促卵泡刺激素受体mRNA的稳定性研究
作者：朱长虹 熊忠明 肖惠珠
单位：同济医科大学计划生育研究所，武汉 430030
关键词：促卵泡刺激素受体；竞争性PCR；半衰期
同济医科大学学报000410 摘要 采用核酸酶保护测定(NPA)和定量反转录竞争 性多聚酶链反应方法(RT-PCR)，测定了表达重组促卵泡刺激素受体(FSHR)的转染细胞 (Y1)的FSHR mRNA的稳定性和半衰期。对照组FSHR mRNA量在8 h内保持恒定水平[NPA, (2 .9±0.3) pg/μg RNA; RT-PCR, (2.7±0.3) pg/μg RNA]。用[3H]尿苷结 合到RNA的方法，观察到Actinomycin D (ActD, 5 μg/ml) 在1 h内可抑制mRNA合成达90%。 在ActD存在的条件下，FSHR mRNA量在1 h后出现一个时间依赖性的显著下降，用NPA测得的 半衰期为(3.6±0.2) h，RT-PCR为(3.1±0.1) h。提示mRNA的降解速率在FSH R基因稳定表达维持上起着非常重要的作用。
, 百拇医药
中图法分类号 Q51， R817.9
Stability of Human and Porcine Follicl e-Stimulating Hormone Receptor
mRNA in Stably Transfected Cells
Zhu Changhong Xiong Zhongming Xiao Huizhu
(Family Planning Research Institute, Tongji Medical Uni versity, Wuhan 430030)
Abstract To assess the effects of mRNA degradation on steady state levels of follicle-st imulating hormone receptor (FSHR mRNA) and on the regulation of FSHR gene expres sion, the stability and half-life of FSHR mRNA were detected in transfected cel ls expressing recombinant FSHR. Time-dependent changes in FSHR mRNA content we re determined by nuclease protection-solution hybridization assay (NPA) or by quatitative reverse transcription-competitive polymerase chain reaction (RT-PC R) in the cultured hFSHR-Y1 cells. FSHR mRNA content remained constant during 8 h control incubation (NPA, 2.9±0.3 pg/μg RNA; RT-PCR, 2.7±0.3 pg/μg R NA). Actinomycin D (ActD, 5 μg/ml) inhibited mRNA synthesis, as assessed by in corporation of 〔3H〕uridine into total RNA, by 90 % within 1 h in the hFSHR- Y1 cells. No effect of ActD on cellular morphology or viability was observed. ActD caused a time-dependent decrease in FSHR mRNA content with a lag time of 1 h. The half-life of hFSHR mRNA was 3.6±0.2 h by NPA and 3.1±0.1 h by RT -PCR. The results indicated that degradation of mRNA was an important process i n maintenance of steady state expression of the FSHR gene in the cells stably ex pres sing recombinant receptor.
, 百拇医药
Key words
所有的有机体包括原核和真核生物的基因表达至少部分是由mRNA合成和降解速率所决定的 [1]。在哺育动物细胞，某一特异mRNA的丰度由于半衰期的变化可能波动数倍，而转 录水平没有任何改变[2]。换句话说，调节mRNA半衰期过程会影响到细胞如何生长 、分化、以及对环境的反应能力。mRNA含量的变化可以通过改变合成和转换速率而改变。精 确定量某一特定mRNA的半衰期对正确评价其在蛋白表达中的作用是非常重要的。
在本研究中，我们用NPA和RT-PCR方法，定量测定了表达重组人FSHR的转染细胞的预先 存在的FSHR mRNA量的时间依赖性改变。为了测定mRNA的半衰期，转录抑制剂Actinomycin D (ActD) 被用来阻断新mRNA的合成。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 主要试剂
