Wilson患者驱铜及抗氧化治疗前后血清中氧化物和抗氧化物水平的研究
作者：张尊胜 杨任民
单位：张尊胜(徐州医学院附属医院神经内科，徐州 221001)；杨任民(安徽中医学院神经病研究所，合肥 230031)
关键词：肝豆状核变性；药物疗法；抗氧化药；治疗应用；自由基；代谢
安徽医科大学学报000407 摘要 目的 研究Wilson病(WD)患者经驱铜及抗氧化剂治疗前后血清氧化物和抗氧化物水平的变化。方法 应用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和化学比色法测定29例WD患者治疗前及两种不同治疗后血清中氧化物和抗氧化物浓度，并把患者组和正常对照组比较以及不同治疗前后比较。结果 与正常对照组比较，WD患者血清氧化物增高，抗氧化物下降，而驱铜及驱铜联合抗氧化剂治疗后，血清氧化物水平下降，抗氧化物水平上升，且后者改变更明显。结论 驱铜治疗能显著改善WD患者血清中自由基的代谢紊乱，而联合应用抗氧化剂后改善更明显。
, 百拇医药
中图分类号 R742.4；R979.9
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0266-03
Study on the serum levels of the oxidants and
the antioxidants in the patients with Wilson's
disease before and after the treatment of
copper-cleaning agents and antioxidants
Zhang Zunsheng, Yang Renmin
, 百拇医药
(Dept of Neurology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221001)
Abstract Objective To study the serum levels of the oxidants and the antioxidants in the patients with Wilsons disease before and after the treatment of copper-cleaning agents and antioxidants. Methods First, the serum levels of the oxidants and the antioxidants in the 29 cases of WD and 21 normal controls were determined by high performance liquid chromatograph(HPLC) and the bichemical color-compared methods. Then, all patients serum levels of oxidants and anti-oxidants after treatment were determined and compared with those before. Results Compared with controls the serum levels of oxidants were increased and the those of antioxidants were decreased in the patients with WD. After treatment of copper-cleaning agents and combined with exogenous antioxidants, the serum levels of oxidants were decreased and the those of antioxidants were increased, but latter changed more significantly. Conclusion Copper-cleaning agents can improve metabolism disorders of FRs, while if with exogenous FRs scavenger it will be better.
, http://www.100md.com
MeSH heptolenticular degeration/drug therapy; antioxidants/therapeutic use; free radicals/metabolism
Wilson病(WD)是以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传性疾病。铜是一种强氧化剂，它在体内各脏器内沉积产生大量的自由基(FRs)，而FRs对体内细胞膜、细胞器、DNA起氧化破坏作用，从而使肝、脑、肾、角膜等受到损伤〔1～5〕。我们研究了WD和正常对照组血清中FRs和抗氧化物水平以及经过驱铜和联合应用抗氧化剂治疗后上述指标的不同变化。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 研究组 1998年6月29日～11月18日安徽中医学神经病研究所住院病人29例，参照杨任民等的诊断标准确诊。男22例，女7例；起病年龄7～34岁，平均16.7岁±6.98岁。
, 百拇医药
1.1.2 正常对照组 21例健康志愿者，为本院大学生和本所工作人员。男性17例，女性4例，平均年龄18.5岁±3.5岁。
1.2 实验方法
1.2.1 取血方法 病人和正常对照组取血2次，治疗前1次，4个疗程结束后1次；均于早晨空腹取静脉血5 ml，立即离心，取血清用1.5 ml试管分装，充氮气后密封放入超低温冰箱中保存待测。
1.2.2 用药方法 29例病人随机分两组治疗：①单纯驱铜组19例：给肝豆片每次4～10片，每日3次；二巯基丙磺硫钠(DMPS)20 mg.kg-1.d-1，每1疗程6天，休息2天，间歇期补充铁、锌、钙。②联合用药组10例：除按上述方法驱铜外，每人加用Vit E 0.1 g每天1次，Vit C 0.2 g每天3次，还原型谷胱甘肽(TAD)0.6 g静脉滴注，每日1次。表1 WD患者治疗前血清MDA、GSH-Px、GSH、Vit E的比较(±s) 组别
, 百拇医药
n
MDA
