慢传输型便秘结肠肌间丛NOS、SOM、5-HT免疫反应性变化
童卫东 张胜本 张连阳 黄显凯
摘 要 目的：探讨一氧化氮(NO)、生长抑素(SOM)及5-羟色胺(5-HT)在慢传输型便秘(STC)发病中的作用。方法：用免疫组织化学法结合计算机辅助的图像分析技术检测15例STC患者乙状结肠肌间丛一氧化氮合酶(NOS)、SOM及5-HT的免疫反应性变化。结果：与对照组相比，STC患者乙状结肠肌间丛NOS、5-HT免疫反应性增强(P<0.01,P<0.05)，而SOM无显著差别(P>0.05)。结论 NOS及5-HT免疫反应性增强是STC患者结肠传输减慢的神经病理基础，SOM在STC结肠动力减弱中的作用不明显。
关键词:便秘 肌间神经丛 一氧化氮 生长抑素 5-羟色胺
慢传输型便秘(STC)是一类以结肠动力减弱为主要特点的顽固性便秘，病因不清，主要表现为大便次数减少，无便意，排便困难。近年的研究表明肠神经系统(enteric nervous system, ENS)递质紊乱在STC的发病中起重要作用[1]。我们收集了15例外科手术治疗的STC患者乙状结肠标本，用免疫组织化学法结合计算机辅助的图像分析技术研究其肌间神经丛一氧化氮合酶(NOS)、生长抑素(SOM)及5-羟色胺(5-HT)的免疫反应性变化，探讨STC结肠动力减弱的神经病理机制。
, http://www.100md.com
材料和方法
一. 临床资料 1. STC组 收集我院1991～1996年间外科手术治疗的15例STC患者乙状结肠标本，男2例，女13例，年龄26～68岁，平均44.5岁。病程1～30年，平均7.9年。主要症状为排便困难、便意消失、大便次数减少及腹胀等，均有长期服用泻剂的病史，而且剂量越用越大，包括大黄、番泻叶及果导片等，大便次数在服泻剂的情况下保持在1次/3～10日，其中8例不服泻剂则不排便。口服不透X线标志物结肠传输实验：80%标志物排出时间在3～11日之间，平均6.5日，其中14例为结肠传输减慢，1例主要为乙状结肠传输缓慢。钡灌肠显示5例乙状结肠冗长。排粪造影：9例伴直肠内脱垂，4例伴直肠前突，3例伴盆底痉挛综合征，1例伴会阴下降综合征。14例行结肠全或次全切除，1例行乙状结肠切除术。随访5年疗效满意，12例1周后大便即1～3次/日，3例大便5～10次/日，用易蒙停可控制，2～4周后停药，大便保持1～3次/日。1例5年后出现排便困难，复查有胃排空减慢，予对症治疗。
, 百拇医药
2. 对照组 参照Cortesini[2]方法，选择同期手术的非梗阻性直肠癌患者11例作为对照组，均为Dukes A期，男7例，女4例，年龄47～78岁，平均65岁。无便秘症状及泻剂服用史，无精神及神经异常表现。结肠传输实验均在3天以内。手术时取远离癌灶的乙状结肠作为对照组标本。
二. 免疫组化研究 1. 主要试剂 兔抗NOS多抗、兔抗SOM多抗、兔抗5-HT多抗、过氧化酶标记的链酶卵白素(streptavidin-peroxidase, SPtm)试剂盒均为美国Zymed公司产品。
2. 免疫组织化学染色 石蜡切片厚6 μm，常规脱蜡，0.1%胰酶孵育20分钟(37℃)，PBS漂洗；3%H2O2-甲醇孵育20分钟(室温)以消除内源性过氧化酶，蒸馏水冲洗，PBS漂洗5分钟；5%正常山羊血清孵育30分钟(37℃)；倾去血清，加一抗(工作浓度均为1∶100，PBS稀释)孵育30分钟(37℃)，转4℃过夜；PBS漂洗5分钟×3，滴加羊抗兔IgG(1∶100)孵育40分钟(37℃)；PBS漂洗5分钟×3，加过氧化酶标记的链酶卵白素(1∶100)孵育40分钟(37℃)；PBS漂洗5分钟×3，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。对照实验中不加一抗。
, 百拇医药
3. 染色结果判定 (1)图像分析：每组选5例染色良好的切片，在显微镜物镜放大20倍下观察，以肌间丛为中心每张切片随机选取5个视野，共25个视野摄入计算机(分辩率为512×476)，测量每个视野阳性染色区域的表面积密度，即面密度：单位观察空间内所含某相的表面积。最后计算每组的平均值。(2)半定量分析：所有视野未见阳性细胞为(-)；有少数弱阳性神经元为(+)，染色呈淡黄；阳性细胞较多见为(++)，染色呈棕黄；阳性细胞多见为(+++)，棕褐色。
