乳酸杆菌基因转化质粒载体系统及其基因工程研究进展
易庆 王关林 方宏筠
关键词：乳酸杆菌 基因工程 质粒载体系统
几个世纪以来，乳杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品及 饮料加工业 ，其生物学特性为棒状，厌氧或微需氧，属非致病菌。以乳杆菌作为发酵菌的食品工业所创 造出的经济价值占全球总的发酵类食品的20%。同时乳杆菌也被广泛用于肠、肉类食品的加 工和保鲜。乳杆菌通过重建肠道菌群平衡，从而有利于人类及某些动物宿主恢复并提高健康 状态。对于其发挥作用的机制现已研究得较为明确，主要有以下几个方面：1)控制肠道感染 。2)增加某些食物的营养价值。3)控制血清胆固醇水平。4)改善乳糖代谢。5)诱导体内特异 性及非特异性免疫。6)抗肿瘤活性。
乳杆菌具有十分重要的生理作用及经济价值，因此近几十年来已广泛开展了对其定性、筛选 、代谢、生理学及基因方面的研究，尤其是应用基因工程手段已将研究由原来的重点定性分 类阶段转移到稳定转化及改善乳杆菌生物学性状的重点上来。根据一系列复制子构建的 具广 泛宿主范围的质粒载体系统已十分成功地转化乳酸菌并表达内源及外源基因。但是与医药微 生物基因工程研究相比，乳酸杆菌基因工程进展较慢，为有利于该项基因工程的发展和产业 化作者综述如下。
, 百拇医药
1 乳酸杆菌质粒
乳酸杆菌的许多种类中均发现有质粒的存在。最早在1976年由Chassy及基同事发现的。分离 得到的质粒来源于植物、肉类、青储饲料，发酵生面及消化道。从研究中发现，很多种类的 乳 杆菌均具有一个或多个质普。Wang TT等研究发现约有38%的乳酸杆菌中含有大小不等的质粒 ，约在1.2-150kb之间。且数量各异，1个或多个。这些小的质粒同其他革兰氏阳性菌的线 型 质粒具有高度的相似性。一些乳杆菌质粒复制子具有广泛宿主范围，因而可在其他种类的革 兰氏阳性菌及大肠杆菌中发挥作用。但大多数乳杆菌质粒均为隐弊型。但有些质粒编码功能 已 经明确，并已应用于乳杆菌的鉴定，定性，载体构建及修饰中(Wang TT et al 1997)。不同 的 研究者得到的质粒检测结果也不同。造成这个差异的关键在于不同的质粒提取方法。同时菌 种来源不同也是一个方面。而Ruiz-Barba(Ruiz-Barba, et al 1991) 等在35株来自于橄榄 的乳杆菌中均发现有不同大小的质粒存在。其中许多质粒的分子量较以前发现的要大得多。 而分离自鸡，小鼠肠道内的乳杆菌株，质粒阳性菌株却较少(Lin & Savage 1985: Posno, P ers. Comm)。质粒也极少在L.bulgarious中发现(Chassy,pers. Comm)。但L.burgarious 10 (Culture Collection aat North Carolina State University)和L.burgarious M-878 (Me iji Institute of Health Science, Japan)看来却是个例外(Chagneaud, et al 1992, Sas akii pers Comm)。由于乳杆菌中大部分质粒尤其是小质粒均属隐蔽型的，因此对质粒的功 能知之甚少。大多数的乳杆菌质粒表现出了分离稳定性，尤其是小的隐性质粒较大质粒更加 相对稳定。现已有多种乳杆菌质粒被提出及鉴定，如来自L.plantarum的pLB4(Bates & Glbe t 1989),pC30il(Skaugen 1989),pLD1(Bouia et al 1989), p8014-2(Leer et al 1992)和p A1(Vujcic & Topisirovic 1993);来自L.pentosus的p353-2(Leer, et al 1992);来自L.hel veticus的pLJ1(Takiguchi et al 1989)和来自L.hilgaraelii的pLAB1000(Josson et al 19 90)。质粒的大小都非常相似，在1.9-3.5kb。除了pLJ1外，所有质粒均具有一个与革兰氏 阳 性细菌分离(Takiguchi et al 1989)和来自L.hilgaraelii的pLAB1000(Josson et al 1990) 。质粒的大小都非常相似，在1.9-3.5kb。除了pLJ1外，所有质粒均具有一个与革兰氏阳 性细菌分离出的质粒相似的复制蛋白(Rep)。而且乳杆菌中的小质粒是以滚环形式进行复制 的(RCR)。对乳杆菌质粒特点的归纳请详见表1。
, 百拇医药
表1 乳杆菌质粒特点
质粒
Strain
Size(kb)
dos
Mob
pLJ1
L.helveticus
3.3
?