(μmol.L-1)
GSH-Px
(U.104.L-1)
Vit E
(mg.L-1)
GSH
(mg.L-1)
对照组
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21
5.28±3.19
117.98±32.17
6.19±1.71
211.78±73.60
WD组
29
9.75±2.78
74.40±33.80
4.35±1.68
154.70±55.20
, 百拇医药
与对照组比较：P<0.05,P<0.01表2 单纯驱铜组WD患者治疗前后血清中MDA、GSH-Px、Vit E、GSH的比较(±s，n=19) 组别
MDA
(μmol.L-1)
GSH-Px
(U.104.L-1)
Vit E
(mg.L-1)
GSH
, 百拇医药
(mg.L-1)
疗前组
9.78±2.58
75.0±31.7
4.20±1.50
162.50±53.20
疗后组
7.80±2.20△
96.0±28.0△
5.10±1.52
190.30±61.30
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与治疗前组比较：△P<0.05表3 驱铜剂联合应用抗氧化剂的WD患者治疗前后血清中MDA、GSH-Px、Vit E、GSH的比较(±s,n=10) 组别
MDA
(μmol.L-1)
GSH-Px
(U.104.L-1)
Vit E
(mg.L-1)
GSH
(mg.L-1)
, 百拇医药
疗前组
9.72±2.41
71.8±32.0
4.4±1.7
166.4±57.2
疗后组
6.14±2.39△△
116.0±33.0△△
7.0±2.0△△
230.9±72.0△
与疗前组比较：△P<0.05,△△P<0.011.2.3 指标的选择和测定 我们选定丙二醛(MDA)作为衡量氧化物自由基(FRs)的水平，选定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)及Vit E作为抗氧化物水平的指标。上述指标MDA、GSH-Px、GSH采用化学比色法，按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书步骤进行测试。Vit E的浓度采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定。其标准液的配制、标本的预处理及色谱分析的条件均参考王光亚〔7〕、郑素芳〔8〕的VitE的检测方法，测定结果由Gold System数据处理站自动分析计算。
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1.3 统计及处理方法 数据±s表示，用成组资料、配对资料的t检验方法及直线相关分析。
2 结果
2.1 从表1可以看出治疗前WD患者和正常对照组相比MDA增加84.66%，差异有显著性(P<0.01)；GSH-Px降低36.94%，差异也有显著性(P<0.01)；Vit E下降30%(P<0.05)，GSH下降27%，差异均有显著性(P<0.05)。
2.2 从表2可以看出，在19例单纯肝豆片和DMPS驱铜组患者血清中MDA与疗前比下降了20%，差异有显著性(P<0.05)；GSH-Px值增高了28%，差异也有显著性(P<0.05)；Vit E、GSH的变化无统计学意义，但Vit E及GSH有升高趋势。该组资料提示驱铜治疗降低了FRs水平，提高了GSH-Px酶活力，但VitE、GSH增加无统计学意义。
2.3 从表3实验结果得出，在应用肝豆片和DMPS驱铜的同时联合应用抗氧化剂治疗的10例WD患者治疗前后比较，治疗后血清中MDA下降了37%，差异有显著性(P<0.01)；GSH-Px和Vit E分别增高了61.5%和59%，差异均有显著性(P<0.01)，GSH增加了38.8%，差异有显著性(P<0.05)。上述结果提示，驱铜剂联合应用抗氧化剂治疗WD使血清中FRs水平下降更显著，使抗氧化物水平进一步提高。
, 百拇医药
3 讨论
WD是少数可治的遗传病之一，主要致病原因可能是：铜在体内肝、脑、肾、角膜等重要脏器内沉积从而引起大量FRs产生而造成人体多脏器的损伤。目前临床治疗主要是以排铜为主结合对症处理。我们采用肝豆片及DMPS进行排铜，其治疗疗效较好〔6，9〕。
WD患者经过长期驱铜治疗，多数患者可以得到缓解，病情稳定。如表2所示，19例WD患者予肝豆片及DMPS进行驱铜治疗4个疗程，血清中MDA水平明显下降(P<0.05)，GSH-Px明显升高(P<0.05)。日本学者Ogihara等〔3〕也做了类似的研究，他们研究了4例未经治疗的WD患者，予青霉胺治疗，疗后发现有3例血浆中抗氧化剂Vit C、尿酸盐水平较治疗前明显升高，而尿囊素(一种尿酸的氧化物，是体内一种FR标志)的血浆水平下降，血浆中游离铜也检测不到。上述研究表明，经过驱铜治疗，体内铜(尤其是游离铜)逐渐减少，FRs的水平下降，抗氧化物水平在回升。我们同时进行了另一组研究：取10例WD患者在肝豆片、DMPS驱铜的同时，联合应用外源性抗氧化剂(Vit E、Vit C、TAD)治疗(表3)，治疗后MDA水平下降(P<0.01)，GSH-Px上升(P<0.01)。这表明加用抗氧化剂治疗，能使体内FRs下降更快、更显著，抗氧化物酶恢复更快，能更好地纠正体内FRs的代谢紊乱，这可能对损伤脏器的恢复和稳定起重要作用，尤其是伴有肝功能异常及黄疸的患者更为有益。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(课题号为：39570807)
作者简介：张尊胜，男，35岁，硕士；
杨任民，男，70岁，教授
参考文献
1，Konstantin PE, Svetlana LU, Lgor CH et al. Characterization of the Wilson disease gene encoding a P-type copper transporting ATPase: genomic organization, alternative splicing, and structure/function pretictions. Human Molecular Genatics, 1994;3(9):1 647～1 656
, 百拇医药
