白细胞介素-4对破骨细胞的分化作用
作者：王晓敏 于世凤 杨宗萍
单位：王晓敏 于世凤(北京大学口腔医院病理研究室 北京 100081)；杨宗萍(第一医院口腔科)
关键词：白细胞介素4；药理学；破骨细胞；代谢；骨质吸收；抗酒石酸酸性磷酸酶
北京医科大学学报000422 [摘 要] 目的:观察IL-4对诱导骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用。方法:用终浓度为10-8 mol.L-1的1,25(OH)2D3诱导成年小鼠骨髓干细胞分化形成破骨细胞,在此过程中加入不同质量浓度梯度的 IL-4(0、0.1、1、10 μg.L-1) 以及用IL-4的抗体中和IL-4。取IL-4(1 μg.L-1)处理过的第6天的培养上清液,先用抗IL-4抗体中和残余IL-4,再以体积分数1%,10%,20%,0加入另一新培养4 d含有骨片的骨髓细胞培养体系中,计数骨片上骨吸收陷窝数及面积,玻片上抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)阳性多核细胞和单核细胞数。结果:随IL-4(质量)浓度的增加,骨片上形成的骨吸收陷窝及面积数,玻片上的TRAP阳性细胞数呈量的依赖性的减少,加抗体组抵消了IL-4的抑制作用,加条件培养液组和未加组上述参数没有显著差别。结论:IL-4具有抑制骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用,这种作用不是通过使其它细胞形成可溶性因子,可能是直接作用于靶细胞(能分化为破骨细胞和巨噬细胞的前体细胞),使定向分化为TRAP阳性单核细胞的前体细胞转向分化为巨噬细胞, 破骨细胞数目减少,从而抑制了骨吸收。
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[中图分类号] R68-332 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0358-04
Effect of interleukin-4 on modulating osteoclast
differentiation and function in mouse bone marrow culture
WANG Xiao-Min
(Department of pathology, Peking University Stomatological Hospital, Beijing 100081,China)
YU Shi-Feng
(Department of pathology, Peking University Stomatological Hospital, Beijing 100081,China)
, 百拇医药
YANG Zong-Ping
(Department of Stomatology, Peking University First Hospital)
ABSTRACT Objective:
To observe the effect of IL-4 on murine hematopoietic stem cells differentiating into osteoclasts in mouse bone marrow induced by 1,25(OH)2D3. Methods: In the process of osteoclast formation from mouse bone marrow induced by 1,25(OH)2D3(10-8 mol.L-1), IL-4 with different concentration (0 μg.L-1, 0.1 μg.L-1, 1 μg.L-1, 10 μg.L-1) was added and another group was designed with anti-IL-4 antidodies. The cell-free supernants of cultures treated with IL-4(1 μg.L-1) were preincubated with anti-IL-4 antibodies (1 g.L-1)to block any residual active IL-4 and added to other fresh bone marrow cultures on day 4(0%-20% vol/vol). The number of bone resorption pits and area on bone slices and the number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) positive cells on glass slices were counted. Results: The addition of IL-4(0.1-10 μg.L-1)at the start of the culture period induced a dose-dependent decrease in the number of bone resorption pits, area; and TRAP positive cells. In the anti-IL-4 neutralizing group and conditioned medium groups, the parameters which were the same as the above, compared with the control group, had no significant difference in statistics. Conclusion: IL-4 could inhibit osteoclast formation from hepatopoietic stem cells in vitro. Such an effect did not seem to be mediated by release of other soluble factors from other cells, and it might directly acts on uncommitted precursors able to differentiate toward both osteoclasts and macrophages. The cytokine induced a preferential differention toward the macrophage phenotype, thus decreasing the generation of osteoclasts and inhibiting bone resorption.