细胞培养基和试剂、限制酶、Taq DNA多聚酶、超级转录酶Ⅱ、脱氧核糖核苷酸等购于G IBCO (Grand Island, NY)。ActD和hepes购于Sigma (St. Louis, MO). RNease RNA 提 取试剂盒从Qiagen (Valencia, CA)获得。[α-32P]UTP, [α-32P]dC TP 和 [5,6-3H]尿苷为Dupont New England Nuclear (Boston, MA)产品。Klenow DNA 聚合酶, T7 RNA聚合酶, RNase-free DNase I, DTT, E. Coli tRNA和RNA酶抑制剂从Boehr inger-Mannheim (Indianapolis, IN)购得。 Acrylamide, bisacrylamide, TEMED和ammon ium persulfate从Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA)获得。 Whatman GF/C 玻璃纤维 膜从Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)获得。NPA试剂从Ambion (Austin, TX)获得。RT -PCR引物和竞争性模板由University of Cincinnati College of Medicine提供。全长人F SHR cDNA由Dr. Jörg Gromoll (University of Münster)赠送。
, http://www.100md.com
1.2 细胞培养
表达重组人FSHR的Y1细胞培养于Ham's F-10基质中，同时添加15%马血清，2.5 %胎牛血清 ，1%谷氨酰胺，10 mmol/L Hepes和80 μg/ml geneticin。细胞种植于6 cm培养盘中，数量 为5×106/盘，培养液的量为3 ml，培养条件为37 ℃，95% O2，5% CO2。24 h后，加 或者不加ActD (5 μg/ml)。继续培养不同时间，然后收获细胞并提取RNA，同时检查细胞 形态和活率用以观察ActD对细胞的毒性作用。
1.3 RNA提取
细胞用冰冷的0.14 mol/L NaCl，0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液(pH 7.3)洗涤3次，根据公 司 产品说明书，用Qiagen RNease RNA试剂盒提取RNA，RNA浓度用分光光度计在波长为260 nm 处测定。
, 百拇医药
1.4 [3H]-尿苷与总RNA结合实验
4×106细胞培养于6 cm培养盘中，在3 ml培养液中，37 ℃连续培养24 h。然后加或 者不加ActD (5 μg/ml)，在存在10 Ci/ml [5,6-3H] 尿苷的条件下，再继续培养0 、1、2、 4、6、8 或者24 h。丢弃培养液，用冰冷的磷酸缓冲液洗涤细胞5次。总RNA用Qiagen RNeas e RNA试剂盒提取。RNA用DEPC水溶解并同时加入三氯醋酸(TCA，终浓度为6%)。TCA沉淀物 收集到Whatman 玻璃滤膜上。滤膜用含0.1% 尿苷的6%的TCA洗涤2次。最后用液体闪烁仪测 定放射活性。
1.5 核酸酶保护测定(NPA)
用人工合成的FSHR mRNA作为标准品进行NPA。合成方法如下：用BssH II消化的FSHR cD NA作为模板，1 ng的线性化cDNA(20 μl)加转录缓冲液，10 mmol/L DTT，0.5 mmol/L N TP s，100 mU RNA酶抑制剂和10 U T7 RNA聚合酶，37℃合成2 h。反应混合物用DNA酶消化，mR NA用100 mmol/L LiCl沉淀，乙醇洗涤，溶解于DEPC水中，在260nm波长处分光光度计定量。
, http://www.100md.com
cDNA探针合成，NPA测定方法，以及mRNA统计计算方法参考公司产品说明书(Ambion) 。
1.6 RT竞争性PCR
参考文献[3]报道的方法设计合成竞争性模板。该竞争性模板和要放大的目标D NA具有相同的序列，只是在模板的中间插入了20个碱基对，由于长度上的差异，因此电泳之 后竞争性模板和目标DNA非常容易区分开来。
用反义外引物转录出FSHR cDNA，固定量的反转录产物加不同量的竞争性模板用外引物 同时进行放大，放大产物用8%的聚丙酰胺电泳分离，分离后的条带数码照相。竞争性模板和 目标的条带的密度用图象分析程序进行量化处理，当两者之间的比值为1时，竞争性模板的 量将等于mRNA的量。由于竞争性模板长于目标cDNA，大约1.062的调节系数将用于调节FSHR mRNA的量。
1.7 数据分析
, http://www.100md.com
半衰期用线性回归方法进行计算，所有的实验均至少重复3次。
2 结果
2.1 转染细胞总RNA合成
用hFSHR-Y1细胞与[5,6-3H]尿苷培养确定RNA合成的时间过程。标记的尿苷结合到总 RNA用三氯醋酸沉淀进行测定。培养前8 h，总RNA合成比较迅速，随之缓慢降低(图1)。大 约占总加入放射量的0.27%被结合到hFSHR-Y1细胞。为了评价ActD 阻断新RNA合成的效率 ，培养液中加5 μg/ml ActD，然后与[5,6-3H]尿苷培养不同时间。ActD在1 h内 可抑制90% RNA合成，2 h为95%。结果提示ActD是一个较好的RNA合成抑制剂。
图1 ActD对尿苷与RNA结合的影响
, 百拇医药
2.2 ActD对总RNA含量的作用
为了确定暴露于ActD 是否改变总RNA的含量，于不同时间点提取RNA(每个样品细胞含量为4 ×106)，然后用分光光度计定量测定RNA量。比较对照组和ActD 组的结果揭示在整个培养 期间，总RNA保持相对恒定，8 h内没有观察到ActD 对总RNA含量的可测得性改变(表1)。
表1 ActD对总RNA合成的影响 (
±s，n=6) 培养时间(h)
RNA产量 (μg/盘)
对照组
ActD组
0
, http://www.100md.com
43.4±1.74
5.2±2.3
1
40.9±1.54
2.1±1.9
2
