大部分肝切除后肝细胞生长因子和增殖细胞核抗原作用的研究
作者：唐望先 王俊平 杜荔菁 张文英 杨镇
单位：唐望先 王俊平 杜荔菁 张文英 杨镇(外科,)(同济医科大学附属同济医院 肝病研究所 武汉 430030)
关键词：肝细胞生长因子；肝切除术；增殖细胞核抗原；免疫组织化学
同济医科大学学报000412 摘要 为了探讨肝切除后肝细胞生长因子(HGF)及增 殖细胞核抗原(PCNA)在肝再生中的作用，制备大鼠肝切除后肝再生模型，应用免疫印迹法 及免疫组织化学染色分别检测HGF的分子形式及PCNA的表达。结果发现：HGF在肝切除后残存 的肝组织中的含量在12 h显著增加，是正常的14倍。增加的水平维持到24 h。但HGF的重链 带低于检测水平。PCNA在肝切除后残存的肝组织中的表达明显升高，于术后24 h达高峰。阳 性细胞高达54%。提示HGF在肝再生中的作用是微不足道的，而PCNA可以作为一种肝细胞增生 的指标。
, 百拇医药
中图法分类号 R657.3， R392.11， R392.31
Study on the Role of Hepatocyte Growth f actor and Proliferating Cell
Nuclear Antigen Following Partial Hepatectomy
Tang Wangxian Wang Junping u Lijing et al
Abstract The role of hepatocyte growth factor (HGF) and prolife rating cell nuclear antigen (PCNA) in liver regeneration after partial hepatecto my was studied. The model was established by partial hepatectomy. The molecular form of HGF and the expression of PCNA was determined by using immunobloting and immunohistochemical methods, respectively. The results showed that amount of HG F after partial hepatectomy was progressively increased at the first 12 h with t he maximum level being about 14-fold higher than that of the normal rat liver a nd main tained up to at least 24 h. The band corresponding to the heavy chain of HGF was lower than the detectable level. The expression of PCNA was increased in remnan t liver tissue and reached the highest peak 24 h after partial hepatectomy. The percentage of positive cells was as high as 54 %. It was concluded that HGF migh t play a slight role in liver regeneration and PCNA could be used as an importa nt index of cell regeneration in liver regeneration after partial hepatectomy.
, 百拇医药
Key words hepatocyte growth factor; partial hepatectomy; prol iferating cell nuclear antigen
肝细胞再生的研究是目前生物医学领域中的一个重要课题。而肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor ，HGF)在肝切除中是否起重要作用有待进一步研究，本实验采用免疫印迹 分析法测定肝切除后不同时间HGF的分子形式，并采用免疫组织化学ABC法，通过对部分肝切 除后不同时间的冰冻新鲜肝组织的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen )表达来观察肝细胞再生的情况。
1 材料与方法
1.1 试剂
6-氮基-2-萘-对胍苯基二甲基磺酸盐(NM)购自Toril公司，苯*****(PMSF)和 乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸盐(CHAPS)购自Sigma公司。Sp-Sepharose购自LKB生物技术中 心，HGF单克隆抗体由日本三菱公司提供。增殖细胞核抗原试剂盒由北京邦定生物医学公司 提供。
, 百拇医药
1.2 实验动物、分组及手术
