毛细管区带电泳法直接进样测定腹水中左旋氧氟沙星含量
作者：慈薇 柴逸峰 刘荔荔 尹茶 吴玉田
单位：慈薇 柴逸峰 刘荔荔 尹茶 吴玉田(第二军医大学药学院仪器测试中心 上海 200433)
关键词：毛细管区带电泳；左旋氧氟沙星；腹水
药物分析杂志000408 摘要 目的：用毛细管区带电泳法直接进样测定腹水中左旋氧氟沙星含量。方法：采用50 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(磷酸调节pH为2.44)，其中加入40 mmol.L-1离子对试剂四丁基溴化铵；运行电压20 kV；柱温25 ℃；检测波长214 nm；虹吸法进样30 s；熔融石英毛细管60 cm×75 μm(有效长度52 cm)，未涂渍；16 min内完成检测。结果：以依诺沙星为内标，左旋氧氟沙星浓度在1～8 mg.L-1范围内有良好的线性关系，r=0.999 5；方法平均回收率为95.90%～99.17%，日内及日间RSD均小于5%；最低检测限为0.3 mg.L-1。结论：样品无需预处理，直接进样分析测定，方法简便可行。
, 百拇医药
Direct Determination of (-)-Ofloxacin in Ascites by Capillary Zone
Electrophoresis(CZE)
Ci Wei Chai Yifeng Liu Lili Yin Cha Wu Yutian
(The Center of Analysis & Test,College of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433)
Abstract Objective：A direct analytical method has been developed to determine the concentration of (-)-ofloxacin in ascites by CZE without pretreatment.Method:Good separation was achieved under the conditions as follows:50 mmol.L-1 phosphate buffer(pH 2.44) containing 40 mmol.L-1 ion-pair reagent;running voltage:20 kV;detector:UV 214 nm;injection:hydrostatic for 30 s;temperature:25 ℃;uncoated capillary tube:60 cm×75 μm.Results:Enoxacin was chosen as internal standard,the assay was linear for(-)-ofloxacin in the concentration range of 1～8 mg.L-1,r=0.999 5；the mean recovery was 95.90%～99.17%,while the RSD for the within-day and between-day precision were all less than 5%;the LOD was 0.3 mg.L-1.Conclusion:This method is simple and rapid.It can be operated without pretreatment.
, 百拇医药
Key words capillary zone electrophoresis,(-)-ofloxacin,ascites▲
氧氟沙星为喹诺酮类广谱抗生素，是目前临床常用抗生素之一；文献报道左旋氧氟沙星对革兰氏阳性菌和阴性菌的作用比右旋氧氟沙星强8～128倍，比混旋氧氟沙星约强1倍[1]。腹水病因众多，是临床常见体征之一[2]。毛细管电泳是近十几年发展起来的一种新型分离分析技术；它兼具电泳方法与色谱技术的特点，具有高效、快速、灵敏、进样量少、信息量大、运行成本低、易于自动化等优点[3]。本文应用毛细管电泳法，测定口服给药后肝炎病人腹水中左旋氧氟沙星浓度，为该药在肝炎治疗中的应用及给药方案设计提供了科学依据。
1 仪器与试药
Waters自动毛细管电泳仪(Capillary Ion Analyzer)；熔融石英毛细管60 cm×75 μm(河北永年光导纤维厂)，有效长度52 cm,未涂渍。
, http://www.100md.com
所有试剂均为分析纯。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(上海新华化工厂)，磷酸(85%，上海联合化工厂)，四丁基溴化铵(上海化学试剂公司)，左旋氧氟沙星对照品(日本DAIICHI公司提供)及内标依诺沙星(军事医学科学院提供)的纯度均为99%以上。水为重蒸水。腹水样品由长海医院传染科提供。
2 实验条件
每次开机后用1 mol.L-1氢氧化钠溶液冲洗20 min，水冲洗10 min，运行缓冲液冲洗10 min；2次进样之间用1 mol.L-1氢氧化钠溶液、水及运行缓冲液各冲洗5 min。