43.7±2.34
4.0±1.1
3
45.1±2.44
0.8±1.3
4
, 百拇医药 42.9±1.64
2.6±2.3
6
43.6±2.64
1.6±2.8
8
44.1±0.93
8.4±1.6
图2 给予ActD后，FSHR mRNA代谢水平变化(NPA)
2.3 FSHR mRNA含量和稳定性
, 百拇医药 用NPA测定FSHR mRNA，线性回归进行分析，结果显示对照组在整个培养过程中hFSHR-Y1细 胞FSHR mRNA维持稳定水平[(2.9±0.3) pg/μg RNA, n=3]。与ActD培养8 h，可引 起hFSHR mRNA呈指数形式下降。线性回归分析提示：当转录过程被抑制后，ActD 处理的细 胞hFSHR mRNA半衰期为(3.6±0.2) h (n=3)
用RT-PCR的方法也获得了相同的结果(图3)，恒定水平的FSHR mRNA为(2.7±0.3)p g/μg RNA (n=3)。与ActD同时培养，测得的半衰期为(3.1±0.1)h (n=3)。
3 讨论
现在越来越清楚mRNA稳定性的调节是激素 影响基因表达的重要机理。为了评价在缺乏新RNA合成的情况下，FSHR mRNA消失过程，我们用ActD抑制RNA合成。目前有许多种方法可以 确定 mRNA的半衰期，但最便利的确定已经存在的mRNA分子半衰期的方法是应用新RNA合成抑 制剂[4]。ActD本身能交连到DNA上，阻断几乎所有的RNA合成。还有一些人发现Act D能阻 断翻译过程。有人报道，用ActD确定的半衰期与用其它转录抑制剂和其它方法确定的半衰期 有所差异[5]。但在Hela 细胞，用ActD处理后，FSHR mRNA衰退并没有被人为的 加速。本研究测定的人FSHR mRNA半衰期是在8 h内完成的，在如此短的时间内，我们没有观察到ActD对 总RNA产生、细胞形态或者细胞活率等明显的毒性作用。
, 百拇医药
图3 给予ActD后，FSHR mRNA代谢水平变化(RT-PCR)
有人用NPA方法测定了人和猴睾丸FSHR mRNA水平为0.05到0.1 pg/μg DNA [6] 。本研究 结果显示hFSHR-Y1细胞FSHR mRNA水平比睾丸组织高20-30倍。出现这种情况可能与表达质 粒的表达水平有关。
目前还没有定量数据涉及FSH对FSHR mRNA稳定性和mRNA在体和离体代谢动力学的报道。用no rthern杂交方法，Tano等发现activin和8-Br-cAMP 可增加大鼠颗粒细胞FSHR mRNA稳定状 态 水平约1.7到3.5倍[7]。在ActD存在的条件下，cAMP类似物对FSHR mRNA降解速率 没有任何 作用。但activin 可增加2.4 kb FSHR mRNA片段的半衰期。在本研究中我们用ActD阻断转 录 ，然后定量测定FSHR mRNA，尽管这种方法可能偶尔会导致对降解速率错误的估计，但大多 数情况下，用转录抑制剂可较为准确的估算出mRNA的降解速率。用这种方法我们测得的FSHR mRNA半衰期分别为(3.6±0.2)h(NPA)和(3.1±0.1)h(RT-PCR)。
, http://www.100md.com
某一特异mRNA含量代表着降解和合成速率的一种平衡。细胞内mRNA降解过程的调节已经 被认为是生物系统的一个重要控制调节位点[8]。一般来说，在内切酶作用之前， 细胞内mRNA是相对稳定的。大多数mRNA的5'和3'末端由于存在5' 帽结构和3'聚腺苷酸尾可 免于受到外切酶的作用。因此细胞内切核酸酶的作用和保护性聚腺苷酸尾的除去可能是许多 mRNA降解的关键步骤。分析人FSHR mRNA，其3'含有poly(A)，5'非翻译区长度为18碱基对， 从而对FSHR mRNA的稳定性起到保护作用。
湖北省自然科学基金项目(99J158)
朱长虹，男，1962年生，副教授
参 考 文 献
1，Ross J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiol Rev, 1995, 59 :423
, 百拇医药
2，Levine R A, McCormack J E, Buckler A et al. Transcriptional and pos ttranscriptional control of c-myc gene expression in WEHI 231 cells. Mol Cell Biol, 1986, 6:4112
3，Diviacco S, Norio P, Zentilin L et al. A novel procedure for qu anti tative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates. Ge ne, 1992, 15:313
4，Shi H, Segaloff D L. A role for increased lutropin/choriogonadotrop in receptor (LHR) gene transcription in the follitropin-stimulated induction of the LHR in granulosa cells. Mol Endocrinol, 1995, 9:734
, 百拇医药
5，Dankbar B, Brinkworth M H, Schlatt S et al. Ubiquitous expressi on o f the androgen receptor and testis-specific expression of FSH receptor in the c ynomolgus monkey (Macaca fascicularis) revealed by a ribonuclear protection assa y. J Steroid Biochem Mol Biol, 1995, 55:35