, 百拇医药
KEY WORDS Interleukin 4/pharmacol; Osteoclasts/metab; Bone resorption; Tartrate-resistant acid phosphatase
(J Beijing Med Univ, 2000,32:358-361)
白细胞介素-4是由激活的T淋巴细胞和肥大细胞产生和分泌的免疫糖蛋白是造血细胞系许多细胞的生长分化因子，曾命名为B细胞生长因子。此外，它还影响骨骼的新陈代谢[1]。Watanabe[2]通过对胎鼠长骨器官培养，首次提出IL-4具有抑制破骨细胞性骨吸收的作用，但其作用机制不清。因为破骨细胞来源于造血细胞系前体细胞，而IL-4对一些造血细胞的分化具有调节作用，因此提出IL-4抑制破骨细胞骨吸收是否和破骨细胞生成的减少有关，国外的相关研究不多见，国内尚未见报道，本文用鼠骨髓破骨细胞培养体系检测IL-4对破骨细胞形成和功能的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 α-MEM培养基，重组鼠的IL-4(购自Pepro Tech，INC.，抗IL-4抗体(西班牙JoseA.Riancho教授馈赠)，1，25(OH)2D3(协和医院内分泌科馈赠)。
1.1.2 动物 5周雄性NH小鼠(购自国家计划生育委员会动物室)。
1.1.3 骨磨片和玻片按本室常规方法制备 牛骨磨片磨至10 μm厚6mm×6mm，超声清洗，浸泡于双抗(青霉素1000 u.ml-1, 链霉素1000 mg.L-1)1 h，换液3次;6mm×6mm玻片常规清洗，高压蒸汽灭菌。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 破骨细胞的诱导培养 5周NH小鼠，乙醚麻醉下，断颈处死，无菌条件下取四肢长骨，去净软组织，用剪刀剪断长骨两端，用1 ml无菌注射器吸取α-MEM培养液由长骨一端冲洗骨髓腔，冲洗两遍，收集细胞悬液，筛网过滤，α-MEM洗两遍，最后悬于α-MEM全培养液[青霉素100 u.ml-1，链霉素100 mg.L-1，15%(体积分数)胎牛血清]内，其密度为5.5×107ml-1，每孔0.5 ml种于24孔培养板内。全培养液内加入1，25(OH)2D3终浓度为10-8mol.L-1。
1.2.2 IL-4的添加及分组设计 将IL-4加入细胞悬液内，质量浓度分别为0.1 μg.L-1、1 μg.L-1、10 μg.L-1、1 μg.L-1+抗IL-4抗体1 mg.L-1、0 μg.L-1，按不同质量浓度分组，每组8个孔，按前述质量浓度顺序加入骨片组记为a、b、c、d、e组；加入玻片组记为a′、b′、c′、d′、e′组，在骨片上计数骨陷窝数，在玻片上计数破骨细胞数。其中e组和e`组加入等量的PBS液作为对照组。每3天换液1次，每次添加相同浓度的1,25(OH)2D3和IL-4。取培养6 d曾加入IL-4(质量浓度为1 μg.L-1)的培养上清液，加入抗IL-4抗体1 mg.L-1以中和残余IL-4，以(体积分数)梯度0%，1%，10%，20%。放入含有骨片的新培养4 d的骨髓细胞培养孔内，定为A、B、C、D组。A组加入等量的PBS液作为对照组。
, 百拇医药
1.2.3 倒置光相差显微镜下观察，摄影，计数 观察细胞在骨片及玻片上的生长情况，于培养第5天，第7天，第12天，观察骨片上骨吸收陷窝情况，拍照，并计数骨吸收陷窝数。照片共60张(a、b、c、d、e，各10张)，同样放大倍数，利用LEICAQ550IW图象分析系统进行吸收陷窝面积分析。
1.2.4 酶组织化学 计数及分析抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色结果，于细胞培养第7天，骨片上出现骨吸收陷窝时，将a′、b′、c′、d′、e′，组玻片用PBS冲洗后，40 g.L-1多聚甲醛固定8 min，于TRAP染色孵育液(0.1 mol.L-1醋酸缓冲液，pH 5.0 20 ml;AS-Bi 磷酸盐4 mg溶于二甲基甲酰胺内;Fast GAR nett Gbc 10 mg;0.1 mol.L-1抗酒石酸300 mg)内室温孵育15 min，甲基绿复染。 TRAP染色阳性细胞呈紫红色，计数各组玻片上TRAP染色阳性单核细胞和多核细胞(含有3个以上的核)。
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1.2.5 统计分析 各组吸收陷窝数及吸收面积，各组TRACP染色阳性单核及多核细胞数，采用SPSS软件的t检验进行分析。
2 结果
2.1 倒置光相差显微镜下形态学观察
细胞悬液种于培养板玻片上，可见满视野单核细胞，其中有许多红细胞，3 d换液后，细胞密度比较疏松，仍为单核细胞，但细胞贴壁延展，于培养第5天，细胞密度增大，可见多核细胞形成，单核细胞环绕其周围。在对照组玻片上多核细胞最多达40左右。对照组骨片上，细胞培养第5天偶见骨吸收陷窝(图1)，第10天骨吸收陷窝数明显增多(图2)，在培养第14天时，陷窝几乎遍布骨片，多处出现穿凿性骨破坏。
图1 鼠骨髓细胞培养第5天，骨片上偶见骨吸收陷窝 ×200
, 百拇医药
Figure.1 Bone resorption pits are apparent once in a while
on the bone slices at the fifth day of culturing mouse bone marrow cells. ×200
图2 鼠骨髓细胞培养第10天，骨片上骨吸收陷窝明显增多 ×210
Figure2 The number of bone resorption increased obviously
at the tenth day of culturing mouse bone marrow cells. ×210
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2.2 IL-4对骨髓细胞在玻片上形成TRAP+细胞影响的观察
培养前3天，各组TRAP染色未见阳性细胞，对照组于培养第5天玻片上出现TRAP阳性多核细胞和单核细胞，至培养第7天TRAP阳性单核细胞和多核细胞数显著增加(图3)。而不同浓度IL-4加入组所形成的TRAP+多核及单核细胞数呈量的依赖性的减少。
表1 各组TRAP染色阳性多核细胞及单抗细胞数(
±s)
Table 1 The number of TRAP positive cells in different groups(±s) ρ(IL-4)/μg.L-1
, 百拇医药
TRAP+ multinucleate
cells
TRAP+ mononucleate
cells
a′(0.1)
33.0±1.3
109.5±6.1
b′(1)
23.1±2.3
81.9±2.4
c′(10)
, 百拇医药
16.1±1.5
45.0±3.6
d (1+antibody)
41.5±2.1
197.1±4.9
e′(0)
44.8±1.5
201.3±4.4
n=8, compared experimental groups with contral group, P<0.01， while the antibody group, P>0.05.