运行电压20 kV；虹吸法进样30 s；柱温25 ℃；检测波长214 nm；灵敏度0.01 AUFS。运行缓冲液配制：将50 mmol.L-1的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠溶液等体积混合，用磷酸调 节pH至2.44，加入离子对试剂四丁基溴化铵至浓度为40 mmol.L-1，用0.45 μm滤膜过滤。
, 百拇医药
3 溶液配制
精密称取左旋氧氟沙星对照品、依诺沙星(内标)各约50 mg，分别加水至10 mL，用水稀释即得100 mg.L-1左旋氧氟沙星对照品溶液及125 mg.L-1依诺沙星内标溶液。
4 方法与结果
4.1 标准曲线、线性范围及最低检测限 精密量取5份空白腹水各1.0 mL，皆精密加入内标溶液40 μL，再分别精密加入左旋氧氟沙星对照品溶液10，20，40，60，80 μL，于上述实验条件下直接进样测定，图谱见图1。以对照品浓度X(mg.L-1)为横坐标，对照品与内标的校正峰面积之比Y〔A对照品.t内标/(A内标.t对照品)〕为纵坐标，进
, 百拇医药
行线性回归，回归方程为：
Y=-0.049 46+0.448 9X r=0.999 5
线性范围为1～8 mg.L-1。当信噪比大于3时，氧氟沙星最低检测限为0.3 mg.L-1。
图1 空白腹水中左旋氧氟沙星、依诺沙星毛细管电泳图
1.依诺沙星(内标) 2.左旋氧氟沙星
4.2 精密度实验 精密量取3份空白腹水各1.0 mL，皆精密加入内标溶液40 μL，再分别精密加入左旋氧氟沙星对照品溶液10，40，80 μL，同日、5日内按实验方法测定，结果见表1。
, 百拇医药
表1 精密度实验结果(n=5) 浓度/mg.L-1
日内
日间
测得浓度/mg.L-1
RSD/%
测得浓度/
mg.L-1
RSD/%
1.00
1.06
2.89
, 百拇医药
1.17
4.03
4.00
3.94
2.19
4.12
3.15
8.00
7.95
1.50
8.01
3.07
4.3 回收率实验 精密量取底药量一定的腹水3份各1.0 mL，皆精密加入内标溶液40 μL，再分别精密加入左旋氧氟沙星对照品溶液10，40，80 μL，同日、3日内按实验方法测定，计算加样回收率，结果见表2，同日及隔日测定结果相同。表2 回收率实验结果(n=3) 加入浓度/mg.L-1
, 百拇医药
回收率/%
RSD/%
1.00
95.90
7.04
4.00
98.17
5.31
8.00
99.17
5.40
4.4 样品测定 精密量取待测腹水样品1.0 mL，加入内标溶液40 μL，在实验条件下直接进样分析，结果见图2。实际样品图谱见图3。
, 百拇医药
图2 口服给药200 mg后，5名肝炎病人
腹水中左旋氧氟沙星药时曲线
图3 实际样品图谱
a.浓度1.26 mg.L-1 b.浓度3.71 mg.L-1
c.浓度8.00 mg.L-1
1.依诺沙星(内标) 2.左旋氧氟沙星
5 讨论
5.1 腹水中含有多种蛋白质[4]，易为毛细管内壁吸附，使柱效下降，影响分离重现性。文献中常用极端pH法抑制蛋白吸附[5]。本实验考察了较高pH(10.39，9.37，8.51)和较低pH(2.44)条件下的分离情况。结果表明：本实验中酸性条件优于碱性条件，故选用pH 2.44。
, 百拇医药
5.2 为进一步改善分离，在选定缓冲液中加入离子对试剂四丁基溴化铵。分别考察其浓度为10，20，30，40 mmol.L-1条件下分离情况。结果表明：浓度为40 mmol.L-1时，左旋氧氟沙星可与样品中其余组分基线分离，峰形对称；鉴于缓冲液离子强度过高会相应引起电流过高，产生大量焦耳热，使分离恶化，故未再提高离子对试剂浓度，选用浓度为40 mmol.L-1。
5.3 体内药物分析因干扰较多，常需进行样品预处理；而本文可直接进样分析测定，简化了实验步骤，所得结果较为准确可靠。
5.4 腹水中左旋氧氟沙星浓度与病人腹水体积多少有关，若病人腹水量偏少，则相应腹水中药物浓度偏高。图2中有一条曲线异于其它曲线，此病例中病人腹水量较少，故而药物浓度偏高。
5.5 左旋氧氟沙星对大多数细菌的最低抑菌浓度(MIC90)均小于1.56 mg.L-1[1，6]。本文样品测定结果表明：一次性口服给药200 mg后，左旋氧氟沙星可较快进入腹水；给药后2～12 h范围内，左旋氧氟沙星腹水浓度大于1.56 mg.L-1，能够有效地抑制细菌，缓解病情。-■
, http://www.100md.com
参考文献
1.Tannka M.DR-3355的体外与体内抗菌作用.国外医药抗生素分册，1992，13(1)：53
2.赵跃青.腹水诊断的若干进展.国外医学内科学分册，1993，20(5)：213
3.林炳承.毛细管电泳导论.第2版.北京：科学出版社，1996.1
4.Sherlockzh S.肝胆系统疾病.第3版.上海：上海科学技术出版社，1980.116
5.董文玉.毛细管电泳在结构相近多肽蛋白分析分离中的应用.药物分析杂志，1997，17(3)：204
6.袁富山.喹诺酮类药物研究进展.国外医药合成药生化药制剂分册，1996，17(2)：86
(本文于2000年1月25日修改回), 百拇医药
单位：慈薇 柴逸峰 刘荔荔 尹茶 吴玉田(第二军医大学药学院仪器测试中心 上海 200433)
关键词：毛细管区带电泳；左旋氧氟沙星；腹水