本研究所有实验采用Wistar大鼠(同济医科大学实验动物学部提供)，体重在220～250 g，随 机分成2大组，即手术组和假手术组，各组包括正常、3、6、12及24 h。实验组按Higgins和 Anderson方法改良行肝大部分切除术。3%戊巴比妥钠麻醉(30 mg/Kg)后，上腹正中切口， 切除肝脏的中叶和左叶，关上腹腔。假手术组仅切开腹壁，然后关上腹腔。分别于手术后3 、6、12及24 h再次麻醉，下腔静脉抽血，取残存肝组织作相应的测定。
1.3 HGF分子形式的测定
1.3.1 大鼠组织中HGF粗提物的制备：根据Miyazawa所介绍的方法稍加改良。不同时间肝组织进行匀浆。每份标本加有4倍量含有Tris-HCl缓冲液(0.15mol/LNaCl,10mol/LEDTA，100mol/LNM,1mmol/LPMSF)。然后在4℃条件下，15000r/min中离心20min，上清4℃条件下，再次30000r/min中离心60min，80～150mg蛋白悬液用含有1ml/LChaps，0.15mol/LNaCl以及100μmol/LTris-HCl平衡。用0.15mol/LNaCl3ml以及0.4mol/LNaCl缓冲液8ml洗柱，用0.65mol/LNaCl缓冲液3ml提取HGF，提取液用浓缩器浓缩。最后的提取液补充4倍量pH6.8的含有0.1%ChapsTris-HCl。
, 百拇医药
1.3.2 免疫印迹分析：采用Laemmli法分析样品，经过7.5%的SDS-PAGE电泳后，蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜上。膜与单克隆抗体共孵育2h，然后再与辣根过氧化物酶标记的抗体孵育2h，随后加ECL检测试剂。在X光片上爆光，结果用密度检测仪检测。
1.4 PCNA的检测
PCNA的免疫组织化学ABC法实验步骤：①取新鲜肝组织作冰冻切片，切片置于预先用poly-L-lysine处理过的载玻片上，丙酮固定10min。电吹风吹干备用；②3g/LH2O2封闭内源性过氧化物酶，室温，30min；③PBS(0.01mol/LpH7.4)振洗2min×3；④加入鼠抗PCNA单抗(1∶50)，湿盒中，37℃孵育2h。⑤PBS振洗2min×3；⑥加生物素羊抗鼠抗体，湿盒中，37℃60min；⑦加预先混合的ABC复合物，湿盒中，37℃20min；⑧加入临时配制的DAB显色液，显微镜下观察显色；⑨苏木素复染后，80、90、95ml/L酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
, http://www.100md.com
实验结果判定：PCNA阳性染色呈棕黄色颗粒，主要分布在肝细胞核内。在显微镜下随机观察10个视野/只大鼠，100个细胞/个视野。按下列公式计算PCNA的指数：
PCNA指数=染色阳性细胞数×100%全部肝细胞数
2 结果
2.1 手术后不同时间的残存肝组织中HGF的分子形式
与正常组相比，假手术组HGF的含量增加约两倍，但肝切除12h后，HGF的含量显著增加，是正常的14倍，含量增加维持到24h。但HGF的重链带低于检测水平，无水解活性。给予CCl4后的肝组织中的HGF作为阳性对照，可检测到有水解活性，见图1。
图1 肝大部分切除后不同时间残存肝组织的HGF形式的变化
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N=正常 S=假手术 PH=肝大部分切除 CCl4=阳性对照
2.2 手术后不同时间的残存肝组织的PCNA免疫组织化学 染色 在术前大鼠肝组织内见少量的PCNA染色，但肝切除后12h肝组织内PCNA染色明显增多，24h达高峰。PCNA指数结果见图2。
图2 肝大部分切除后不同时间残存肝组织的PCNA指数的变化
3 讨论
HGF对体外上皮细胞具有广泛的生物学作用。在胚胎期和成熟期的许多组织均有HGF基因及其 受体的表达。但是，体内HGF的生理学作用仍然未完全了解。以往的研究表明，在正常的情 况下HGF在组织中以无活性的形式存在。无活性的HGF必须经蛋白水解后才能发挥其生物活性 。因此，阐明此种蛋白水解激活系统对了解HGF的生理作用具有重要意义。Miyazawa等证实 了一种来自人血清的新型丝氨酸蛋白酶，后者使单链形式的HGF激活。他们把这种蛋白酶视 为HGF的激活剂。因此，HGF的激活需要首先诱导出激活剂活性。HGF的激活剂首先是作为一种无活性的酶原而产生的，这种酶原通过蛋白水解剪切而激活。凝血酶可能有这种激活作用。由CCl4所致肝损伤级联反应可能导致HGF的激活。而激活后的凝血 酶再将酶原形式的HGF激活剂转换成有活性的形式。与HGF激活有关的丝氨酸蛋白酶活性仅仅 存 在于损伤的肝脏中。肝再生时，激活的HGF对肝细胞可能发挥一种丝裂原性生理作用。本研 究为了探讨HGF在部分肝切除后的肝再生中的作用，检测了手术后不同时间肝组织中HGF 的分子形式及含量。结果表明：虽然HGF的含量在术后12 h显著增加，是正常的14倍，但活 性形式HGF的重链带低于检测的水平。因此，HGF在组织切除后的肝再生反应中的作用是微不 足道的。
, 百拇医药