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图3 鼠骨髓细胞培养第5天，TRAP染色阳性多核细胞(破骨细胞)和
单核细胞(破骨细胞前体细胞)形成。 ×175
Figure.3 There are multinuclear cells(osteoclasts)and mononuclear
cells(osteoclastic precursors)which are positive in TRAP staining
at the fifth of culturing mouse bone marrow cells. ×175
2.3 IL-4对诱导破骨细胞培养体系在骨片上形成骨吸收陷窝影响的观察
各组骨片上前4天未见骨吸收陷窝，于第5天，加抗体组(d)、对照组(e)骨片上可见散在的吸收陷窝，a组偶见骨吸收陷窝。于第7天，对照组和加抗体组骨吸收陷窝数增多，且分布均匀。而其它各组随IL-4质量浓度提高，形成骨吸收陷窝数显著减少。于第12天这种差别更明显。对照组和加抗体组骨片上吸收陷窝满视野，而其它各组仅见较小的散在吸收陷窝簇。IL-4的抑制作用也表现在吸收陷窝面积的测定上，随IL-4质量浓度的增高，骨吸收陷窝面积与对照组相比亦呈剂量依赖性减少。
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表2 各组骨片上的骨吸收陷窝数(±s)
Table 2 The number of bone resorption pits in different groups(±s) ρ(IL-4)/μg.L-1
5 d
7 d
12 d
a(0.1)
4.6±0.5
33.3±2.8
, 百拇医药
311±6
b(1)
0.0±0.0
18.4±1.4
241±7
c(10)
0.0±0.0
6.9±2.1
149±8
d(1+antibody)
17.8±2.3
120.4±8.7
, 百拇医药
578±15
e(0)
18.9±2.5
118.6±8.6
572±8
n=8, Compared experimental groups with contrals in 5 th，7 th，12 th, P<0.01，while the antybody group, P>0.05.
说明不同梯度(质量)浓度IL-4的加入能够产生剂量依赖性抑制作用，而抗体加入组拮抗了IL-4的抑制作用，与对照组相比没有显著差异，不仅表现在破骨细胞数上，而且表现在吸收面积上。
2.4 不同条件骨髓培养上清液对新鲜骨髓细胞功能特性分化的影响观察
, 百拇医药
加入IL-4处理的条件培养液各组与对照组相比骨片上形成吸收陷窝数没有很大差别。
表3 培养第12天各组骨吸收陷窝面积(±s)
Table 3 The number of bone resorption pit area in different groups
in culturing 12 th day (±s) A/μm2 ρ(IL-4)/μg.L-1
area/μm2
, 百拇医药
t
p
a(0.1)
6457±1163
b(1)
1956± 812
t(b-a)7.33
0.000
c(10)
860± 244
t(c-b)4.09
0.001
, 百拇医药
d(1+antibody)
17483±4222
t(a-d)7.62
0.000
e(0)
15784±3469
t(d-e)0.98
0.339
n=10.表4 加条件培养液培养板的前吸收陷窝数(±s)
Table 4 The number of bone resorption pits in condition
, 百拇医药
culturing medium plates in different groups(±s) Group
5 th
7 th
12 th
A
33.5±2.4
193±12
621±14
B
33.3±3.3
, 百拇医药
191± 8
618±15
C
33.5±4.4
191±12
620±21
D
32.8±4.1
189±11
619±10
n=6, compares D,B,C groups with A group(control group), P>0.05.