6，Dankbar B, Sohn M, Nieschlag E et al. Quantification of androge n re ceptor and follicle-stimulating hormone receptor mRNA levels in human and monke y testis by a ribonuclease protection assay. Int J Androl, 1995, 18:88
7，Tano M, Minegishi T, Nakmura K et al. Transcriptional and post -tra nscriptional regulation of FSH receptor in rat granulosa cells by cAMP and activ in. J Endocrinol, 1997, 153:465
.8，Braverman G. mRNA decay: finding the right targets. Cell, 1989 57: 9
(2000-03-30 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学计划生育研究所，武汉 430030
关键词：促卵泡刺激素受体；竞争性PCR；半衰期
同济医科大学学报000410 摘要 采用核酸酶保护测定(NPA)和定量反转录竞争 性多聚酶链反应方法(RT-PCR)，测定了表达重组促卵泡刺激素受体(FSHR)的转染细胞 (Y1)的FSHR mRNA的稳定性和半衰期。对照组FSHR mRNA量在8 h内保持恒定水平[NPA, (2 .9±0.3) pg/μg RNA; RT-PCR, (2.7±0.3) pg/μg RNA]。用[3H]尿苷结 合到RNA的方法，观察到Actinomycin D (ActD, 5 μg/ml) 在1 h内可抑制mRNA合成达90%。 在ActD存在的条件下，FSHR mRNA量在1 h后出现一个时间依赖性的显著下降，用NPA测得的 半衰期为(3.6±0.2) h，RT-PCR为(3.1±0.1) h。提示mRNA的降解速率在FSH R基因稳定表达维持上起着非常重要的作用。
, 百拇医药
中图法分类号 Q51， R817.9
Stability of Human and Porcine Follicl e-Stimulating Hormone Receptor
mRNA in Stably Transfected Cells
Zhu Changhong Xiong Zhongming Xiao Huizhu
(Family Planning Research Institute, Tongji Medical Uni versity, Wuhan 430030)
Abstract To assess the effects of mRNA degradation on steady state levels of follicle-st imulating hormone receptor (FSHR mRNA) and on the regulation of FSHR gene expres sion, the stability and half-life of FSHR mRNA were detected in transfected cel ls expressing recombinant FSHR. Time-dependent changes in FSHR mRNA content we re determined by nuclease protection-solution hybridization assay (NPA) or by quatitative reverse transcription-competitive polymerase chain reaction (RT-PC R) in the cultured hFSHR-Y1 cells. FSHR mRNA content remained constant during 8 h control incubation (NPA, 2.9±0.3 pg/μg RNA; RT-PCR, 2.7±0.3 pg/μg R NA). Actinomycin D (ActD, 5 μg/ml) inhibited mRNA synthesis, as assessed by in corporation of 〔3H〕uridine into total RNA, by 90 % within 1 h in the hFSHR- Y1 cells. No effect of ActD on cellular morphology or viability was observed. ActD caused a time-dependent decrease in FSHR mRNA content with a lag time of 1 h. The half-life of hFSHR mRNA was 3.6±0.2 h by NPA and 3.1±0.1 h by RT -PCR. The results indicated that degradation of mRNA was an important process i n maintenance of steady state expression of the FSHR gene in the cells stably ex pres sing recombinant receptor.
