高效液相色谱法测定肠必清肠溶颗粒剂中番泻苷的含量
作者：钱启辉 田莉 陈象清 刘圣 陈礼明 刘丛彬
单位：刘丛彬(安徽中医学院99级毕业生，合肥市230001)；钱启辉 田莉 陈象清 刘圣 陈礼明(安徽省立医院药剂科制剂研究室，合肥市230001)
关键词：高效液相色谱；肠必清肠溶颗粒；番泻苷A；番泻苷B；含量测定
中国药房000405
摘要：目的：建立高效液相色谱法测定肠必清肠溶颗粒剂中番泻苷A、B含量的方法。方法：以C18柱为分析柱，以50%乙腈(含0.25mmol/L十六烷基三甲基溴化铵和0.25mmol/L磷酸氢二钠，每200ml加入冰醋酸75μl)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为270nm。结果：在0.25μg/ml～80.0μg/ml浓度范围内呈线性关系(番泻苷A：r=0.9997；番泻苷B：r=0.9997)，番泻苷A、B测定方法重现性较好(RSD<2%)的精密度均<2%，回收率均>98%。结论：本方法简单、准确、重现性好，可以用于肠必清肠溶颗粒剂的质量控制
, 百拇医药
中图分类号：R927.2 文献标识码：B 文章编号：1001-0408(2000)04-0153-03
Determination of Sennoside A and Sennoside B in Chang Bi Qing Enteric-coated Granules with HPLC
QIAN Qihui
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
TIAN Li
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
, 百拇医药
CHEN Xiangqing
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
LIU Sheng
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
CHEN Liming
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
LIU Congbing
, 百拇医药
(Graduate of Anhui College of TCM,Hefei 230001)
ABSTRACT： OBJECTIVE： To estoblish a method of determination of the contents of sennoside A and sennoside B in Chang Bi Qing enteric-coated granules with HPLC.METHODS： The analytical column was C18.The mobile phase was 50% acetonitrile(containing 0.25mmol/L cetrimid and 0.25mmol/L Na2HPO475μ l acetic acid in 200ml).The flow rate was 1.0ml/min.The detecting wave-length was 270nm.RESULTS： The line was well in the range of 0.25μ g/ml～ 80.0μ g/ml(sennoside A:r=0.9 997;sennoside B:r=0.9 997).The average recoveries of sennoside A and sennoside B were 98.14% and 98.07% respectively and their repeatabilities were good(standard derivations<2% ).CONCLUSION:The method was simple,accurate,reproducible and can be used for quality control of the preparation.
, 百拇医药
KEY WORDS： HPLC;Chang Bi Qing enteric-coated granule;sennoside A;sennoside B;assay of content
肠必清肠溶颗粒剂是以番泻叶为君药，以青皮、木香为辅佐药的新型制剂，可作为致泻剂和清肠剂用于临床。番泻叶为该制剂的主药，其有效成分为蒽醌苷类，其中又以番泻苷A、B的含量最高[1]。各国药典对番泻叶及其制剂的含量测定大多采用比色法测定总番泻苷，但此类方法操作繁琐，重现性差。笔者根据本方特点，在参照有关文献[2～5]的基础上，采用高效液相色谱法测定本品中番泻苷A、B的含量。本方法与以往所报道的方法相比，具有简便、快速、准确、灵敏及专属性强等优点，分B离度好，可以作为本制剂质量控制的方法。
图1番泻苷A、B色谱图
图2番泻苷A、B光谱图
, 百拇医药 1仪器与试药
HP8453紫外-可见分光光度计(美国惠普公司，PentiumCPU)；高效液相色谱仪(美国SSI公司，525双波长紫外/可见光检测器，222D型泵，ANASTAR色谱数据处理系统)；TG328A型分析天平(上海天平仪器厂)；DJ灵巧型粉碎机(上海淀久实业有限公司)；H66025超声清洗机(无锡市超声电子设备厂)；SYZ-A石英亚沸蒸馏水器(江苏金坛信达仪器厂)。
番泻苷A、B对照品(日本和光纯药工业株式会社)。
乙腈、甲醇为色谱纯；流动相用水为亚沸水；其余试剂均为分析纯。
肠必清肠溶颗粒由安徽省立医院药剂科制剂研究室制备。
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱C18(4.6×250mm，5μm)；乙腈-水-十六烷基三甲基溴化铵-磷酸氢二钠(50∶50∶2.5mmol/L∶2.5mmol/L)并每200ml加冰醋酸75μl为流动相，流速为1.0ml/min；柱温为40℃，检测波长为270nm。理论板数按番泻苷A峰计算，应不低于3200。在本色谱条件下，空白、对照品及样品色谱图见图1。