药物分析杂志000408 摘要 目的：用毛细管区带电泳法直接进样测定腹水中左旋氧氟沙星含量。方法：采用50 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(磷酸调节pH为2.44)，其中加入40 mmol.L-1离子对试剂四丁基溴化铵；运行电压20 kV；柱温25 ℃；检测波长214 nm；虹吸法进样30 s；熔融石英毛细管60 cm×75 μm(有效长度52 cm)，未涂渍；16 min内完成检测。结果：以依诺沙星为内标，左旋氧氟沙星浓度在1～8 mg.L-1范围内有良好的线性关系，r=0.999 5；方法平均回收率为95.90%～99.17%，日内及日间RSD均小于5%；最低检测限为0.3 mg.L-1。结论：样品无需预处理，直接进样分析测定，方法简便可行。
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Direct Determination of (-)-Ofloxacin in Ascites by Capillary Zone
Electrophoresis(CZE)
Ci Wei Chai Yifeng Liu Lili Yin Cha Wu Yutian
(The Center of Analysis & Test,College of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433)
Abstract Objective：A direct analytical method has been developed to determine the concentration of (-)-ofloxacin in ascites by CZE without pretreatment.Method:Good separation was achieved under the conditions as follows:50 mmol.L-1 phosphate buffer(pH 2.44) containing 40 mmol.L-1 ion-pair reagent;running voltage:20 kV;detector:UV 214 nm;injection:hydrostatic for 30 s;temperature:25 ℃;uncoated capillary tube:60 cm×75 μm.Results:Enoxacin was chosen as internal standard,the assay was linear for(-)-ofloxacin in the concentration range of 1～8 mg.L-1,r=0.999 5；the mean recovery was 95.90%～99.17%,while the RSD for the within-day and between-day precision were all less than 5%;the LOD was 0.3 mg.L-1.Conclusion:This method is simple and rapid.It can be operated without pretreatment.
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Key words capillary zone electrophoresis,(-)-ofloxacin,ascites▲
氧氟沙星为喹诺酮类广谱抗生素，是目前临床常用抗生素之一；文献报道左旋氧氟沙星对革兰氏阳性菌和阴性菌的作用比右旋氧氟沙星强8～128倍，比混旋氧氟沙星约强1倍[1]。腹水病因众多，是临床常见体征之一[2]。毛细管电泳是近十几年发展起来的一种新型分离分析技术；它兼具电泳方法与色谱技术的特点，具有高效、快速、灵敏、进样量少、信息量大、运行成本低、易于自动化等优点[3]。本文应用毛细管电泳法，测定口服给药后肝炎病人腹水中左旋氧氟沙星浓度，为该药在肝炎治疗中的应用及给药方案设计提供了科学依据。
1 仪器与试药
Waters自动毛细管电泳仪(Capillary Ion Analyzer)；熔融石英毛细管60 cm×75 μm(河北永年光导纤维厂)，有效长度52 cm,未涂渍。
, http://www.100md.com
所有试剂均为分析纯。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(上海新华化工厂)，磷酸(85%，上海联合化工厂)，四丁基溴化铵(上海化学试剂公司)，左旋氧氟沙星对照品(日本DAIICHI公司提供)及内标依诺沙星(军事医学科学院提供)的纯度均为99%以上。水为重蒸水。腹水样品由长海医院传染科提供。
2 实验条件
每次开机后用1 mol.L-1氢氧化钠溶液冲洗20 min，水冲洗10 min，运行缓冲液冲洗10 min；2次进样之间用1 mol.L-1氢氧化钠溶液、水及运行缓冲液各冲洗5 min。
运行电压20 kV；虹吸法进样30 s；柱温25 ℃；检测波长214 nm；灵敏度0.01 AUFS。运行缓冲液配制：将50 mmol.L-1的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠溶液等体积混合，用磷酸调 节pH至2.44，加入离子对试剂四丁基溴化铵至浓度为40 mmol.L-1，用0.45 μm滤膜过滤。
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3 溶液配制