, 百拇医药
Key words
所有的有机体包括原核和真核生物的基因表达至少部分是由mRNA合成和降解速率所决定的 [1]。在哺育动物细胞，某一特异mRNA的丰度由于半衰期的变化可能波动数倍，而转 录水平没有任何改变[2]。换句话说，调节mRNA半衰期过程会影响到细胞如何生长 、分化、以及对环境的反应能力。mRNA含量的变化可以通过改变合成和转换速率而改变。精 确定量某一特定mRNA的半衰期对正确评价其在蛋白表达中的作用是非常重要的。
在本研究中，我们用NPA和RT-PCR方法，定量测定了表达重组人FSHR的转染细胞的预先 存在的FSHR mRNA量的时间依赖性改变。为了测定mRNA的半衰期，转录抑制剂Actinomycin D (ActD) 被用来阻断新mRNA的合成。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 主要试剂
细胞培养基和试剂、限制酶、Taq DNA多聚酶、超级转录酶Ⅱ、脱氧核糖核苷酸等购于G IBCO (Grand Island, NY)。ActD和hepes购于Sigma (St. Louis, MO). RNease RNA 提 取试剂盒从Qiagen (Valencia, CA)获得。[α-32P]UTP, [α-32P]dC TP 和 [5,6-3H]尿苷为Dupont New England Nuclear (Boston, MA)产品。Klenow DNA 聚合酶, T7 RNA聚合酶, RNase-free DNase I, DTT, E. Coli tRNA和RNA酶抑制剂从Boehr inger-Mannheim (Indianapolis, IN)购得。 Acrylamide, bisacrylamide, TEMED和ammon ium persulfate从Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA)获得。 Whatman GF/C 玻璃纤维 膜从Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)获得。NPA试剂从Ambion (Austin, TX)获得。RT -PCR引物和竞争性模板由University of Cincinnati College of Medicine提供。全长人F SHR cDNA由Dr. Jörg Gromoll (University of Münster)赠送。
, http://www.100md.com
1.2 细胞培养
表达重组人FSHR的Y1细胞培养于Ham's F-10基质中，同时添加15%马血清，2.5 %胎牛血清 ，1%谷氨酰胺，10 mmol/L Hepes和80 μg/ml geneticin。细胞种植于6 cm培养盘中，数量 为5×106/盘，培养液的量为3 ml，培养条件为37 ℃，95% O2，5% CO2。24 h后，加 或者不加ActD (5 μg/ml)。继续培养不同时间，然后收获细胞并提取RNA，同时检查细胞 形态和活率用以观察ActD对细胞的毒性作用。
1.3 RNA提取
细胞用冰冷的0.14 mol/L NaCl，0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液(pH 7.3)洗涤3次，根据公 司 产品说明书，用Qiagen RNease RNA试剂盒提取RNA，RNA浓度用分光光度计在波长为260 nm 处测定。
, 百拇医药
1.4 [3H]-尿苷与总RNA结合实验
4×106细胞培养于6 cm培养盘中，在3 ml培养液中，37 ℃连续培养24 h。然后加或 者不加ActD (5 μg/ml)，在存在10 Ci/ml [5,6-3H] 尿苷的条件下，再继续培养0 、1、2、 4、6、8 或者24 h。丢弃培养液，用冰冷的磷酸缓冲液洗涤细胞5次。总RNA用Qiagen RNeas e RNA试剂盒提取。RNA用DEPC水溶解并同时加入三氯醋酸(TCA，终浓度为6%)。TCA沉淀物 收集到Whatman 玻璃滤膜上。滤膜用含0.1% 尿苷的6%的TCA洗涤2次。最后用液体闪烁仪测 定放射活性。
1.5 核酸酶保护测定(NPA)
用人工合成的FSHR mRNA作为标准品进行NPA。合成方法如下：用BssH II消化的FSHR cD NA作为模板，1 ng的线性化cDNA(20 μl)加转录缓冲液，10 mmol/L DTT，0.5 mmol/L N TP s，100 mU RNA酶抑制剂和10 U T7 RNA聚合酶，37℃合成2 h。反应混合物用DNA酶消化，mR NA用100 mmol/L LiCl沉淀，乙醇洗涤，溶解于DEPC水中，在260nm波长处分光光度计定量。