另有研究表明，在部分肝切除后的肝再生和单侧肾切除后残存的代偿性肥大中，HGF受体下 调。不过本研究表明，HGF在肝组织中仍然是以无活性的形式存在。因此，HGF下调不是HGF 结合的结果。由于一种生长因子受体的下调可以是另外一种生长因子作用的结果，因此，HG F的下调可能受到了除HGF之外的一种或多种生长因子的调节(与肝再生有关者)。
增殖细胞核抗原是DNA多聚酶的辅助蛋白，其合成与DNA的复制和细胞的增殖有着直接的关系 。因此，肝脏PCNA的表达可以反映出肝细胞内DNA的合成及肝细胞增生的活性。我们通过对P CNA的免疫组化检测来观察肝细胞再生的情况。结果发现，在手术后12 h即有PCNA表达的升 高，于术后24 h达到高峰。提示PCNA可以作为一种肝细胞增生的指标。
肝细胞再生过程是错综复杂的，它包括再生启动和再生停止两个方面，这两个方面的完成依赖于肝组织(包括肝细胞、肝间质及细胞外基质)及某些肝外组织来源的因子和营养物质的相互作用。参与调节的激素亦是众多的，其中EGF、胰岛素和胰高糖素对培养肝细胞起直接的调控作用，但其作用的机制还有待进一步研究。
, 百拇医药
国家教委回国人员基金资助项目 [教外司留(No. 1995-135)]
唐望先，女，1953年生，主任技师
参 考 文 献
1，Miyazawa K, Shimomura T, Naka D et al. Proteolytic activation of hepatocyte growth ractor in response to tissue injury. J Biol, Chem, 1994,269:8 966
2，Okajima A, Miyazawa K, Kitamura N. Primary structure of rat hepatocy te growth factor and induction of its mRNA during liver regeneration following h epatic injury. Eur J Biol Chem, 1990,193:375
, http://www.100md.com
3，Tashiro K, Hagiya M Nishizaqa T et al. Deduced primary structure of rat hepatocyte growth factor and expression of the mRNA in the tissue.Proc N atl Acad Sci USA, 1990,87:3200
4，Sonnenberg E, Meye D, Weidne K M et al.Scatterfactor/hepatocyte grow th factor and its receptor, the c-met tyrosine kinase, can mediate a signal exc hange between mesenchyme and epithelia during mouse development. J Cell Biol, 19 93,123:223
5，Miyazawa K, Shimomura T, Kitamura A et al. Molecular cloning an d sequence analysis of the cDNA for a human serine protease responsible for acti vation of hepatocyte growth factor. J Biol. Chem, 1993,268:10024
, http://www.100md.com
6，Tajima H, Higuchi O, Mizuno K et al. Tissue distribution of hepa tocyte growth factor and its exclusive down-regulation in a regenerating organ after injury. J Biochem, 1992,111:401
7，Chijiiwa K, Nakano K, Kameoka N et al. Proliferating cell nuclea r antigen, Plasma fibronectin and liver regeneration rate after seventy percent hepatectomy in normal and cirrhotic rats. Surgery, 1994,116:544
8，Bucher N L R. Liver regeneration: A overview. J Gastroenterol Hepato logy, 1991,6: 615
(1999-07-06 收稿), http://www.100md.com
单位：唐望先 王俊平 杜荔菁 张文英 杨镇(外科,)(同济医科大学附属同济医院 肝病研究所 武汉 430030)
关键词：肝细胞生长因子；肝切除术；增殖细胞核抗原；免疫组织化学