2，Del Maedtro RF. Free radical as mediators of tissue injury. Acta Physical Scan, 1980;492(Suppl):59
3，Ogihara H, Ogihara T, Miki M et al. Plasma copper and antioxidant status in Wilsons disease. Pediatr Res, 1995;37(2):219
4，Von Herbay A, De Groot H, Hegi U et al. Low vitamin E content in plasma of patient with alcoholic liver disease, hemochromatosis and Wilsondisease. J Hepatol, 1994;20(1):41
, http://www.100md.com
5，Abdellah M, Isabelle G, Bernard F et al. Premature oxidative aging of hepatic mitochondrial DNA in Wilson disease. Gastroenterology, 1997;113(5):599～605
6，杨任民. 肝豆状核变性. 第1版， 合肥：安徽科学技术出版社， 1995：183～188
7，王光亚，叶晓敏，陈君石. 高效液相色谱法测定血浆中视黄醇和α-生育酚. 营养学报， 1988；10(3)：272
8，郑素芬，李辉，孙玉海. 高压液相色谱法同时测定血浆中视黄醇和α-生育酚. 营养学报， 1985；7(1)：61
9，陈松林， 杨任民. 二巯基丙磺酸钠对肝豆状核变性临床疗效及相关元素影响的研究. 临床神经病学杂志， 1999；12(3)：181
2000-03-22收稿，2000-06-01修回, http://www.100md.com
单位：张尊胜(徐州医学院附属医院神经内科，徐州 221001)；杨任民(安徽中医学院神经病研究所，合肥 230031)
关键词：肝豆状核变性；药物疗法；抗氧化药；治疗应用；自由基；代谢
安徽医科大学学报000407 摘要 目的 研究Wilson病(WD)患者经驱铜及抗氧化剂治疗前后血清氧化物和抗氧化物水平的变化。方法 应用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和化学比色法测定29例WD患者治疗前及两种不同治疗后血清中氧化物和抗氧化物浓度，并把患者组和正常对照组比较以及不同治疗前后比较。结果 与正常对照组比较，WD患者血清氧化物增高，抗氧化物下降，而驱铜及驱铜联合抗氧化剂治疗后，血清氧化物水平下降，抗氧化物水平上升，且后者改变更明显。结论 驱铜治疗能显著改善WD患者血清中自由基的代谢紊乱，而联合应用抗氧化剂后改善更明显。
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中图分类号 R742.4；R979.9
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0266-03
Study on the serum levels of the oxidants and
the antioxidants in the patients with Wilson's
disease before and after the treatment of
copper-cleaning agents and antioxidants
Zhang Zunsheng, Yang Renmin
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(Dept of Neurology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221001)
Abstract Objective To study the serum levels of the oxidants and the antioxidants in the patients with Wilsons disease before and after the treatment of copper-cleaning agents and antioxidants. Methods First, the serum levels of the oxidants and the antioxidants in the 29 cases of WD and 21 normal controls were determined by high performance liquid chromatograph(HPLC) and the bichemical color-compared methods. Then, all patients serum levels of oxidants and anti-oxidants after treatment were determined and compared with those before. Results Compared with controls the serum levels of oxidants were increased and the those of antioxidants were decreased in the patients with WD. After treatment of copper-cleaning agents and combined with exogenous antioxidants, the serum levels of oxidants were decreased and the those of antioxidants were increased, but latter changed more significantly. Conclusion Copper-cleaning agents can improve metabolism disorders of FRs, while if with exogenous FRs scavenger it will be better.
