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您的位置：首页>>动态>>医学进展 癌症1999年第18卷第6期
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维甲酸对HeLa细胞间隙连接蛋白基因cx43表达的调节作用
陈必良 马向东 王德堂 辛晓燕
摘 要 目的：探讨分化诱导剂维甲酸对肿瘤抑制基因--细胞间隙连接蛋白基因cx43在人子宫颈癌细胞系HeLa中表达的调节作用。方法：应用核酸原位杂交、流式细胞仪、Westen blot及Lucifer Yellow划痕标记荧光传输技术，研究维甲酸作用对HeLa细胞cx43 mRNA及其蛋白表达，以及对HeLa细胞生长和通讯功能的调节作用。结果：HeLa细胞经维甲酸处理后，原位杂交显示，HeLa细胞cx43 mRNA水平上调；流式细胞仪分析，Cx43蛋白荧光强度增强，阳性细胞计数率由1.9%上升至26.3%；Wester blot检测到分子量约43KDa的Cx43蛋白表达；HeLa细胞生长明显受抑；细胞间隙连接通讯功能有所恢复。结论：维甲酸可通过上调肿瘤抑制基因cx43及其蛋白在HeLa细胞中的表达，实现对宫颈癌细胞恶性表型的逆转作用，这可能是维甲酸肿瘤抑制作用的重要机制之一。
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关键词：间隙连接 HeLa细胞 维甲酸 原位杂交 流式细胞仪 细胞间隙连接通讯
细胞间隙连接(gap junction)是相邻细胞间信息和能量交换的重要通讯方式，其基本结构即细胞膜上的间隙连接蛋白(connexin,cx)所构成的六聚体跨膜蛋白通道。cx基因被认为是非突变型肿瘤抑制基因。研究已表明，多种恶性肿瘤的发生及其恶性性状与间隙连接蛋白基因表达和间隙连接通讯功能(gap junction intracellular communication,GJIC)缺陷密切相关〔2〕，这一现象又受到维甲酸等抗肿瘤药物的抑制。cx43基因表达缺失对子宫颈癌的发生有重要意义。维甲酸对宫颈癌的抗肿瘤作用是否与cx基因的参与有关尚不清楚，深入揭示维甲酸的作用机制有重要意义。
1材料与方法
1.1细胞培养及维甲酸(retinoicacid,RA)处理
, 百拇医药
人子宫颈癌细胞系HeLa培养于含10%热灭活小牛血清(美国GIBCOL)的RPMI-1640(美国GIBCOL)培养基中，于细胞对数生长期加入全反式RA(美国SIGMA)，终浓度分别为10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L，间隔24小时按原浓度换液。每24小时进行细胞计数，绘制生长曲线。
1.2Cx43mRNA原位杂交
1.2.1探针制备：pSG5-cx43质粒(由湖南医科大学李桂源教授惠赠)经扩增、提取、纯化后，BamHI(美国GibcoBRL)酶切，7g/L琼脂糖凝胶电泳，以λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ为标准参照，DNA纯化回收试剂盒(美国Clontech)从胶中回收并纯化目的的基因片段，地高辛标记和检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim)标记探针，均按试剂盒说明操作。
, 百拇医药 1.2.2mRNA原位杂交：单层细胞爬片经0.2ml/LDEPC处理，0.2mol/LHCI酸化，5mg/L蛋白酶K37℃消化10分钟，0.1mol/L甘氨酸终止，40g/L多聚甲醛固定后充分干燥。滴加预杂交液，42℃孵育30分钟。将杂交液100℃变性10分钟，-20℃放置3分钟，滴加于细胞上，加硅化盖玻片，2×SSC湿盒内42℃杂交过夜。2×SSC、1×SSC、0.5×SSCBufferⅠ充分洗涤，100ml/L正常山羊血清封闭30分钟，加Dig-Ap复合物(1∶500)37℃孵育2小时。BufferⅠ洗涤，BufferⅢ平衡，NBT/BCIP避光充分显色，BufferⅣ终止反应，脱水、透明、封片。以胞质内出现蓝色颗粒为阳性。设阳性对照、阴性对照和空白对照。
1.3流式细胞仪分析
取RA处理的HeLa细胞及对照细胞制成单细胞悬液，加入鼠抗Cx43mAb(美国Zymed,1∶1000),4℃60分钟。离心收集细胞，用0.01mol/LPBS洗涤并悬浮，加入FITC标记的羊抗鼠IgG(美国Jackson，1∶40)，4℃30分钟，PBS洗涤并悬浮后，于EPICS-PROFILEⅡ流式细胞仪(美国Coulter)488nm波长激发FITC，测定阳性荧光染色显示基因表达产物，Multicycle软件(美国Phonenix)处理结果，设无关鼠抗IgG代替一抗为特异性对照。
, 百拇医药
1.4Western blot