结 果
一. NOS免疫组化 对照组中，(++)2例，(+)6例，(-)3例；STC组中，(+++)9例，(++)4例，(+)2例。STC患者肌间丛NOS免疫反应性明显增强(P<0.01)。(照片1，2)
图1 对照组乙状结肠肌间丛NOS免疫
, 百拇医药 组化染色呈弱阳性 ×400
图2 STC患者乙状结肠肌间丛NOS免疫
反应强阳性 ×400
二. SOM免疫组化 对照组(+++)3例，(++)2例，(+)3例，(-)3例；STC组(+++)4例，(++)2例，(+)5例，(-)4例。两组间无显著差别(P>0.05)。
三. 5-HT免疫组化 对照组(+++)1例，(++)1例，(+)5例，(-)4例；STC组()7例，()4例，(+)2例，(-)2例。STC患者5-HT免疫反应性明显增强(P<0.05)。(照片3)。
图3 STC患者乙状结肠肌间丛5-HT
免疫反应强阳性 ×400
, http://www.100md.com
四. 计算机辅助图像分析 对NOS、SOM和5-HT免疫组化图像分析的结果与半定量分析一致，见表1。
表1 乙状结肠肌间丛NOS、SOM和5-HT免疫组化图像分析(面密度值) x±s
组 别
例数
NOS
SOM
5-HT
对照组
11
5.588±1.512
4.922±0.747
, 百拇医药
5.460±1.722
STC组
15
7.464±1.224**
5.249±1.445
7.051±1.398*
与对照组相比，*P<0.05 * *P<0.01 讨 论 近年的研究表明STC结肠存在肌间丛嗜银性神经元数目减少、神经细丝免疫反应性减弱以及S-100蛋白免疫反应性增强等异常改变[3]。我们以前的研究显示STC乙状结肠肌间丛血管活性肠肽和P物质含量均降低[1]，在本研究中进一步观察了NOS、SOM、5-HT三种ENS递质的变化。
, http://www.100md.com
近年的研究已充分证明NO是ENS中主要的抑制性神经递质之一，在消化道动力调控中发挥重要作用[4]。本研究表明STC乙状结肠肌间丛NOS免疫反应性较对照组明显增强。作为一种抑制性递质，NO合成或释放增多，可使平滑肌产生过度松弛反应，导致结肠推进性收缩受抑制，可能是结肠传输减慢的原因之一。Gaginella[5]报道便塞停和酚酞的致泻作用依赖于NO的释放，我们以前的研究也显示长期饲以大黄或酚酞后，大鼠结肠NO含量升高[6]，故可推测，STC结肠壁NO含量升高与患者长期服用接触性泻剂有关。NO被认为具有神经保护和神经毒性的双重作用，STC结肠壁内NO的过量产生是否会损伤肠壁内神经元，有必要作深入的探讨。
SOM能神经元对肠道运动有抑制作用。Tzavella[7]对STC病人直肠活检组织放免测定未发现SOM含量异常变化，我们的免疫组化结果显示4例肌间丛SOM免疫反应性有增强的表现，但总体上与对照组无显著差别，与文献报道相似。提示SOM变化不是STC发病的主要因素。
, 百拇医药
本研究结果表明STC肌间丛5-HT免疫反应性增强，但5-HT对肠动力的调节作用更主要地取决于其受体的不同类型。已知5-HT1A是抑制性受体，而5-HT1P、5-HT3、5-HT4是兴奋性受体，作用于不同的受体其生理效应可能会截然相反，有报道5-HT3受体拮抗剂可引起便秘[8]。因此，5-HT在STC发病中的作用有待从受体水平深入研究。
影响STC发生发展的因素很多，包括长期服用接触性泻剂、内分泌紊乱等多种因素。我们认为STC患者肌间丛NOS、5-HT免疫反应性的异常变化是其结肠传输减慢的神经病理基础之一，但这种变化是服用泻剂等继发引起，还是STC的原发改变?有待进一步的动物实验或对STC患者进行前瞻性研究。
重庆市中青年科技专家基金资助项目(960134)
, http://www.100md.com 作者单位：400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所普外科
参考文献
1 高峰，张胜本，张连阳，等.慢传输型便秘乙状结肠VIP、SP免疫组化研究.中华消化杂志 1998；18：34-36.