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3 讨论
已公认破骨细胞是骨髓源的,和骨髓的单核细胞系相关,关于破骨细胞前体细胞的来源,意见尚难统一。由骨髓单核细胞分化为破骨细胞受许多系统和局部因素的调节。已有实验证实甲状旁腺激素,1,25(OH)2D3,前列腺素,IL-1,IL-6,TNF-α和TNF-β能够刺激破骨细胞的形成,而降钙素和干扰素-α具有抑制破骨细胞形成的作用,转化生长因子-β具有双向调节作用[3～5]。本实验结果提示了IL-4在鼠骨髓破骨细胞培养体系中也是一种潜在的抑制因子。破骨细胞具有表达高水平的TRAP和独一无二的在矿化的骨和牙本质表面形成骨吸收陷窝的能力，因而对TRAP和骨吸收陷窝的监测能充分体现破骨细胞的活化和功能状态。将IL-4加入鼠骨髓破骨细胞培养体系中,随浓度梯度提高,骨片上的破骨细胞数和骨吸收陷窝面积及玻片上TRAP阳性多核细胞数和单核细胞数呈量的依赖性的减少,对照组骨片上吸收陷窝在培养第14天时几乎布满骨片,结果说明，IL-4抑制骨髓源破骨细胞的形成，从而减少骨吸收陷窝的形成和骨吸收陷窝的面积，减少骨吸收。曾有研究报道，IL-4受体广泛存在于成骨细胞[6]、骨髓基质细胞[7]、和造血细胞上[8]，更有人认为在骨髓细胞中IL-4的靶细胞是单核巨噬细胞系的前体细胞[9]，而这些细胞都是与破骨细胞形成与活化密切相关的细胞。曾有研究报道，IL-4通过抑制前列腺合成酶2和胞浆内磷脂酶2的活性而抑制PGE2的产生，而PGE2是已公认的破骨细胞形成和活化的激活因子。本文的结果是否和此机制相关？将IL-4处理的培养过破骨细胞的条件培养液以不同质量浓度加入新培养的破骨细胞中,骨片上形成的破骨细胞数与对照组相比没有显著差异。在加入IL-4之前用抗IL-4抗体孵育40 min,骨片上形成的骨吸收陷窝数与对照组相比亦无显著差异,这一实验结果和Jose[10]的实验结果相同,和Peschel[11]的结论相反。说明IL-4确有抑制破骨细胞分化形成的作用,但不是通过刺激细胞分泌可溶性抑制因子的作用,而有可能直接作用于靶细胞发挥作用，因为去除IL-4的条件培养液并不抑制破骨细胞的形成，而直接加入IL-4则抑制破骨细胞的形成。而且随IL-4浓度梯度提高TRAP阳性多核细胞减少,TRAP阴性细胞却增多,因此推测IL-4作用于既能分化为破骨细胞又能分化为巨噬细胞的未定向前体细胞,使TRAP阳性单核细胞的前体细胞(即未定向的骨髓干细胞)定向发生转化形成多核巨噬细胞,从而形成的破骨细胞数减少,抑制了骨吸收。本研究还观察到，玻片上形成的破骨细胞数(TRAP阳性多核细胞数最多时达40左右)和骨片上形成的吸收陷窝数(最多时达700)相差悬殊,尽管破骨细胞骨吸收时具有逃逸现象,即破骨细胞在一处形成陷窝后可游离到另一处继续形成骨陷窝,正常情况下单一破骨细胞在其生命周期中的破骨能力还无法预测,如果把一个吸收陷窝团视为一个破骨细胞所为,骨片上的破骨细胞数仍远远大于玻片上的破骨细胞数,因而提出,粘附机制是否也参与破骨细胞的诱导形成过程，而IL-4对破骨细胞形成和活化的粘附机制也有抑制作用。因此，有关IL-4对破骨细胞形成作用的分子机制有待于进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金重点项目(39330220)。
参考文献
1，Paul WE. Interleukin-4:a prototypic immunoregulatory lymphokine[J]. Blood, 1991,77:1859-1870
2，Watanabe K,Tanaka Y,Morimoto I, et al. Interleukin-4 as a potent inhibitor of bone resorption[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1990,172:1035-1041
3，Takahashi N,Yamana H,Yoshiki S, et al. Osteoclast-likecell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures[J]. Endocrinology， 1988,122:1373-1382
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4，Pfeilschifter J,Chenu C,Bird A, et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor stimulate the formation of human osteoclastlike cells in vitro[J]. J Bone Miner Res， 1989,4:113-118
5，Kurhara N,Bertolini D,Suda T, et al. IL-6 stimulates osteoclast-like multinucleated cell formation in long term human marrow cultures by inducing IL-1 increase[J]. J Immunol， 1990,144:4226-4230
6，Lacey DL, Erdmann JM, Tan HL, et al. Murine osteoblast interleukin-4 receptor expression: upregulation by 1,25， dihydroxy vitamin D3[J]. J Cell Biochem， 1993,53:122-134
, 百拇医药
7，Lowenthal JW,Castle BE, Christiansen J, et al, Expression of high affinity receptors for murine interleukin-4(BSF-1) on hemopoietic cells[J]. J Immunol， 1988,140:456-464
8，Ohara J, Paul WE. Receptors for B-cell stimulatory factor-1 expression on cells of haematopoietic lineage[J]. Nature， 1987,325:537-540
9，Lacey Dl, Erdmann JM, Teitelbaum SL, et al, Interleukin-4,interferon-γ, and prostaglandin E impact the osteoclastic cell-forming potential of murine bone marrow macrophages[J]. Endocrinology， 1995,136:2367-2376