, http://www.100md.com
cDNA探针合成，NPA测定方法，以及mRNA统计计算方法参考公司产品说明书(Ambion) 。
1.6 RT竞争性PCR
参考文献[3]报道的方法设计合成竞争性模板。该竞争性模板和要放大的目标D NA具有相同的序列，只是在模板的中间插入了20个碱基对，由于长度上的差异，因此电泳之 后竞争性模板和目标DNA非常容易区分开来。
用反义外引物转录出FSHR cDNA，固定量的反转录产物加不同量的竞争性模板用外引物 同时进行放大，放大产物用8%的聚丙酰胺电泳分离，分离后的条带数码照相。竞争性模板和 目标的条带的密度用图象分析程序进行量化处理，当两者之间的比值为1时，竞争性模板的 量将等于mRNA的量。由于竞争性模板长于目标cDNA，大约1.062的调节系数将用于调节FSHR mRNA的量。
1.7 数据分析
, http://www.100md.com
半衰期用线性回归方法进行计算，所有的实验均至少重复3次。
2 结果
2.1 转染细胞总RNA合成
用hFSHR-Y1细胞与[5,6-3H]尿苷培养确定RNA合成的时间过程。标记的尿苷结合到总 RNA用三氯醋酸沉淀进行测定。培养前8 h，总RNA合成比较迅速，随之缓慢降低(图1)。大 约占总加入放射量的0.27%被结合到hFSHR-Y1细胞。为了评价ActD 阻断新RNA合成的效率 ，培养液中加5 μg/ml ActD，然后与[5,6-3H]尿苷培养不同时间。ActD在1 h内 可抑制90% RNA合成，2 h为95%。结果提示ActD是一个较好的RNA合成抑制剂。
图1 ActD对尿苷与RNA结合的影响
, 百拇医药
2.2 ActD对总RNA含量的作用
为了确定暴露于ActD 是否改变总RNA的含量，于不同时间点提取RNA(每个样品细胞含量为4 ×106)，然后用分光光度计定量测定RNA量。比较对照组和ActD 组的结果揭示在整个培养 期间，总RNA保持相对恒定，8 h内没有观察到ActD 对总RNA含量的可测得性改变(表1)。
表1 ActD对总RNA合成的影响 (
±s，n=6) 培养时间(h)RNA产量 (μg/盘)
对照组
ActD组
0
, http://www.100md.com
43.4±1.74
5.2±2.3
1
40.9±1.54
2.1±1.9
2
43.7±2.34
4.0±1.1
3
45.1±2.44
0.8±1.3
4
, 百拇医药 42.9±1.64
2.6±2.3
6
43.6±2.64
1.6±2.8
8
44.1±0.93
8.4±1.6
图2 给予ActD后，FSHR mRNA代谢水平变化(NPA)
2.3 FSHR mRNA含量和稳定性
, 百拇医药 用NPA测定FSHR mRNA，线性回归进行分析，结果显示对照组在整个培养过程中hFSHR-Y1细 胞FSHR mRNA维持稳定水平[(2.9±0.3) pg/μg RNA, n=3]。与ActD培养8 h，可引 起hFSHR mRNA呈指数形式下降。线性回归分析提示：当转录过程被抑制后，ActD 处理的细 胞hFSHR mRNA半衰期为(3.6±0.2) h (n=3)
用RT-PCR的方法也获得了相同的结果(图3)，恒定水平的FSHR mRNA为(2.7±0.3)p g/μg RNA (n=3)。与ActD同时培养，测得的半衰期为(3.1±0.1)h (n=3)。
3 讨论
现在越来越清楚mRNA稳定性的调节是激素 影响基因表达的重要机理。为了评价在缺乏新RNA合成的情况下，FSHR mRNA消失过程，我们用ActD抑制RNA合成。目前有许多种方法可以 确定 mRNA的半衰期，但最便利的确定已经存在的mRNA分子半衰期的方法是应用新RNA合成抑 制剂[4]。ActD本身能交连到DNA上，阻断几乎所有的RNA合成。还有一些人发现Act D能阻 断翻译过程。有人报道，用ActD确定的半衰期与用其它转录抑制剂和其它方法确定的半衰期 有所差异[5]。但在Hela 细胞，用ActD处理后，FSHR mRNA衰退并没有被人为的 加速。本研究测定的人FSHR mRNA半衰期是在8 h内完成的，在如此短的时间内，我们没有观察到ActD对 总RNA产生、细胞形态或者细胞活率等明显的毒性作用。
, 百拇医药
图3 给予ActD后，FSHR mRNA代谢水平变化(RT-PCR)
有人用NPA方法测定了人和猴睾丸FSHR mRNA水平为0.05到0.1 pg/μg DNA [6] 。本研究 结果显示hFSHR-Y1细胞FSHR mRNA水平比睾丸组织高20-30倍。出现这种情况可能与表达质 粒的表达水平有关。