, 百拇医药
2.2检测波长的确定：取番泻苷A和番泻苷B对照品各约3mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加70%甲醇适量，强烈振摇，使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置50ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，在200nm～700nm波长处扫描。结果表明，番泻苷A、B在270nm处均有一吸收峰(见图2)，故选择270nm为检测波长。
2.3标准曲线的制备：分别取番泻苷A、B对照品适量，用70%甲醇溶解并配制成标准溶液，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，以番泻苷A、B(C)的浓度为横坐标，经回归得线性方程：
番泻苷A：Y=2745+14614C(r=0.9997)
番泻苷B：Y=117+14656C(r=0.9997)
番泻苷A、B的线性范围均为0.25μg/ml～80μg/ml。
, http://www.100md.com
2.4精密度试验：分别取浓度为2.0、10.0、60.0μg/ml番泻苷A和番泻苷B标准溶液，按上述色谱条件重复进样测定5次，番泻苷A、B的峰面积积分值的相对标准偏差均<2%
<2% 。
2.5样品的测定：取样品6g，经粉碎机打成细粉，取0.1g于具塞三角烧瓶中，精密称定，加水25.0ml，超声提取20min，离心，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，进样。共测定6个批号的样品，表1 肠必清样品含量测定结果
批号
番泻苷A含量(mg/g)*
番泻苷B含量(mg/g)
番泻苷A:B
981012
, 百拇医药
2.84
4.53
1:1.59
981019
2.89
4.62
1:1.60
981103
2.96
4.70
1:1.59
990429
2.78
, 百拇医药
5.02
1:1.80
990504
2.83
4.67
1:1.65
990507
2.72
4.81
1:1.77
每克肠溶颗粒剂中番泻苷A的含量
2.6空白试验：按肠必清肠溶颗粒的处方比例和制备工艺，制备缺番泻叶的阴性对照样品。依2.5项方法测定，结果表明，肠必清肠溶颗粒中其它成分对番泻苷A、B的含量测定没有干扰(见图1B)。
, http://www.100md.com
2.7加样回收试验：取已知含量的肠必清肠溶颗粒细粉，分别加入番泻苷A、B对照品，依2.5项方法测定，5次测定平均回收率为：番泻苷A98.14%(RSD=1.39%)，番泻苷B98.07%(RSD=1.61%)。结果见表2、表3。
表2番泻苷A加样回收实验
编号
取样量(g)
样品含苷泻苷A量(mg)
番泻苷A加入量(mg)
测得量(mg)
回收率*(%)
平均回收率(%)
, 百拇医药
1
0.0926
0.2574
0.5800
0.8217
97.29
2
0.1001
0.2783
0.5800
0.8381
96.52
3
, 百拇医药
0.0957
0.2660
0.5800
0.8468
100.14
98.14%
4
0.0953
0.2649
0.5800
0.8352
98.33
RSD=1.39%
, 百拇医药
5
0.0916
0.2546
0.5800
0.8254
98.41
*回收率=(测得量—样品含番泻苷A量)/番泻苷A加入量×100%
表3番泻苷B加样回收实验
编号
取样量(g)
样品含苷泻苷A量(mg)
番泻苷A加入量(mg)
, 百拇医药
测得量(mg)
回收率*(%)
平均回收率(%)
1
0.0926
0.4649
0.6900
1.1494
99.20
2
0.1001
0.5025
, 百拇医药
0.6900
1.1672
96.33
3
0.0957
0.4804
0.6900
1.1516
97.28
98.07
4
0.0953
0.4784
, http://www.100md.com
0.6900
1.1698
100.20
RSD-1.61%
5
0.0916
0.4598
0.6900
1.1314
97.33
*回收率=(测得量—样品含番泻苷B量)/番泻苷B加入量×100%
2.8稳定性实验：吸取样品溶液，依2.5项方法在不同时间测定。结果表明，样品溶液在24h内稳定。
, http://www.100md.com
3讨论
3.1番泻苷A、B为双蒽酮葡萄糖苷，因分子结构含有羧基而具酸性，羧基可与流动相中的季铵盐形成离子对，使番泻苷A与番泻苷B及番泻苷A、B与其它成分得到较好的分离。微量的醋酸可改善分离效果，而40℃柱温可避免峰拖尾。
3.2本实验证实，水、70%甲醇、甲醇、四氢呋喃等溶媒对番泻苷A、B的色谱行为没有明显影响，但用0.5%碳酸氢钠作提取溶媒，番泻苷A、B峰的保留时间均提前，且两峰合为一峰，因此不宜采用。从经济及环保考虑，我们采用水为提取溶媒。
3.3在提取条件中，旋涡混合2min、水浴回流15min、超声提取20min及超声提取30min，提取效果无显著差异，可能是由于该制剂是由浸膏粉制备而成，番泻苷更易提取。番泻苷A、B的含量测定，由于1次实验的样品数较多，因此采用超声提取20min。
3.4用本文的含量测定方法对番泻叶原料、番泻叶浓缩颗粒(广州一方制药厂，批号980505)、通便灵胶囊(广东环球制药有限公司，批号980201)、番泻叶冲剂(扬州春光制药有限公司，批号970320)及番泻叶糖浆(蚌埠市第七制药厂，批号981112)进行了测定，均获得了满意的效果，可见，本方法也可作为番泻叶及其制剂含量测定的方法。
, http://www.100md.com