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10，Riancho JA, Maria TZ， Jesus GM. Interleukin-4 modulates osteoclast differentiation and inhibits the formation of resorption pits in mouse osteoclast cultures[J]. Biochem Biophy Res Commun， 1993,196:678-685
11，Peschel C,Green I,Paul WE, Interleukin-4 induces a substance in bone marrow stromal cells that reversibly inhibits factor-dependent and factor-independent cell proliferation[J]. Blood， 1989,73:1130-1141
(1999-03-01收稿), 百拇医药
单位：王晓敏 于世凤(北京大学口腔医院病理研究室 北京 100081)；杨宗萍(第一医院口腔科)
关键词：白细胞介素4；药理学；破骨细胞；代谢；骨质吸收；抗酒石酸酸性磷酸酶
北京医科大学学报000422 [摘 要] 目的:观察IL-4对诱导骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用。方法:用终浓度为10-8 mol.L-1的1,25(OH)2D3诱导成年小鼠骨髓干细胞分化形成破骨细胞,在此过程中加入不同质量浓度梯度的 IL-4(0、0.1、1、10 μg.L-1) 以及用IL-4的抗体中和IL-4。取IL-4(1 μg.L-1)处理过的第6天的培养上清液,先用抗IL-4抗体中和残余IL-4,再以体积分数1%,10%,20%,0加入另一新培养4 d含有骨片的骨髓细胞培养体系中,计数骨片上骨吸收陷窝数及面积,玻片上抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)阳性多核细胞和单核细胞数。结果:随IL-4(质量)浓度的增加,骨片上形成的骨吸收陷窝及面积数,玻片上的TRAP阳性细胞数呈量的依赖性的减少,加抗体组抵消了IL-4的抑制作用,加条件培养液组和未加组上述参数没有显著差别。结论:IL-4具有抑制骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用,这种作用不是通过使其它细胞形成可溶性因子,可能是直接作用于靶细胞(能分化为破骨细胞和巨噬细胞的前体细胞),使定向分化为TRAP阳性单核细胞的前体细胞转向分化为巨噬细胞, 破骨细胞数目减少,从而抑制了骨吸收。
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WANG Xiao-Min
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YANG Zong-Ping
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ABSTRACT Objective:
To observe the effect of IL-4 on murine hematopoietic stem cells differentiating into osteoclasts in mouse bone marrow induced by 1,25(OH)2D3. Methods: In the process of osteoclast formation from mouse bone marrow induced by 1,25(OH)2D3(10-8 mol.L-1), IL-4 with different concentration (0 μg.L-1, 0.1 μg.L-1, 1 μg.L-1, 10 μg.L-1) was added and another group was designed with anti-IL-4 antidodies. The cell-free supernants of cultures treated with IL-4(1 μg.L-1) were preincubated with anti-IL-4 antibodies (1 g.L-1)to block any residual active IL-4 and added to other fresh bone marrow cultures on day 4(0%-20% vol/vol). The number of bone resorption pits and area on bone slices and the number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) positive cells on glass slices were counted. Results: The addition of IL-4(0.1-10 μg.L-1)at the start of the culture period induced a dose-dependent decrease in the number of bone resorption pits, area; and TRAP positive cells. In the anti-IL-4 neutralizing group and conditioned medium groups, the parameters which were the same as the above, compared with the control group, had no significant difference in statistics. Conclusion: IL-4 could inhibit osteoclast formation from hepatopoietic stem cells in vitro. Such an effect did not seem to be mediated by release of other soluble factors from other cells, and it might directly acts on uncommitted precursors able to differentiate toward both osteoclasts and macrophages. The cytokine induced a preferential differention toward the macrophage phenotype, thus decreasing the generation of osteoclasts and inhibiting bone resorption.