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MeSH heptolenticular degeration/drug therapy; antioxidants/therapeutic use; free radicals/metabolism
Wilson病(WD)是以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传性疾病。铜是一种强氧化剂，它在体内各脏器内沉积产生大量的自由基(FRs)，而FRs对体内细胞膜、细胞器、DNA起氧化破坏作用，从而使肝、脑、肾、角膜等受到损伤〔1～5〕。我们研究了WD和正常对照组血清中FRs和抗氧化物水平以及经过驱铜和联合应用抗氧化剂治疗后上述指标的不同变化。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 研究组 1998年6月29日～11月18日安徽中医学神经病研究所住院病人29例，参照杨任民等的诊断标准确诊。男22例，女7例；起病年龄7～34岁，平均16.7岁±6.98岁。
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1.1.2 正常对照组 21例健康志愿者，为本院大学生和本所工作人员。男性17例，女性4例，平均年龄18.5岁±3.5岁。
1.2 实验方法
1.2.1 取血方法 病人和正常对照组取血2次，治疗前1次，4个疗程结束后1次；均于早晨空腹取静脉血5 ml，立即离心，取血清用1.5 ml试管分装，充氮气后密封放入超低温冰箱中保存待测。
1.2.2 用药方法 29例病人随机分两组治疗：①单纯驱铜组19例：给肝豆片每次4～10片，每日3次；二巯基丙磺硫钠(DMPS)20 mg.kg-1.d-1，每1疗程6天，休息2天，间歇期补充铁、锌、钙。②联合用药组10例：除按上述方法驱铜外，每人加用Vit E 0.1 g每天1次，Vit C 0.2 g每天3次，还原型谷胱甘肽(TAD)0.6 g静脉滴注，每日1次。表1 WD患者治疗前血清MDA、GSH-Px、GSH、Vit E的比较(±s) 组别
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n
MDA
(μmol.L-1)
GSH-Px
(U.104.L-1)
Vit E
(mg.L-1)
GSH
(mg.L-1)
对照组
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21
5.28±3.19
117.98±32.17
6.19±1.71
211.78±73.60
WD组
29
9.75±2.78
74.40±33.80
4.35±1.68
154.70±55.20
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与对照组比较：P<0.05,P<0.01表2 单纯驱铜组WD患者治疗前后血清中MDA、GSH-Px、Vit E、GSH的比较(±s，n=19) 组别
MDA
(μmol.L-1)
GSH-Px
(U.104.L-1)
Vit E
(mg.L-1)
GSH
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(mg.L-1)
疗前组
9.78±2.58
75.0±31.7
4.20±1.50
162.50±53.20
疗后组
7.80±2.20△
96.0±28.0△
5.10±1.52
190.30±61.30
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与治疗前组比较：△P<0.05表3 驱铜剂联合应用抗氧化剂的WD患者治疗前后血清中MDA、GSH-Px、Vit E、GSH的比较(±s,n=10) 组别
MDA
(μmol.L-1)
GSH-Px
(U.104.L-1)
Vit E
(mg.L-1)
GSH
(mg.L-1)
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疗前组
9.72±2.41
71.8±32.0
4.4±1.7
166.4±57.2
疗后组
6.14±2.39△△
116.0±33.0△△
7.0±2.0△△
230.9±72.0△
与疗前组比较：△P<0.05,△△P<0.011.2.3 指标的选择和测定 我们选定丙二醛(MDA)作为衡量氧化物自由基(FRs)的水平，选定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)及Vit E作为抗氧化物水平的指标。上述指标MDA、GSH-Px、GSH采用化学比色法，按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书步骤进行测试。Vit E的浓度采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定。其标准液的配制、标本的预处理及色谱分析的条件均参考王光亚〔7〕、郑素芳〔8〕的VitE的检测方法，测定结果由Gold System数据处理站自动分析计算。
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1.3 统计及处理方法 数据±s表示，用成组资料、配对资料的t检验方法及直线相关分析。
2 结果