安徽省科委“九五”科技攻关项目，项目编号：9613013-3
参考文献：
[1] Stuppner H,Sturm S.LC-MS and CZE of dianthrones from cassia angustifolia and acutifolia[J].Chromatographia,1996,42(11/12):697.
[2] Satoch K,Seto T,Miyatake N,et al.Determination of sennoside A and sennoside B in formulation using capillary electrophoresis[J].Yakugaku Zasshi,1999,119(1):88.
[3] Liao W,Chiu K,Mabuni C,et al.Analysis of sennoside A and B from Dieter's tea by HPLC-diode array spectrophotometry and negative ion electrospray mass spectrometry[J].Bull Environ Contam Toxicol,1998,61(3):317.
[4]张庆生，王宝琴.高效液相色谱法测定麻仁丸中番泻苷A的含量[J].中国中药杂志，1995，20(7)：413.
[5] Shen SJ,Lu CF.Determination of eight constituents of hsiaochi-tang by high-performance liquid chromatography[J].J Chromtogr A,1995,704(2):518.
(收稿日期：2000-03-07 修回日期：2000-06-15), 百拇医药
单位：刘丛彬(安徽中医学院99级毕业生，合肥市230001)；钱启辉 田莉 陈象清 刘圣 陈礼明(安徽省立医院药剂科制剂研究室，合肥市230001)
关键词：高效液相色谱；肠必清肠溶颗粒；番泻苷A；番泻苷B；含量测定
中国药房000405
摘要：目的：建立高效液相色谱法测定肠必清肠溶颗粒剂中番泻苷A、B含量的方法。方法：以C18柱为分析柱，以50%乙腈(含0.25mmol/L十六烷基三甲基溴化铵和0.25mmol/L磷酸氢二钠，每200ml加入冰醋酸75μl)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为270nm。结果：在0.25μg/ml～80.0μg/ml浓度范围内呈线性关系(番泻苷A：r=0.9997；番泻苷B：r=0.9997)，番泻苷A、B测定方法重现性较好(RSD<2%)的精密度均<2%，回收率均>98%。结论：本方法简单、准确、重现性好，可以用于肠必清肠溶颗粒剂的质量控制
, 百拇医药
中图分类号：R927.2 文献标识码：B 文章编号：1001-0408(2000)04-0153-03
Determination of Sennoside A and Sennoside B in Chang Bi Qing Enteric-coated Granules with HPLC
QIAN Qihui
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
TIAN Li
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
, 百拇医药
CHEN Xiangqing
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
LIU Sheng
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
CHEN Liming
(Pharmaceutics Laboratory,Dept.of Pharmacy,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
LIU Congbing
, 百拇医药
(Graduate of Anhui College of TCM,Hefei 230001)
ABSTRACT： OBJECTIVE： To estoblish a method of determination of the contents of sennoside A and sennoside B in Chang Bi Qing enteric-coated granules with HPLC.METHODS： The analytical column was C18.The mobile phase was 50% acetonitrile(containing 0.25mmol/L cetrimid and 0.25mmol/L Na2HPO475μ l acetic acid in 200ml).The flow rate was 1.0ml/min.The detecting wave-length was 270nm.RESULTS： The line was well in the range of 0.25μ g/ml～ 80.0μ g/ml(sennoside A:r=0.9 997;sennoside B:r=0.9 997).The average recoveries of sennoside A and sennoside B were 98.14% and 98.07% respectively and their repeatabilities were good(standard derivations<2% ).CONCLUSION:The method was simple,accurate,reproducible and can be used for quality control of the preparation.