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KEY WORDS Interleukin 4/pharmacol; Osteoclasts/metab; Bone resorption; Tartrate-resistant acid phosphatase
(J Beijing Med Univ, 2000,32:358-361)
白细胞介素-4是由激活的T淋巴细胞和肥大细胞产生和分泌的免疫糖蛋白是造血细胞系许多细胞的生长分化因子，曾命名为B细胞生长因子。此外，它还影响骨骼的新陈代谢[1]。Watanabe[2]通过对胎鼠长骨器官培养，首次提出IL-4具有抑制破骨细胞性骨吸收的作用，但其作用机制不清。因为破骨细胞来源于造血细胞系前体细胞，而IL-4对一些造血细胞的分化具有调节作用，因此提出IL-4抑制破骨细胞骨吸收是否和破骨细胞生成的减少有关，国外的相关研究不多见，国内尚未见报道，本文用鼠骨髓破骨细胞培养体系检测IL-4对破骨细胞形成和功能的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 α-MEM培养基，重组鼠的IL-4(购自Pepro Tech，INC.，抗IL-4抗体(西班牙JoseA.Riancho教授馈赠)，1，25(OH)2D3(协和医院内分泌科馈赠)。
1.1.2 动物 5周雄性NH小鼠(购自国家计划生育委员会动物室)。
1.1.3 骨磨片和玻片按本室常规方法制备 牛骨磨片磨至10 μm厚6mm×6mm，超声清洗，浸泡于双抗(青霉素1000 u.ml-1, 链霉素1000 mg.L-1)1 h，换液3次;6mm×6mm玻片常规清洗，高压蒸汽灭菌。
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1.2 方法
1.2.1 破骨细胞的诱导培养 5周NH小鼠，乙醚麻醉下，断颈处死，无菌条件下取四肢长骨，去净软组织，用剪刀剪断长骨两端，用1 ml无菌注射器吸取α-MEM培养液由长骨一端冲洗骨髓腔，冲洗两遍，收集细胞悬液，筛网过滤，α-MEM洗两遍，最后悬于α-MEM全培养液[青霉素100 u.ml-1，链霉素100 mg.L-1，15%(体积分数)胎牛血清]内，其密度为5.5×107ml-1，每孔0.5 ml种于24孔培养板内。全培养液内加入1，25(OH)2D3终浓度为10-8mol.L-1。
1.2.2 IL-4的添加及分组设计 将IL-4加入细胞悬液内，质量浓度分别为0.1 μg.L-1、1 μg.L-1、10 μg.L-1、1 μg.L-1+抗IL-4抗体1 mg.L-1、0 μg.L-1，按不同质量浓度分组，每组8个孔，按前述质量浓度顺序加入骨片组记为a、b、c、d、e组；加入玻片组记为a′、b′、c′、d′、e′组，在骨片上计数骨陷窝数，在玻片上计数破骨细胞数。其中e组和e`组加入等量的PBS液作为对照组。每3天换液1次，每次添加相同浓度的1,25(OH)2D3和IL-4。取培养6 d曾加入IL-4(质量浓度为1 μg.L-1)的培养上清液，加入抗IL-4抗体1 mg.L-1以中和残余IL-4，以(体积分数)梯度0%，1%，10%，20%。放入含有骨片的新培养4 d的骨髓细胞培养孔内，定为A、B、C、D组。A组加入等量的PBS液作为对照组。
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1.2.3 倒置光相差显微镜下观察，摄影，计数 观察细胞在骨片及玻片上的生长情况，于培养第5天，第7天，第12天，观察骨片上骨吸收陷窝情况，拍照，并计数骨吸收陷窝数。照片共60张(a、b、c、d、e，各10张)，同样放大倍数，利用LEICAQ550IW图象分析系统进行吸收陷窝面积分析。
1.2.4 酶组织化学 计数及分析抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色结果，于细胞培养第7天，骨片上出现骨吸收陷窝时，将a′、b′、c′、d′、e′，组玻片用PBS冲洗后，40 g.L-1多聚甲醛固定8 min，于TRAP染色孵育液(0.1 mol.L-1醋酸缓冲液，pH 5.0 20 ml;AS-Bi 磷酸盐4 mg溶于二甲基甲酰胺内;Fast GAR nett Gbc 10 mg;0.1 mol.L-1抗酒石酸300 mg)内室温孵育15 min，甲基绿复染。 TRAP染色阳性细胞呈紫红色，计数各组玻片上TRAP染色阳性单核细胞和多核细胞(含有3个以上的核)。
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1.2.5 统计分析 各组吸收陷窝数及吸收面积，各组TRACP染色阳性单核及多核细胞数，采用SPSS软件的t检验进行分析。
2 结果
2.1 倒置光相差显微镜下形态学观察