-
pLAB(1000)
L.hilgardii
, http://www.100md.com
3.3
pC194
+
p353-2
L.pentosus
2.4
pC194
-
pA1
L.plantarum
2.8
pE194
-
, http://www.100md.com
pLP1
L.plantarum
2.1
pC194
-
p8014-2
L.plantarum
1.9
pC194
-
pC30il
L.plantarum
, 百拇医药 2.1
pC194
-
pLB4
L.plantarum
3.5
pE194
+
2 乳杆菌质粒载体
研究表明，广泛宿主范围的载体，如乳酸球菌质粒pGK12，可以在许多种类的细菌中进行复 制(Posno et al 1991a)。由此，构建出许多的乳酸杆菌基因转化系统。到目前为止，已构 建了许多携带乳杆菌复制子的质粒载体。这些质粒载体都来自于不同种类乳杆菌小的以滚环 式复制的隐蔽型质粒。载体有携带抗红霉素基因的pE1194,pAMB1,和带有抗绿霉素基因的pA1 94和pBR328。由于乳杆菌本身就具有较强的抗卡那霉素(新霉素)的抗性，因此这类选择标记 不适合应用于此类载体。而且氨苄青霉素的抗性基因同样不适合选用(Shinizu-Kadota.et al 1991)。很多乳杆菌载体，vk pLP825和pLPE323 适用于广泛宿主范围，因而它们可在许多不同种类乳杆菌中进增殖(Posno et al 1991a)。 而且它们在不同种类乳杆菌中的扩增拷贝数并没有 明显不同，这说明其在不同宿主菌中的DNA复制调控机制是相似的。质粒的平均拷贝数为30 ～50/cell。最近，根据θ型质粒pAMB1(Simon & Chopini 1988；O' Sullivan & Klaenhamm er 1993)的复制机制而构建出了一系列乳酸球菌广泛宿主范围载体。它们将有助于在乳杆菌 中进行基因克隆。近来，对载体pLPE323改造后获得一新载体，pLPE23M携带有19个单限制酶 切 位点(附质粒图谱)。应用该载体已成功地在乳杆菌中克隆并超表达了几种蛋白。另一窄宿主 范围的载体也已构建成功，质粒pLUL631分离自L.reuteri携带有红霉素抗性基因，经试验可 在L.reuteri和一株L.fermentum及其他受试的革兰氏阳性菌中复制。与之相仿，一来自L.cr ispatus的3.6kb大小的质粒，只能在它原始的宿主菌中才能复制(Posno pers. comm)。这 一独特的性质对于在食品工业中应用活的重组DNA工程菌有着极为重要的意义。这是因为窄 宿主范围载体与广泛宿主范围载体相比，细菌种间水平传播发生的机会较少，因而更具安全 性。
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Plasmid
replicon
Origin
E>coli DNA
Size(kb)
Mark
Cloning Sites
pLE16
pLB10
L.bulgaricus
pBR328
7.6
, http://www.100md.com
cml
Hind111
pBG10
pLJ1
L.helveticus
pBR329
6.0
lacZ
BamH1.Pst1
p:P3537
p353-2
L.pentosus
, http://www.100md.com
pUC19
6.3
ery
BamHl.Hindlll.Kpn.Pat1.Sph1
pLP317
p353-1
Lpentosus
no
2.9
ery
(Sjph1)
pLP317cop
, 百拇医药
p353-1
L.pentosus
no
2.9
ery
(Sph1)
pLPE323
p353-2
L.pentosus
no
3.6
ery
EcoR1.Xba1
, 百拇医药
p:PE350
p353-2
L.pentosus
**
3.9
ery
Hind111.Kpn1.Pst1.Smal.Sph1
pLEP24Mcop
p353-2
L.pentosus
no
3.7
, 百拇医药
ery
MCS
pLP3537xy1
p353-2
L.pentosus
pUC
6.3
sy1.ery
BanH1.Kpn1.Sma1.Sa11.Sph1
pLP825
p8014-2
L.plantarum
, http://www.100md.com
pBR322
5.8
cm1
Sall.Sph1
pLP82H
p8014-2
L.plantarum
pUC
5.8
ery
BamH1.Sac1.Sph1.Xba1
pLPC37
, 百拇医药
p8014-2
L.plantarum
**
3.7
cml
EcoRV.Sph1
pULP8/9
pLP1
L.plantarum
pUC
6.6
ery
Hind111
, 百拇医药
pSC10
L.plantarum
no
3.0
ery
pPSC20
L.plantarum
no
5.5
cml.ery
pPSC22
L.plantarum
, 百拇医药 no
4.3
cml.ery
pLUL634
pLUL631
L.reuteri
no
5.1
ery
Clal.Hpal
对于长期从事微生态学研究，尤其是从事益生菌与益生素研究与开发的同仁，大家都会 有这 样一个共识，对正常菌群的研究已经进入而且必须深入到分子和基因水平上，这样才能更明 确地揭示其代谢及生理作用的机制，并且在基因水平上进行遗传性状的改善。从而研制开发 出更为优良的益生菌基因工程菌。可喜的是这一方面的研究已取得了很大进展。今后对于益 生菌分子生物学的研究及益生菌基因工程菌的开发和利用将是一个十分重要的研究方向。
, 百拇医药
作者简介：易庆(1969～)，女，大连医科大学微生态教研室讲师，现在大连理工大学化工学院读
博士，从事微生态结合分子生物的理论和技术研制及微生态系列制剂研究。
作者单位：易 庆 大连理工大学化工学院，116012
王关林 辽宁省植物生物工程重点实验室，大连 116029
方宏筠 辽宁省植物生物工程重点实验室，大连 116029
参考文献
[1]Ahrne S,Molin G and Axelsson L.Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631.Curr Microbiol 1992,24:199～205.