同济医科大学学报000412 摘要 为了探讨肝切除后肝细胞生长因子(HGF)及增 殖细胞核抗原(PCNA)在肝再生中的作用，制备大鼠肝切除后肝再生模型，应用免疫印迹法 及免疫组织化学染色分别检测HGF的分子形式及PCNA的表达。结果发现：HGF在肝切除后残存 的肝组织中的含量在12 h显著增加，是正常的14倍。增加的水平维持到24 h。但HGF的重链 带低于检测水平。PCNA在肝切除后残存的肝组织中的表达明显升高，于术后24 h达高峰。阳 性细胞高达54%。提示HGF在肝再生中的作用是微不足道的，而PCNA可以作为一种肝细胞增生 的指标。
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中图法分类号 R657.3， R392.11， R392.31
Study on the Role of Hepatocyte Growth f actor and Proliferating Cell
Nuclear Antigen Following Partial Hepatectomy
Tang Wangxian Wang Junping u Lijing et al
Abstract The role of hepatocyte growth factor (HGF) and prolife rating cell nuclear antigen (PCNA) in liver regeneration after partial hepatecto my was studied. The model was established by partial hepatectomy. The molecular form of HGF and the expression of PCNA was determined by using immunobloting and immunohistochemical methods, respectively. The results showed that amount of HG F after partial hepatectomy was progressively increased at the first 12 h with t he maximum level being about 14-fold higher than that of the normal rat liver a nd main tained up to at least 24 h. The band corresponding to the heavy chain of HGF was lower than the detectable level. The expression of PCNA was increased in remnan t liver tissue and reached the highest peak 24 h after partial hepatectomy. The percentage of positive cells was as high as 54 %. It was concluded that HGF migh t play a slight role in liver regeneration and PCNA could be used as an importa nt index of cell regeneration in liver regeneration after partial hepatectomy.
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Key words hepatocyte growth factor; partial hepatectomy; prol iferating cell nuclear antigen
肝细胞再生的研究是目前生物医学领域中的一个重要课题。而肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor ，HGF)在肝切除中是否起重要作用有待进一步研究，本实验采用免疫印迹 分析法测定肝切除后不同时间HGF的分子形式，并采用免疫组织化学ABC法，通过对部分肝切 除后不同时间的冰冻新鲜肝组织的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen )表达来观察肝细胞再生的情况。
1 材料与方法
1.1 试剂
6-氮基-2-萘-对胍苯基二甲基磺酸盐(NM)购自Toril公司，苯*****(PMSF)和 乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸盐(CHAPS)购自Sigma公司。Sp-Sepharose购自LKB生物技术中 心，HGF单克隆抗体由日本三菱公司提供。增殖细胞核抗原试剂盒由北京邦定生物医学公司 提供。
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1.2 实验动物、分组及手术