, 百拇医药
KEY WORDS： HPLC;Chang Bi Qing enteric-coated granule;sennoside A;sennoside B;assay of content
肠必清肠溶颗粒剂是以番泻叶为君药，以青皮、木香为辅佐药的新型制剂，可作为致泻剂和清肠剂用于临床。番泻叶为该制剂的主药，其有效成分为蒽醌苷类，其中又以番泻苷A、B的含量最高[1]。各国药典对番泻叶及其制剂的含量测定大多采用比色法测定总番泻苷，但此类方法操作繁琐，重现性差。笔者根据本方特点，在参照有关文献[2～5]的基础上，采用高效液相色谱法测定本品中番泻苷A、B的含量。本方法与以往所报道的方法相比，具有简便、快速、准确、灵敏及专属性强等优点，分B离度好，可以作为本制剂质量控制的方法。
图1番泻苷A、B色谱图
图2番泻苷A、B光谱图
, 百拇医药 1仪器与试药
HP8453紫外-可见分光光度计(美国惠普公司，PentiumCPU)；高效液相色谱仪(美国SSI公司，525双波长紫外/可见光检测器，222D型泵，ANASTAR色谱数据处理系统)；TG328A型分析天平(上海天平仪器厂)；DJ灵巧型粉碎机(上海淀久实业有限公司)；H66025超声清洗机(无锡市超声电子设备厂)；SYZ-A石英亚沸蒸馏水器(江苏金坛信达仪器厂)。
番泻苷A、B对照品(日本和光纯药工业株式会社)。
乙腈、甲醇为色谱纯；流动相用水为亚沸水；其余试剂均为分析纯。
肠必清肠溶颗粒由安徽省立医院药剂科制剂研究室制备。
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱C18(4.6×250mm，5μm)；乙腈-水-十六烷基三甲基溴化铵-磷酸氢二钠(50∶50∶2.5mmol/L∶2.5mmol/L)并每200ml加冰醋酸75μl为流动相，流速为1.0ml/min；柱温为40℃，检测波长为270nm。理论板数按番泻苷A峰计算，应不低于3200。在本色谱条件下，空白、对照品及样品色谱图见图1。
, 百拇医药
2.2检测波长的确定：取番泻苷A和番泻苷B对照品各约3mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加70%甲醇适量，强烈振摇，使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置50ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，在200nm～700nm波长处扫描。结果表明，番泻苷A、B在270nm处均有一吸收峰(见图2)，故选择270nm为检测波长。
2.3标准曲线的制备：分别取番泻苷A、B对照品适量，用70%甲醇溶解并配制成标准溶液，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，以番泻苷A、B(C)的浓度为横坐标，经回归得线性方程：
番泻苷A：Y=2745+14614C(r=0.9997)
番泻苷B：Y=117+14656C(r=0.9997)
番泻苷A、B的线性范围均为0.25μg/ml～80μg/ml。
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2.4精密度试验：分别取浓度为2.0、10.0、60.0μg/ml番泻苷A和番泻苷B标准溶液，按上述色谱条件重复进样测定5次，番泻苷A、B的峰面积积分值的相对标准偏差均<2%
<2% 。
2.5样品的测定：取样品6g，经粉碎机打成细粉，取0.1g于具塞三角烧瓶中，精密称定，加水25.0ml，超声提取20min，离心，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，进样。共测定6个批号的样品，表1 肠必清样品含量测定结果
批号
番泻苷A含量(mg/g)*
番泻苷B含量(mg/g)
番泻苷A:B
981012
, 百拇医药
2.84
4.53
1:1.59
981019
2.89
4.62
1:1.60
981103
2.96
4.70
1:1.59
990429
2.78
, 百拇医药
5.02
1:1.80
990504
2.83
4.67
1:1.65
990507
2.72
4.81
1:1.77
每克肠溶颗粒剂中番泻苷A的含量
2.6空白试验：按肠必清肠溶颗粒的处方比例和制备工艺，制备缺番泻叶的阴性对照样品。依2.5项方法测定，结果表明，肠必清肠溶颗粒中其它成分对番泻苷A、B的含量测定没有干扰(见图1B)。
, http://www.100md.com