2.1 从表1可以看出治疗前WD患者和正常对照组相比MDA增加84.66%，差异有显著性(P<0.01)；GSH-Px降低36.94%，差异也有显著性(P<0.01)；Vit E下降30%(P<0.05)，GSH下降27%，差异均有显著性(P<0.05)。
2.2 从表2可以看出，在19例单纯肝豆片和DMPS驱铜组患者血清中MDA与疗前比下降了20%，差异有显著性(P<0.05)；GSH-Px值增高了28%，差异也有显著性(P<0.05)；Vit E、GSH的变化无统计学意义，但Vit E及GSH有升高趋势。该组资料提示驱铜治疗降低了FRs水平，提高了GSH-Px酶活力，但VitE、GSH增加无统计学意义。
2.3 从表3实验结果得出，在应用肝豆片和DMPS驱铜的同时联合应用抗氧化剂治疗的10例WD患者治疗前后比较，治疗后血清中MDA下降了37%，差异有显著性(P<0.01)；GSH-Px和Vit E分别增高了61.5%和59%，差异均有显著性(P<0.01)，GSH增加了38.8%，差异有显著性(P<0.05)。上述结果提示，驱铜剂联合应用抗氧化剂治疗WD使血清中FRs水平下降更显著，使抗氧化物水平进一步提高。
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3 讨论
WD是少数可治的遗传病之一，主要致病原因可能是：铜在体内肝、脑、肾、角膜等重要脏器内沉积从而引起大量FRs产生而造成人体多脏器的损伤。目前临床治疗主要是以排铜为主结合对症处理。我们采用肝豆片及DMPS进行排铜，其治疗疗效较好〔6，9〕。
WD患者经过长期驱铜治疗，多数患者可以得到缓解，病情稳定。如表2所示，19例WD患者予肝豆片及DMPS进行驱铜治疗4个疗程，血清中MDA水平明显下降(P<0.05)，GSH-Px明显升高(P<0.05)。日本学者Ogihara等〔3〕也做了类似的研究，他们研究了4例未经治疗的WD患者，予青霉胺治疗，疗后发现有3例血浆中抗氧化剂Vit C、尿酸盐水平较治疗前明显升高，而尿囊素(一种尿酸的氧化物，是体内一种FR标志)的血浆水平下降，血浆中游离铜也检测不到。上述研究表明，经过驱铜治疗，体内铜(尤其是游离铜)逐渐减少，FRs的水平下降，抗氧化物水平在回升。我们同时进行了另一组研究：取10例WD患者在肝豆片、DMPS驱铜的同时，联合应用外源性抗氧化剂(Vit E、Vit C、TAD)治疗(表3)，治疗后MDA水平下降(P<0.01)，GSH-Px上升(P<0.01)。这表明加用抗氧化剂治疗，能使体内FRs下降更快、更显著，抗氧化物酶恢复更快，能更好地纠正体内FRs的代谢紊乱，这可能对损伤脏器的恢复和稳定起重要作用，尤其是伴有肝功能异常及黄疸的患者更为有益。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(课题号为：39570807)
作者简介：张尊胜，男，35岁，硕士；
杨任民，男，70岁，教授
参考文献
1，Konstantin PE, Svetlana LU, Lgor CH et al. Characterization of the Wilson disease gene encoding a P-type copper transporting ATPase: genomic organization, alternative splicing, and structure/function pretictions. Human Molecular Genatics, 1994;3(9):1 647～1 656
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2，Del Maedtro RF. Free radical as mediators of tissue injury. Acta Physical Scan, 1980;492(Suppl):59
3，Ogihara H, Ogihara T, Miki M et al. Plasma copper and antioxidant status in Wilsons disease. Pediatr Res, 1995;37(2):219
4，Von Herbay A, De Groot H, Hegi U et al. Low vitamin E content in plasma of patient with alcoholic liver disease, hemochromatosis and Wilsondisease. J Hepatol, 1994;20(1):41
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5，Abdellah M, Isabelle G, Bernard F et al. Premature oxidative aging of hepatic mitochondrial DNA in Wilson disease. Gastroenterology, 1997;113(5):599～605
6，杨任民. 肝豆状核变性. 第1版， 合肥：安徽科学技术出版社， 1995：183～188
7，王光亚，叶晓敏，陈君石. 高效液相色谱法测定血浆中视黄醇和α-生育酚. 营养学报， 1988；10(3)：272
8，郑素芬，李辉，孙玉海. 高压液相色谱法同时测定血浆中视黄醇和α-生育酚. 营养学报， 1985；7(1)：61
9，陈松林， 杨任民. 二巯基丙磺酸钠对肝豆状核变性临床疗效及相关元素影响的研究. 临床神经病学杂志， 1999；12(3)：181
2000-03-22收稿，2000-06-01修回, http://www.100md.com