收集每组约1×106细胞，加入细胞裂解缓冲液，冰浴30分钟，提取细胞全蛋白。分光光度计测定蛋白浓度，每孔取40μg蛋白，与上样缓冲液混合，100℃煮沸变形4分钟，蛋白电泳装置(美国Bio-Rad)80V电泳30分钟至分离胶，120V电泳1小时，完成10%SDS-PAGE电泳。蛋白电转移(美国Bio-Rad)100V350mA1小时将蛋白转移至NC膜(美国Hybond)。1%人血白蛋白RT封闭2小时，加鼠抗cx43mAb(1∶1000)(美国Zymed)摇床孵育2小时，TBST洗涤10分钟3次，与辣根过氧化物酶标记IgGRT孵育1小时，TEST洗涤，增强化学发光检测试剂盒(enhanced chemoluminescence,ECL)(英国Amersham International plc)放射自显影于X光胶片上。
1.5LuciferYellow(LY)划痕标记荧光传输法
, http://www.100md.com
取经RA处理前后HeLa单层细胞爬片，锐刀划痕标记，10%LY标记细胞3分钟，无血清RPMI-1640洗净背景，以490nm波长激发后荧光显微镜上观察细胞间隙连接通讯状态。
2结果
2.1RA对HeLa细胞生长的影响
实验中发现，HeLa细胞经RA处理后，生长速度明显减慢，尤以10-2mol/L对细胞的抑制作用最明显，其次是10-3mol/L，最次是10-4mol/L。在处理的第二天开始出现抑制作用，以后逐渐明显，RA对HeLa细胞的抑制作用呈现时间和剂量依赖性(图1)。
, 百拇医药
图1 不同浓度维甲酸作用Hela生长状态的影响
2.2Cx43mRNA原位杂交
将提取、纯化的cx43cDNA探针进行地高辛标记后，对培养的HeLa细胞进行mRNA原位杂交，结果显示，常规培养状态下的HeLa细胞胞质中无明显cx43mRNA信号，原位杂交呈阴性(图2)。RA处理后的HeLa细胞胞质内出现cx43 mRNA蓝色阳性信号(图3)。
图2 RA处理前HeLa细胞cx43mRNA阴性，ISH×400
400
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2.3流式细胞仪分析
HeLa细胞经RA作用后，Cx43蛋白表达增强，表现出明显的阳性荧光，HeLa细胞中Cx43蛋白表达阳性细胞计数率由RA作用前的1.9%上升至26.3%(图4)。
图4 RA作用前后HeLa细胞Cx43阳性细胞计数率
a.RA作用前，阳性细胞计数率1.9%
b.RA作用后，阳性细胞计数率26.3%
2.4 Western blot
未经处理的常规培养HeLa细胞，经细胞蛋白提取、免疫杂交分析未发现明显的Cx43蛋白表达。HeLa细胞经RA作用后发现，分子量约为43KDa的Cx43蛋白表达明显增强(图5)。
, 百拇医药
图5 Westernblot
a.Hela细胞经RA作用前
b.Hela细胞的RA作用后
2.5 LuciferYellow划痕标记荧光传输
Lucifer Yellow划痕标记荧光传输实验显示，常规培养的HeLa细胞，Lucifer Yellow荧光染色仅限于单个细胞。经RA处理后Lucifer Yellow荧光通过细胞间隙连接传输至相邻细胞，形成片状荧光染色(图6)。
图6 Lucifer Yellow划痕标记荧光传输
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a.Hela细胞经RA作用前
b.Hela细胞经RA作用后
3讨论
细胞间隙连接是普遍存在于动物组织中的一种细胞连接形式，通过它所介导的GJIC进行细胞间信息和能量的传递，调控细胞的新陈代谢、增殖分化等生理过程，对机体的代谢平衡及生长发育有重要意义〔2〕。研究发现，人宫颈癌细胞系HeLa等多种肿瘤和转化细胞的发生，与cx基因的表达缺失、GJIC功能缺陷密切相关〔3〕。cx基因的表达对绝大多数肿瘤细胞的生长起负调作用，GJIC功能的恢复表现出肿瘤生长控制和转化表型抑制。cx基因被认为是非突变型抑癌基因。
Cx基因的重要意义还在于其表达受到多种因素的调节，从而对肿瘤的生长起调控作用。其中肿瘤抑制剂维甲酸的调节作用和机理尚需深入研究。维甲酸可抑制肿瘤细胞的增殖并诱导分化，全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)是维生素A类化合物，能诱导细胞分化成熟或恶性逆转，达到治疗肿瘤的目的，是一类颇具潜力的癌细胞分化诱导剂〔4〕。
, http://www.100md.com
本文系统研究了ATRA对HeLa的作用及其机制。研究发现RA作用后的HeLa细胞经核酸原位杂交后cx43mRNA水平明显上调；FCM和Western blot一致从蛋白水平证实HeLa细胞中Cx43蛋白表达显著增加；同时，HeLa生长受到抑制，并呈现出对维甲酸的时间和剂量的依赖性；从细胞的通讯功能分析，HeLa经RA处理后细胞间隙连接通讯功能得到恢复。以上结果提示，用RA诱导分化方法治疗宫颈癌等多种肿瘤的理论依据，是以上调cx基因及其蛋白的表达为基础，从而恢复细胞间隙连接通讯功能，抑制肿瘤生长〔5，6〕。
cx基因在宫颈癌的研究，揭示了RA诱导分化作用新的理论基础，改变了传统肿瘤治疗中只能将其杀死的概念。如何诱导和上调肿瘤抑制基因cx基因的表达，并恢复它所介导的细胞间隙连接通讯功能是肿瘤化疗的新途径。cx基因理论丰富和完善了传统的肿瘤化疗理论，为揭示宫颈癌在内的多种肿瘤的分子机制和理论开拓一条新的道路，具有重要的基础和临床意义。