2.7加样回收试验：取已知含量的肠必清肠溶颗粒细粉，分别加入番泻苷A、B对照品，依2.5项方法测定，5次测定平均回收率为：番泻苷A98.14%(RSD=1.39%)，番泻苷B98.07%(RSD=1.61%)。结果见表2、表3。
表2番泻苷A加样回收实验
编号
取样量(g)
样品含苷泻苷A量(mg)
番泻苷A加入量(mg)
测得量(mg)
回收率*(%)
平均回收率(%)
, 百拇医药
1
0.0926
0.2574
0.5800
0.8217
97.29
2
0.1001
0.2783
0.5800
0.8381
96.52
3
, 百拇医药
0.0957
0.2660
0.5800
0.8468
100.14
98.14%
4
0.0953
0.2649
0.5800
0.8352
98.33
RSD=1.39%
, 百拇医药
5
0.0916
0.2546
0.5800
0.8254
98.41
*回收率=(测得量—样品含番泻苷A量)/番泻苷A加入量×100%
表3番泻苷B加样回收实验
编号
取样量(g)
样品含苷泻苷A量(mg)
番泻苷A加入量(mg)
, 百拇医药
测得量(mg)
回收率*(%)
平均回收率(%)
1
0.0926
0.4649
0.6900
1.1494
99.20
2
0.1001
0.5025
, 百拇医药
0.6900
1.1672
96.33
3
0.0957
0.4804
0.6900
1.1516
97.28
98.07
4
0.0953
0.4784
, http://www.100md.com
0.6900
1.1698
100.20
RSD-1.61%
5
0.0916
0.4598
0.6900
1.1314
97.33
*回收率=(测得量—样品含番泻苷B量)/番泻苷B加入量×100%
2.8稳定性实验：吸取样品溶液，依2.5项方法在不同时间测定。结果表明，样品溶液在24h内稳定。
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3讨论
3.1番泻苷A、B为双蒽酮葡萄糖苷，因分子结构含有羧基而具酸性，羧基可与流动相中的季铵盐形成离子对，使番泻苷A与番泻苷B及番泻苷A、B与其它成分得到较好的分离。微量的醋酸可改善分离效果，而40℃柱温可避免峰拖尾。
3.2本实验证实，水、70%甲醇、甲醇、四氢呋喃等溶媒对番泻苷A、B的色谱行为没有明显影响，但用0.5%碳酸氢钠作提取溶媒，番泻苷A、B峰的保留时间均提前，且两峰合为一峰，因此不宜采用。从经济及环保考虑，我们采用水为提取溶媒。
3.3在提取条件中，旋涡混合2min、水浴回流15min、超声提取20min及超声提取30min，提取效果无显著差异，可能是由于该制剂是由浸膏粉制备而成，番泻苷更易提取。番泻苷A、B的含量测定，由于1次实验的样品数较多，因此采用超声提取20min。
3.4用本文的含量测定方法对番泻叶原料、番泻叶浓缩颗粒(广州一方制药厂，批号980505)、通便灵胶囊(广东环球制药有限公司，批号980201)、番泻叶冲剂(扬州春光制药有限公司，批号970320)及番泻叶糖浆(蚌埠市第七制药厂，批号981112)进行了测定，均获得了满意的效果，可见，本方法也可作为番泻叶及其制剂含量测定的方法。
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安徽省科委“九五”科技攻关项目，项目编号：9613013-3
参考文献：
[1] Stuppner H,Sturm S.LC-MS and CZE of dianthrones from cassia angustifolia and acutifolia[J].Chromatographia,1996,42(11/12):697.
[2] Satoch K,Seto T,Miyatake N,et al.Determination of sennoside A and sennoside B in formulation using capillary electrophoresis[J].Yakugaku Zasshi,1999,119(1):88.
[3] Liao W,Chiu K,Mabuni C,et al.Analysis of sennoside A and B from Dieter's tea by HPLC-diode array spectrophotometry and negative ion electrospray mass spectrometry[J].Bull Environ Contam Toxicol,1998,61(3):317.
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(收稿日期：2000-03-07 修回日期：2000-06-15), 百拇医药