2 Cortesini C, Cianchi F, Infantino A, et al. Nitric oxide synthase and VIP distribution in enteric nervous system in idiopathic chronic constipation. Dig Dis Sci 1995;40:2450-2455.
3 Park HJ, Kamm MA, Abbasi AM, et al. Immunohistochemical study of the colonic muscle and innervation in idiopathic chronic constipation. Dis Colon Rectum 1995;38:509-513.
, 百拇医药
4 Furness JB, Li ZS, Young HM, et al. Nitric oxide synthase in the enteric nervous system of the guinea-pig: a quantitative description. Cell Tissue Res 1994;277:139-149.
5 Gaginella TS, Mascolo N, Lzze AA, et al. Nitric oxide as a mediator of bisacodyl and phenolphthalcin laxative action: induction of nitric oxide synthase. J Pharmacol Exp Ther 1994;270:1239-1245.
6 童卫东，张胜本，张连阳，等.大黄致大鼠结肠壁内一氧化氮异常及其意义.中药药理与临床 1997；13：29-31.
, http://www.100md.com
7 Tzavella K, Riepl RL, Klauser AG, et al. Decreased substance P levels in rectal biopsies from patients with slow transit constipation (Abstr). Eur J Gastroenterol Hepatol 1996;8:1207-1211.
8 Sanger GJ, Wardle KA. Constipation evoked by 5-HT receptor antagonism: Evidence for heterogeneous efficacy among different antagonists in guinea-pigs. J Pharm Pharmacol 1994;46:666-670., 百拇医药
摘 要 目的：探讨一氧化氮(NO)、生长抑素(SOM)及5-羟色胺(5-HT)在慢传输型便秘(STC)发病中的作用。方法：用免疫组织化学法结合计算机辅助的图像分析技术检测15例STC患者乙状结肠肌间丛一氧化氮合酶(NOS)、SOM及5-HT的免疫反应性变化。结果：与对照组相比，STC患者乙状结肠肌间丛NOS、5-HT免疫反应性增强(P<0.01,P<0.05)，而SOM无显著差别(P>0.05)。结论 NOS及5-HT免疫反应性增强是STC患者结肠传输减慢的神经病理基础，SOM在STC结肠动力减弱中的作用不明显。
关键词:便秘 肌间神经丛 一氧化氮 生长抑素 5-羟色胺
慢传输型便秘(STC)是一类以结肠动力减弱为主要特点的顽固性便秘，病因不清，主要表现为大便次数减少，无便意，排便困难。近年的研究表明肠神经系统(enteric nervous system, ENS)递质紊乱在STC的发病中起重要作用[1]。我们收集了15例外科手术治疗的STC患者乙状结肠标本，用免疫组织化学法结合计算机辅助的图像分析技术研究其肌间神经丛一氧化氮合酶(NOS)、生长抑素(SOM)及5-羟色胺(5-HT)的免疫反应性变化，探讨STC结肠动力减弱的神经病理机制。
, http://www.100md.com
材料和方法
一. 临床资料 1. STC组 收集我院1991～1996年间外科手术治疗的15例STC患者乙状结肠标本，男2例，女13例，年龄26～68岁，平均44.5岁。病程1～30年，平均7.9年。主要症状为排便困难、便意消失、大便次数减少及腹胀等，均有长期服用泻剂的病史，而且剂量越用越大，包括大黄、番泻叶及果导片等，大便次数在服泻剂的情况下保持在1次/3～10日，其中8例不服泻剂则不排便。口服不透X线标志物结肠传输实验：80%标志物排出时间在3～11日之间，平均6.5日，其中14例为结肠传输减慢，1例主要为乙状结肠传输缓慢。钡灌肠显示5例乙状结肠冗长。排粪造影：9例伴直肠内脱垂，4例伴直肠前突，3例伴盆底痉挛综合征，1例伴会阴下降综合征。14例行结肠全或次全切除，1例行乙状结肠切除术。随访5年疗效满意，12例1周后大便即1～3次/日，3例大便5～10次/日，用易蒙停可控制，2～4周后停药，大便保持1～3次/日。1例5年后出现排便困难，复查有胃排空减慢，予对症治疗。