本研究所有实验采用Wistar大鼠(同济医科大学实验动物学部提供)，体重在220～250 g，随 机分成2大组，即手术组和假手术组，各组包括正常、3、6、12及24 h。实验组按Higgins和 Anderson方法改良行肝大部分切除术。3%戊巴比妥钠麻醉(30 mg/Kg)后，上腹正中切口， 切除肝脏的中叶和左叶，关上腹腔。假手术组仅切开腹壁，然后关上腹腔。分别于手术后3 、6、12及24 h再次麻醉，下腔静脉抽血，取残存肝组织作相应的测定。
1.3 HGF分子形式的测定
1.3.1 大鼠组织中HGF粗提物的制备：根据Miyazawa所介绍的方法稍加改良。不同时间肝组织进行匀浆。每份标本加有4倍量含有Tris-HCl缓冲液(0.15mol/LNaCl,10mol/LEDTA，100mol/LNM,1mmol/LPMSF)。然后在4℃条件下，15000r/min中离心20min，上清4℃条件下，再次30000r/min中离心60min，80～150mg蛋白悬液用含有1ml/LChaps，0.15mol/LNaCl以及100μmol/LTris-HCl平衡。用0.15mol/LNaCl3ml以及0.4mol/LNaCl缓冲液8ml洗柱，用0.65mol/LNaCl缓冲液3ml提取HGF，提取液用浓缩器浓缩。最后的提取液补充4倍量pH6.8的含有0.1%ChapsTris-HCl。
, 百拇医药
1.3.2 免疫印迹分析：采用Laemmli法分析样品，经过7.5%的SDS-PAGE电泳后，蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜上。膜与单克隆抗体共孵育2h，然后再与辣根过氧化物酶标记的抗体孵育2h，随后加ECL检测试剂。在X光片上爆光，结果用密度检测仪检测。
1.4 PCNA的检测
PCNA的免疫组织化学ABC法实验步骤：①取新鲜肝组织作冰冻切片，切片置于预先用poly-L-lysine处理过的载玻片上，丙酮固定10min。电吹风吹干备用；②3g/LH2O2封闭内源性过氧化物酶，室温，30min；③PBS(0.01mol/LpH7.4)振洗2min×3；④加入鼠抗PCNA单抗(1∶50)，湿盒中，37℃孵育2h。⑤PBS振洗2min×3；⑥加生物素羊抗鼠抗体，湿盒中，37℃60min；⑦加预先混合的ABC复合物，湿盒中，37℃20min；⑧加入临时配制的DAB显色液，显微镜下观察显色；⑨苏木素复染后，80、90、95ml/L酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
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实验结果判定：PCNA阳性染色呈棕黄色颗粒，主要分布在肝细胞核内。在显微镜下随机观察10个视野/只大鼠，100个细胞/个视野。按下列公式计算PCNA的指数：
PCNA指数=染色阳性细胞数×100%全部肝细胞数
2 结果
2.1 手术后不同时间的残存肝组织中HGF的分子形式
与正常组相比，假手术组HGF的含量增加约两倍，但肝切除12h后，HGF的含量显著增加，是正常的14倍，含量增加维持到24h。但HGF的重链带低于检测水平，无水解活性。给予CCl4后的肝组织中的HGF作为阳性对照，可检测到有水解活性，见图1。
图1 肝大部分切除后不同时间残存肝组织的HGF形式的变化
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N=正常 S=假手术 PH=肝大部分切除 CCl4=阳性对照
2.2 手术后不同时间的残存肝组织的PCNA免疫组织化学 染色 在术前大鼠肝组织内见少量的PCNA染色，但肝切除后12h肝组织内PCNA染色明显增多，24h达高峰。PCNA指数结果见图2。
图2 肝大部分切除后不同时间残存肝组织的PCNA指数的变化
3 讨论
HGF对体外上皮细胞具有广泛的生物学作用。在胚胎期和成熟期的许多组织均有HGF基因及其 受体的表达。但是，体内HGF的生理学作用仍然未完全了解。以往的研究表明，在正常的情 况下HGF在组织中以无活性的形式存在。无活性的HGF必须经蛋白水解后才能发挥其生物活性 。因此，阐明此种蛋白水解激活系统对了解HGF的生理作用具有重要意义。Miyazawa等证实 了一种来自人血清的新型丝氨酸蛋白酶，后者使单链形式的HGF激活。他们把这种蛋白酶视 为HGF的激活剂。因此，HGF的激活需要首先诱导出激活剂活性。HGF的激活剂首先是作为一种无活性的酶原而产生的，这种酶原通过蛋白水解剪切而激活。凝血酶可能有这种激活作用。由CCl4所致肝损伤级联反应可能导致HGF的激活。而激活后的凝血 酶再将酶原形式的HGF激活剂转换成有活性的形式。与HGF激活有关的丝氨酸蛋白酶活性仅仅 存 在于损伤的肝脏中。肝再生时，激活的HGF对肝细胞可能发挥一种丝裂原性生理作用。本研 究为了探讨HGF在部分肝切除后的肝再生中的作用，检测了手术后不同时间肝组织中HGF 的分子形式及含量。结果表明：虽然HGF的含量在术后12 h显著增加，是正常的14倍，但活 性形式HGF的重链带低于检测的水平。因此，HGF在组织切除后的肝再生反应中的作用是微不 足道的。