, http://www.100md.com 作者单位：第四军医大学西京医院妇产科(西安，710032)
〔参考文献〕
〔1〕Holder JW, Elmore E, Barrett J.Gap junction function and cancer〔J〕.Cancer Res, 1993,53：3475～3485.
〔2〕Steinberg TH. Gap junction function： the messenger and the message〔J〕.Am J Pathol,1998,152： 851～854.
〔3〕马向东，隋延仿，王文亮.间隙连接cx32mRNA，cx43mRNA及其蛋白产物在肝细胞肝癌中的表达〔J〕.临床与实验病理学杂志，1999，15：32～34.
〔4〕江宁，曾朝阳，湛凤凰，等.细胞间隙连接蛋白基因在鼻咽癌细胞株中的表达及维甲酸对其表达及调控作用〔J〕.癌症，1998，17：321～323.
, 百拇医药
〔5〕Mesnil M, Krutovskikh V, Piccoli C,et al. Negative growth control of HeLa cells by connexin genes：connexin species specificity〔J〕.Cancer Res,1995,55：629～639.
〔6〕Zhu W,Mironov N,Yamasaki H.Increased genetic stability of Hela cells after connexin 43 gene transfection〔J〕.Cancer Res,1997,57：2148～2150.
〔7〕Mesnil M,Piccoli C,Tiraby G,et al. Bystander killing of cancer cells by herpes simplex virus thymidine kinase gene is mediated by connexins〔J〕.Proc Nalt Acad Sci USA,1996,8：1831～1835.
, 百拇医药
〔8〕Mesnil M,Piccoli C,Yamasaki H.A tumor suppressor gene,Cx26,also mediates the bystander effect in HeLa cells〔J〕.Cancer Res,1997,57：2929～2932
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图2 RA处理前HeLa细胞cx43mRNA阴性，ISH×400
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图4 RA作用前后HeLa细胞Cx43阳性细胞计数率
a.RA作用前，阳性细胞计数率1.9%
b.RA作用后，阳性细胞计数率26.3%
2.4 Western blot
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图6 Lucifer Yellow划痕标记荧光传输
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a.Hela细胞经RA作用前
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〔2〕Steinberg TH. Gap junction function： the messenger and the message〔J〕.Am J Pathol,1998,152： 851～854.
〔3〕马向东，隋延仿，王文亮.间隙连接cx32mRNA，cx43mRNA及其蛋白产物在肝细胞肝癌中的表达〔J〕.临床与实验病理学杂志，1999，15：32～34.
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〔5〕Mesnil M, Krutovskikh V, Piccoli C,et al. Negative growth control of HeLa cells by connexin genes：connexin species specificity〔J〕.Cancer Res,1995,55：629～639.
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〔7〕Mesnil M,Piccoli C,Tiraby G,et al. Bystander killing of cancer cells by herpes simplex virus thymidine kinase gene is mediated by connexins〔J〕.Proc Nalt Acad Sci USA,1996,8：1831～1835.
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