, 百拇医药
2. 对照组 参照Cortesini[2]方法，选择同期手术的非梗阻性直肠癌患者11例作为对照组，均为Dukes A期，男7例，女4例，年龄47～78岁，平均65岁。无便秘症状及泻剂服用史，无精神及神经异常表现。结肠传输实验均在3天以内。手术时取远离癌灶的乙状结肠作为对照组标本。
二. 免疫组化研究 1. 主要试剂 兔抗NOS多抗、兔抗SOM多抗、兔抗5-HT多抗、过氧化酶标记的链酶卵白素(streptavidin-peroxidase, SPtm)试剂盒均为美国Zymed公司产品。
2. 免疫组织化学染色 石蜡切片厚6 μm，常规脱蜡，0.1%胰酶孵育20分钟(37℃)，PBS漂洗；3%H2O2-甲醇孵育20分钟(室温)以消除内源性过氧化酶，蒸馏水冲洗，PBS漂洗5分钟；5%正常山羊血清孵育30分钟(37℃)；倾去血清，加一抗(工作浓度均为1∶100，PBS稀释)孵育30分钟(37℃)，转4℃过夜；PBS漂洗5分钟×3，滴加羊抗兔IgG(1∶100)孵育40分钟(37℃)；PBS漂洗5分钟×3，加过氧化酶标记的链酶卵白素(1∶100)孵育40分钟(37℃)；PBS漂洗5分钟×3，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。对照实验中不加一抗。
, 百拇医药
3. 染色结果判定 (1)图像分析：每组选5例染色良好的切片，在显微镜物镜放大20倍下观察，以肌间丛为中心每张切片随机选取5个视野，共25个视野摄入计算机(分辩率为512×476)，测量每个视野阳性染色区域的表面积密度，即面密度：单位观察空间内所含某相的表面积。最后计算每组的平均值。(2)半定量分析：所有视野未见阳性细胞为(-)；有少数弱阳性神经元为(+)，染色呈淡黄；阳性细胞较多见为(++)，染色呈棕黄；阳性细胞多见为(+++)，棕褐色。
结 果
一. NOS免疫组化 对照组中，(++)2例，(+)6例，(-)3例；STC组中，(+++)9例，(++)4例，(+)2例。STC患者肌间丛NOS免疫反应性明显增强(P<0.01)。(照片1，2)
图1 对照组乙状结肠肌间丛NOS免疫
, 百拇医药 组化染色呈弱阳性 ×400
图2 STC患者乙状结肠肌间丛NOS免疫
反应强阳性 ×400
二. SOM免疫组化 对照组(+++)3例，(++)2例，(+)3例，(-)3例；STC组(+++)4例，(++)2例，(+)5例，(-)4例。两组间无显著差别(P>0.05)。
三. 5-HT免疫组化 对照组(+++)1例，(++)1例，(+)5例，(-)4例；STC组()7例，()4例，(+)2例，(-)2例。STC患者5-HT免疫反应性明显增强(P<0.05)。(照片3)。
图3 STC患者乙状结肠肌间丛5-HT
免疫反应强阳性 ×400
, http://www.100md.com
四. 计算机辅助图像分析 对NOS、SOM和5-HT免疫组化图像分析的结果与半定量分析一致，见表1。
表1 乙状结肠肌间丛NOS、SOM和5-HT免疫组化图像分析(面密度值) x±s
组 别
例数
NOS
SOM
5-HT
对照组
11
5.588±1.512
4.922±0.747
, 百拇医药
5.460±1.722
STC组
15
7.464±1.224**
5.249±1.445
7.051±1.398*
与对照组相比，*P<0.05 * *P<0.01 讨 论 近年的研究表明STC结肠存在肌间丛嗜银性神经元数目减少、神经细丝免疫反应性减弱以及S-100蛋白免疫反应性增强等异常改变[3]。我们以前的研究显示STC乙状结肠肌间丛血管活性肠肽和P物质含量均降低[1]，在本研究中进一步观察了NOS、SOM、5-HT三种ENS递质的变化。
, http://www.100md.com