细胞悬液种于培养板玻片上，可见满视野单核细胞，其中有许多红细胞，3 d换液后，细胞密度比较疏松，仍为单核细胞，但细胞贴壁延展，于培养第5天，细胞密度增大，可见多核细胞形成，单核细胞环绕其周围。在对照组玻片上多核细胞最多达40左右。对照组骨片上，细胞培养第5天偶见骨吸收陷窝(图1)，第10天骨吸收陷窝数明显增多(图2)，在培养第14天时，陷窝几乎遍布骨片，多处出现穿凿性骨破坏。
图1 鼠骨髓细胞培养第5天，骨片上偶见骨吸收陷窝 ×200
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Figure.1 Bone resorption pits are apparent once in a while
on the bone slices at the fifth day of culturing mouse bone marrow cells. ×200
图2 鼠骨髓细胞培养第10天，骨片上骨吸收陷窝明显增多 ×210
Figure2 The number of bone resorption increased obviously
at the tenth day of culturing mouse bone marrow cells. ×210
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2.2 IL-4对骨髓细胞在玻片上形成TRAP+细胞影响的观察
培养前3天，各组TRAP染色未见阳性细胞，对照组于培养第5天玻片上出现TRAP阳性多核细胞和单核细胞，至培养第7天TRAP阳性单核细胞和多核细胞数显著增加(图3)。而不同浓度IL-4加入组所形成的TRAP+多核及单核细胞数呈量的依赖性的减少。
表1 各组TRAP染色阳性多核细胞及单抗细胞数(
±s)Table 1 The number of TRAP positive cells in different groups(
±s) ρ(IL-4)/μg.L-1, 百拇医药
TRAP+ multinucleate
cells
TRAP+ mononucleate
cells
a′(0.1)
33.0±1.3
109.5±6.1
b′(1)
23.1±2.3
81.9±2.4
c′(10)
, 百拇医药
16.1±1.5
45.0±3.6
d (1+antibody)
41.5±2.1
197.1±4.9
e′(0)
44.8±1.5
201.3±4.4
n=8, compared experimental groups with contral group, P<0.01， while the antibody group, P>0.05.
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图3 鼠骨髓细胞培养第5天，TRAP染色阳性多核细胞(破骨细胞)和
单核细胞(破骨细胞前体细胞)形成。 ×175
Figure.3 There are multinuclear cells(osteoclasts)and mononuclear
cells(osteoclastic precursors)which are positive in TRAP staining
at the fifth of culturing mouse bone marrow cells. ×175
2.3 IL-4对诱导破骨细胞培养体系在骨片上形成骨吸收陷窝影响的观察
各组骨片上前4天未见骨吸收陷窝，于第5天，加抗体组(d)、对照组(e)骨片上可见散在的吸收陷窝，a组偶见骨吸收陷窝。于第7天，对照组和加抗体组骨吸收陷窝数增多，且分布均匀。而其它各组随IL-4质量浓度提高，形成骨吸收陷窝数显著减少。于第12天这种差别更明显。对照组和加抗体组骨片上吸收陷窝满视野，而其它各组仅见较小的散在吸收陷窝簇。IL-4的抑制作用也表现在吸收陷窝面积的测定上，随IL-4质量浓度的增高，骨吸收陷窝面积与对照组相比亦呈剂量依赖性减少。
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表2 各组骨片上的骨吸收陷窝数(
±s)Table 2 The number of bone resorption pits in different groups(
±s) ρ(IL-4)/μg.L-15 d
7 d
12 d
a(0.1)
4.6±0.5
33.3±2.8
, 百拇医药
311±6
b(1)
0.0±0.0
18.4±1.4
241±7
c(10)
0.0±0.0
6.9±2.1
149±8
d(1+antibody)
17.8±2.3
120.4±8.7
, 百拇医药
578±15
e(0)
18.9±2.5
118.6±8.6
572±8
n=8, Compared experimental groups with contrals in 5 th，7 th，12 th, P<0.01，while the antybody group, P>0.05.