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另有研究表明，在部分肝切除后的肝再生和单侧肾切除后残存的代偿性肥大中，HGF受体下 调。不过本研究表明，HGF在肝组织中仍然是以无活性的形式存在。因此，HGF下调不是HGF 结合的结果。由于一种生长因子受体的下调可以是另外一种生长因子作用的结果，因此，HG F的下调可能受到了除HGF之外的一种或多种生长因子的调节(与肝再生有关者)。
增殖细胞核抗原是DNA多聚酶的辅助蛋白，其合成与DNA的复制和细胞的增殖有着直接的关系 。因此，肝脏PCNA的表达可以反映出肝细胞内DNA的合成及肝细胞增生的活性。我们通过对P CNA的免疫组化检测来观察肝细胞再生的情况。结果发现，在手术后12 h即有PCNA表达的升 高，于术后24 h达到高峰。提示PCNA可以作为一种肝细胞增生的指标。
肝细胞再生过程是错综复杂的，它包括再生启动和再生停止两个方面，这两个方面的完成依赖于肝组织(包括肝细胞、肝间质及细胞外基质)及某些肝外组织来源的因子和营养物质的相互作用。参与调节的激素亦是众多的，其中EGF、胰岛素和胰高糖素对培养肝细胞起直接的调控作用，但其作用的机制还有待进一步研究。
, 百拇医药
国家教委回国人员基金资助项目 [教外司留(No. 1995-135)]
唐望先，女，1953年生，主任技师
参 考 文 献
1，Miyazawa K, Shimomura T, Naka D et al. Proteolytic activation of hepatocyte growth ractor in response to tissue injury. J Biol, Chem, 1994,269:8 966
2，Okajima A, Miyazawa K, Kitamura N. Primary structure of rat hepatocy te growth factor and induction of its mRNA during liver regeneration following h epatic injury. Eur J Biol Chem, 1990,193:375
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3，Tashiro K, Hagiya M Nishizaqa T et al. Deduced primary structure of rat hepatocyte growth factor and expression of the mRNA in the tissue.Proc N atl Acad Sci USA, 1990,87:3200
4，Sonnenberg E, Meye D, Weidne K M et al.Scatterfactor/hepatocyte grow th factor and its receptor, the c-met tyrosine kinase, can mediate a signal exc hange between mesenchyme and epithelia during mouse development. J Cell Biol, 19 93,123:223
5，Miyazawa K, Shimomura T, Kitamura A et al. Molecular cloning an d sequence analysis of the cDNA for a human serine protease responsible for acti vation of hepatocyte growth factor. J Biol. Chem, 1993,268:10024
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6，Tajima H, Higuchi O, Mizuno K et al. Tissue distribution of hepa tocyte growth factor and its exclusive down-regulation in a regenerating organ after injury. J Biochem, 1992,111:401
7，Chijiiwa K, Nakano K, Kameoka N et al. Proliferating cell nuclea r antigen, Plasma fibronectin and liver regeneration rate after seventy percent hepatectomy in normal and cirrhotic rats. Surgery, 1994,116:544
8，Bucher N L R. Liver regeneration: A overview. J Gastroenterol Hepato logy, 1991,6: 615
(1999-07-06 收稿), http://www.100md.com