近年的研究已充分证明NO是ENS中主要的抑制性神经递质之一，在消化道动力调控中发挥重要作用[4]。本研究表明STC乙状结肠肌间丛NOS免疫反应性较对照组明显增强。作为一种抑制性递质，NO合成或释放增多，可使平滑肌产生过度松弛反应，导致结肠推进性收缩受抑制，可能是结肠传输减慢的原因之一。Gaginella[5]报道便塞停和酚酞的致泻作用依赖于NO的释放，我们以前的研究也显示长期饲以大黄或酚酞后，大鼠结肠NO含量升高[6]，故可推测，STC结肠壁NO含量升高与患者长期服用接触性泻剂有关。NO被认为具有神经保护和神经毒性的双重作用，STC结肠壁内NO的过量产生是否会损伤肠壁内神经元，有必要作深入的探讨。
SOM能神经元对肠道运动有抑制作用。Tzavella[7]对STC病人直肠活检组织放免测定未发现SOM含量异常变化，我们的免疫组化结果显示4例肌间丛SOM免疫反应性有增强的表现，但总体上与对照组无显著差别，与文献报道相似。提示SOM变化不是STC发病的主要因素。
, 百拇医药
本研究结果表明STC肌间丛5-HT免疫反应性增强，但5-HT对肠动力的调节作用更主要地取决于其受体的不同类型。已知5-HT1A是抑制性受体，而5-HT1P、5-HT3、5-HT4是兴奋性受体，作用于不同的受体其生理效应可能会截然相反，有报道5-HT3受体拮抗剂可引起便秘[8]。因此，5-HT在STC发病中的作用有待从受体水平深入研究。
影响STC发生发展的因素很多，包括长期服用接触性泻剂、内分泌紊乱等多种因素。我们认为STC患者肌间丛NOS、5-HT免疫反应性的异常变化是其结肠传输减慢的神经病理基础之一，但这种变化是服用泻剂等继发引起，还是STC的原发改变?有待进一步的动物实验或对STC患者进行前瞻性研究。
重庆市中青年科技专家基金资助项目(960134)
, http://www.100md.com 作者单位：400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所普外科
参考文献
1 高峰，张胜本，张连阳，等.慢传输型便秘乙状结肠VIP、SP免疫组化研究.中华消化杂志 1998；18：34-36.
2 Cortesini C, Cianchi F, Infantino A, et al. Nitric oxide synthase and VIP distribution in enteric nervous system in idiopathic chronic constipation. Dig Dis Sci 1995;40:2450-2455.
3 Park HJ, Kamm MA, Abbasi AM, et al. Immunohistochemical study of the colonic muscle and innervation in idiopathic chronic constipation. Dis Colon Rectum 1995;38:509-513.
, 百拇医药
4 Furness JB, Li ZS, Young HM, et al. Nitric oxide synthase in the enteric nervous system of the guinea-pig: a quantitative description. Cell Tissue Res 1994;277:139-149.
5 Gaginella TS, Mascolo N, Lzze AA, et al. Nitric oxide as a mediator of bisacodyl and phenolphthalcin laxative action: induction of nitric oxide synthase. J Pharmacol Exp Ther 1994;270:1239-1245.
6 童卫东，张胜本，张连阳，等.大黄致大鼠结肠壁内一氧化氮异常及其意义.中药药理与临床 1997；13：29-31.
, http://www.100md.com
7 Tzavella K, Riepl RL, Klauser AG, et al. Decreased substance P levels in rectal biopsies from patients with slow transit constipation (Abstr). Eur J Gastroenterol Hepatol 1996;8:1207-1211.
8 Sanger GJ, Wardle KA. Constipation evoked by 5-HT receptor antagonism: Evidence for heterogeneous efficacy among different antagonists in guinea-pigs. J Pharm Pharmacol 1994;46:666-670., 百拇医药