精密称取左旋氧氟沙星对照品、依诺沙星(内标)各约50 mg，分别加水至10 mL，用水稀释即得100 mg.L-1左旋氧氟沙星对照品溶液及125 mg.L-1依诺沙星内标溶液。
4 方法与结果
4.1 标准曲线、线性范围及最低检测限 精密量取5份空白腹水各1.0 mL，皆精密加入内标溶液40 μL，再分别精密加入左旋氧氟沙星对照品溶液10，20，40，60，80 μL，于上述实验条件下直接进样测定，图谱见图1。以对照品浓度X(mg.L-1)为横坐标，对照品与内标的校正峰面积之比Y〔A对照品.t内标/(A内标.t对照品)〕为纵坐标，进
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行线性回归，回归方程为：
Y=-0.049 46+0.448 9X r=0.999 5
线性范围为1～8 mg.L-1。当信噪比大于3时，氧氟沙星最低检测限为0.3 mg.L-1。
图1 空白腹水中左旋氧氟沙星、依诺沙星毛细管电泳图
1.依诺沙星(内标) 2.左旋氧氟沙星
4.2 精密度实验 精密量取3份空白腹水各1.0 mL，皆精密加入内标溶液40 μL，再分别精密加入左旋氧氟沙星对照品溶液10，40，80 μL，同日、5日内按实验方法测定，结果见表1。
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表1 精密度实验结果(n=5) 浓度/mg.L-1
日内
日间
测得浓度/mg.L-1
RSD/%
测得浓度/
mg.L-1
RSD/%
1.00
1.06
2.89
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1.17
4.03
4.00
3.94
2.19
4.12
3.15
8.00
7.95
1.50
8.01
3.07
4.3 回收率实验 精密量取底药量一定的腹水3份各1.0 mL，皆精密加入内标溶液40 μL，再分别精密加入左旋氧氟沙星对照品溶液10，40，80 μL，同日、3日内按实验方法测定，计算加样回收率，结果见表2，同日及隔日测定结果相同。表2 回收率实验结果(n=3) 加入浓度/mg.L-1
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回收率/%
RSD/%
1.00
95.90
7.04
4.00
98.17
5.31
8.00
99.17
5.40
4.4 样品测定 精密量取待测腹水样品1.0 mL，加入内标溶液40 μL，在实验条件下直接进样分析，结果见图2。实际样品图谱见图3。
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图2 口服给药200 mg后，5名肝炎病人
腹水中左旋氧氟沙星药时曲线
图3 实际样品图谱
a.浓度1.26 mg.L-1 b.浓度3.71 mg.L-1
c.浓度8.00 mg.L-1
1.依诺沙星(内标) 2.左旋氧氟沙星
5 讨论
5.1 腹水中含有多种蛋白质[4]，易为毛细管内壁吸附，使柱效下降，影响分离重现性。文献中常用极端pH法抑制蛋白吸附[5]。本实验考察了较高pH(10.39，9.37，8.51)和较低pH(2.44)条件下的分离情况。结果表明：本实验中酸性条件优于碱性条件，故选用pH 2.44。
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5.2 为进一步改善分离，在选定缓冲液中加入离子对试剂四丁基溴化铵。分别考察其浓度为10，20，30，40 mmol.L-1条件下分离情况。结果表明：浓度为40 mmol.L-1时，左旋氧氟沙星可与样品中其余组分基线分离，峰形对称；鉴于缓冲液离子强度过高会相应引起电流过高，产生大量焦耳热，使分离恶化，故未再提高离子对试剂浓度，选用浓度为40 mmol.L-1。
5.3 体内药物分析因干扰较多，常需进行样品预处理；而本文可直接进样分析测定，简化了实验步骤，所得结果较为准确可靠。
5.4 腹水中左旋氧氟沙星浓度与病人腹水体积多少有关，若病人腹水量偏少，则相应腹水中药物浓度偏高。图2中有一条曲线异于其它曲线，此病例中病人腹水量较少，故而药物浓度偏高。
5.5 左旋氧氟沙星对大多数细菌的最低抑菌浓度(MIC90)均小于1.56 mg.L-1[1，6]。本文样品测定结果表明：一次性口服给药200 mg后，左旋氧氟沙星可较快进入腹水；给药后2～12 h范围内，左旋氧氟沙星腹水浓度大于1.56 mg.L-1，能够有效地抑制细菌，缓解病情。-■
, http://www.100md.com
参考文献
1.Tannka M.DR-3355的体外与体内抗菌作用.国外医药抗生素分册，1992，13(1)：53
2.赵跃青.腹水诊断的若干进展.国外医学内科学分册，1993，20(5)：213
3.林炳承.毛细管电泳导论.第2版.北京：科学出版社，1996.1
4.Sherlockzh S.肝胆系统疾病.第3版.上海：上海科学技术出版社，1980.116
5.董文玉.毛细管电泳在结构相近多肽蛋白分析分离中的应用.药物分析杂志，1997，17(3)：204
6.袁富山.喹诺酮类药物研究进展.国外医药合成药生化药制剂分册，1996，17(2)：86
(本文于2000年1月25日修改回), 百拇医药