目前还没有定量数据涉及FSH对FSHR mRNA稳定性和mRNA在体和离体代谢动力学的报道。用no rthern杂交方法，Tano等发现activin和8-Br-cAMP 可增加大鼠颗粒细胞FSHR mRNA稳定状 态 水平约1.7到3.5倍[7]。在ActD存在的条件下，cAMP类似物对FSHR mRNA降解速率 没有任何 作用。但activin 可增加2.4 kb FSHR mRNA片段的半衰期。在本研究中我们用ActD阻断转 录 ，然后定量测定FSHR mRNA，尽管这种方法可能偶尔会导致对降解速率错误的估计，但大多 数情况下，用转录抑制剂可较为准确的估算出mRNA的降解速率。用这种方法我们测得的FSHR mRNA半衰期分别为(3.6±0.2)h(NPA)和(3.1±0.1)h(RT-PCR)。
, http://www.100md.com
某一特异mRNA含量代表着降解和合成速率的一种平衡。细胞内mRNA降解过程的调节已经 被认为是生物系统的一个重要控制调节位点[8]。一般来说，在内切酶作用之前， 细胞内mRNA是相对稳定的。大多数mRNA的5'和3'末端由于存在5' 帽结构和3'聚腺苷酸尾可 免于受到外切酶的作用。因此细胞内切核酸酶的作用和保护性聚腺苷酸尾的除去可能是许多 mRNA降解的关键步骤。分析人FSHR mRNA，其3'含有poly(A)，5'非翻译区长度为18碱基对， 从而对FSHR mRNA的稳定性起到保护作用。
湖北省自然科学基金项目(99J158)
朱长虹，男，1962年生，副教授
参 考 文 献
1，Ross J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiol Rev, 1995, 59 :423
, 百拇医药
2，Levine R A, McCormack J E, Buckler A et al. Transcriptional and pos ttranscriptional control of c-myc gene expression in WEHI 231 cells. Mol Cell Biol, 1986, 6:4112
3，Diviacco S, Norio P, Zentilin L et al. A novel procedure for qu anti tative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates. Ge ne, 1992, 15:313
4，Shi H, Segaloff D L. A role for increased lutropin/choriogonadotrop in receptor (LHR) gene transcription in the follitropin-stimulated induction of the LHR in granulosa cells. Mol Endocrinol, 1995, 9:734
, 百拇医药
5，Dankbar B, Brinkworth M H, Schlatt S et al. Ubiquitous expressi on o f the androgen receptor and testis-specific expression of FSH receptor in the c ynomolgus monkey (Macaca fascicularis) revealed by a ribonuclear protection assa y. J Steroid Biochem Mol Biol, 1995, 55:35
6，Dankbar B, Sohn M, Nieschlag E et al. Quantification of androge n re ceptor and follicle-stimulating hormone receptor mRNA levels in human and monke y testis by a ribonuclease protection assay. Int J Androl, 1995, 18:88
7，Tano M, Minegishi T, Nakmura K et al. Transcriptional and post -tra nscriptional regulation of FSH receptor in rat granulosa cells by cAMP and activ in. J Endocrinol, 1997, 153:465
.8，Braverman G. mRNA decay: finding the right targets. Cell, 1989 57: 9
(2000-03-30 收稿), 百拇医药