止 肝细胞进一步坏死。这一效应进一步为NAC能激活鸟苷酸环化酶，升高血浆cGMP水平所证实 [5]。NO对细胞内Ca2+有调节作用，当细胞内Ca2+过高时，NO可不依 赖cGMP 而降低细胞内的Ca2+，从而避免因Ca2+在细胞内过量而产生损害，提 示NAC 对TAA引起大鼠肝衰竭的防治作用与NO效应有关。总之，NAC可能通过促进GSH的合成 和NO生物活性的体现而发挥对FHF的防治作用，至于这两种作用的相互比重如何，尚待研究 。
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参考文献
[1]Gaber G,Allon N.Spectrofluorometric method for NO determination.Anal Biochem,1994,220∶16.
[2]Bruno MK,Cohen SD.Antidotal effectiveness of N-ac etylcysteine in reversing acetaminophen-induced hepatotoxicity.Biochem Pharmacol ,1988,37∶4329.
[3]Myers PR,Minor RLJ,et al.Vasorela xant properties of the endothelium-derived relaxing factor more closely resemble S-nitrosocysteine than nitric oxide.Nature,1990,345∶161.
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[4]Pallmer RMJ,Ferrige AG.Nitric oxide release accou nts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor.Nature,19 87,327∶524.
[5]Harrison P,Wendon J.Evidence of increased guanyla te cyclase activation by acetylcysteine in fulminant hepatic failure.Hepatology, 1996,23(5)∶1067.
[6]Garg VC,Hassid A.Nitric oxide decrease cytosolic free calcium in BALA/C3T3 fibroblast by a cyclic GMP-independent mechanism.J Bio l Chem,1991,266∶9.
收稿日期：1999-01-29, 百拇医药