说明不同梯度(质量)浓度IL-4的加入能够产生剂量依赖性抑制作用，而抗体加入组拮抗了IL-4的抑制作用，与对照组相比没有显著差异，不仅表现在破骨细胞数上，而且表现在吸收面积上。
2.4 不同条件骨髓培养上清液对新鲜骨髓细胞功能特性分化的影响观察
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加入IL-4处理的条件培养液各组与对照组相比骨片上形成吸收陷窝数没有很大差别。
表3 培养第12天各组骨吸收陷窝面积(
±s)Table 3 The number of bone resorption pit area in different groups
in culturing 12 th day (
±s) A/μm2 ρ(IL-4)/μg.L-1area/μm2
, 百拇医药
t
p
a(0.1)
6457±1163
b(1)
1956± 812
t(b-a)7.33
0.000
c(10)
860± 244
t(c-b)4.09
0.001
, 百拇医药
d(1+antibody)
17483±4222
t(a-d)7.62
0.000
e(0)
15784±3469
t(d-e)0.98
0.339
n=10.表4 加条件培养液培养板的前吸收陷窝数(
±s)Table 4 The number of bone resorption pits in condition
, 百拇医药
culturing medium plates in different groups(
±s) Group5 th
7 th
12 th
A
33.5±2.4
193±12
621±14
B
33.3±3.3
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191± 8
618±15
C
33.5±4.4
191±12
620±21
D
32.8±4.1
189±11
619±10
n=6, compares D,B,C groups with A group(control group), P>0.05.
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3 讨论
已公认破骨细胞是骨髓源的,和骨髓的单核细胞系相关,关于破骨细胞前体细胞的来源,意见尚难统一。由骨髓单核细胞分化为破骨细胞受许多系统和局部因素的调节。已有实验证实甲状旁腺激素,1,25(OH)2D3,前列腺素,IL-1,IL-6,TNF-α和TNF-β能够刺激破骨细胞的形成,而降钙素和干扰素-α具有抑制破骨细胞形成的作用,转化生长因子-β具有双向调节作用[3～5]。本实验结果提示了IL-4在鼠骨髓破骨细胞培养体系中也是一种潜在的抑制因子。破骨细胞具有表达高水平的TRAP和独一无二的在矿化的骨和牙本质表面形成骨吸收陷窝的能力，因而对TRAP和骨吸收陷窝的监测能充分体现破骨细胞的活化和功能状态。将IL-4加入鼠骨髓破骨细胞培养体系中,随浓度梯度提高,骨片上的破骨细胞数和骨吸收陷窝面积及玻片上TRAP阳性多核细胞数和单核细胞数呈量的依赖性的减少,对照组骨片上吸收陷窝在培养第14天时几乎布满骨片,结果说明，IL-4抑制骨髓源破骨细胞的形成，从而减少骨吸收陷窝的形成和骨吸收陷窝的面积，减少骨吸收。曾有研究报道，IL-4受体广泛存在于成骨细胞[6]、骨髓基质细胞[7]、和造血细胞上[8]，更有人认为在骨髓细胞中IL-4的靶细胞是单核巨噬细胞系的前体细胞[9]，而这些细胞都是与破骨细胞形成与活化密切相关的细胞。曾有研究报道，IL-4通过抑制前列腺合成酶2和胞浆内磷脂酶2的活性而抑制PGE2的产生，而PGE2是已公认的破骨细胞形成和活化的激活因子。本文的结果是否和此机制相关？将IL-4处理的培养过破骨细胞的条件培养液以不同质量浓度加入新培养的破骨细胞中,骨片上形成的破骨细胞数与对照组相比没有显著差异。在加入IL-4之前用抗IL-4抗体孵育40 min,骨片上形成的骨吸收陷窝数与对照组相比亦无显著差异,这一实验结果和Jose[10]的实验结果相同,和Peschel[11]的结论相反。说明IL-4确有抑制破骨细胞分化形成的作用,但不是通过刺激细胞分泌可溶性抑制因子的作用,而有可能直接作用于靶细胞发挥作用，因为去除IL-4的条件培养液并不抑制破骨细胞的形成，而直接加入IL-4则抑制破骨细胞的形成。而且随IL-4浓度梯度提高TRAP阳性多核细胞减少,TRAP阴性细胞却增多,因此推测IL-4作用于既能分化为破骨细胞又能分化为巨噬细胞的未定向前体细胞,使TRAP阳性单核细胞的前体细胞(即未定向的骨髓干细胞)定向发生转化形成多核巨噬细胞,从而形成的破骨细胞数减少,抑制了骨吸收。本研究还观察到，玻片上形成的破骨细胞数(TRAP阳性多核细胞数最多时达40左右)和骨片上形成的吸收陷窝数(最多时达700)相差悬殊,尽管破骨细胞骨吸收时具有逃逸现象,即破骨细胞在一处形成陷窝后可游离到另一处继续形成骨陷窝,正常情况下单一破骨细胞在其生命周期中的破骨能力还无法预测,如果把一个吸收陷窝团视为一个破骨细胞所为,骨片上的破骨细胞数仍远远大于玻片上的破骨细胞数,因而提出,粘附机制是否也参与破骨细胞的诱导形成过程，而IL-4对破骨细胞形成和活化的粘附机制也有抑制作用。因此，有关IL-4对破骨细胞形成作用的分子机制有待于进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金重点项目(39330220)。
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(1999-03-01收稿), 百拇医药