, 百拇医药
[2]Chagnaud P,et al.Construction of a new shuttle vector for Lactobacillus.Can J Microbiol,1992,38:69～74.
[3]Hammes WP,et al.The potential of Lactic acid bacterila for the production of safe and wholesome food.Z Lebensm Unters Forsch,1994 Mar,198(3):193～201.
[4]Hashiba H,et al.Establishment of a host-vector system in Lactobaci llus helveticus with β-galactosedase activity as a selection marker.Biosci Biotechnol Biochem,1992,50:190～194.
, 百拇医药
[5]Ho NW,et al.Genetivally engineered Sacchaaromyces yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose.Appl Environ Microbiol,1998 Ma y,64(5):1852～1859.
[6]Leer RJ,et al.Structural and functional analysis of two cryptic plasmids from Lactobacillus pentosus MD353 and Lactobacllus plantarum ATCC8014.Mol Gen Genet,1992,234:264～274.
[7]Morlon-Gutyot J,et al.Lactobacillus manihotivorans.sp.nov.,a new starch hydrolysing lactic acid bacteriun isolated during cassava sour starch fermentation.Int J syot Bacteriol,1998 Oct,48pt4:1101～1109.
, 百拇医药
[8]O'Sullivan DJ and Klaenhammer TR.High and low copy number Lactococc us shuttle cloning vectors with fecture for clone selection.Submitted,1993.
[9]Okafor N,et al.Improvement of garri puality by the inoculation of microorganisms into cassava mash.Int.J Food Microbiol,1998 Mar 3,40(1-2():43～49.
[10]Okafor N,et al.Secretion of lysine in a broth medium by lactic bacteria and yeasts associated with garri production using a synthetic gene.Lett Appl Microbial,1999 Junk 28(6) 419～422.
, 百拇医药
[11]Pouwels PH,et al.The potential of Lactobacillus as a carrier for oral immunization,development and preliminary characterization of vector system for targeted delivery of antigens.J Biotechnol,1996 Jan,26k44(1-3):183～192.
[12]Vujcic M and Topisirovie L.Molecular analysis of the rolling circle replicating plasmid pA1 of Lactobacillus plantarum A112.Appl Environ Microbiol,[13]Wang TT,et al.Plasmid in Lactobacillus.Crit Rev Biotechnol,1997,17(3):227～272., http://www.100md.com
关键词：乳酸杆菌 基因工程 质粒载体系统
几个世纪以来，乳杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品及 饮料加工业 ，其生物学特性为棒状，厌氧或微需氧，属非致病菌。以乳杆菌作为发酵菌的食品工业所创 造出的经济价值占全球总的发酵类食品的20%。同时乳杆菌也被广泛用于肠、肉类食品的加 工和保鲜。乳杆菌通过重建肠道菌群平衡，从而有利于人类及某些动物宿主恢复并提高健康 状态。对于其发挥作用的机制现已研究得较为明确，主要有以下几个方面：1)控制肠道感染 。2)增加某些食物的营养价值。3)控制血清胆固醇水平。4)改善乳糖代谢。5)诱导体内特异 性及非特异性免疫。6)抗肿瘤活性。
乳杆菌具有十分重要的生理作用及经济价值，因此近几十年来已广泛开展了对其定性、筛选 、代谢、生理学及基因方面的研究，尤其是应用基因工程手段已将研究由原来的重点定性分 类阶段转移到稳定转化及改善乳杆菌生物学性状的重点上来。根据一系列复制子构建的 具广 泛宿主范围的质粒载体系统已十分成功地转化乳酸菌并表达内源及外源基因。但是与医药微 生物基因工程研究相比，乳酸杆菌基因工程进展较慢，为有利于该项基因工程的发展和产业 化作者综述如下。
, 百拇医药
1 乳酸杆菌质粒
乳酸杆菌的许多种类中均发现有质粒的存在。最早在1976年由Chassy及基同事发现的。分离 得到的质粒来源于植物、肉类、青储饲料，发酵生面及消化道。从研究中发现，很多种类的 乳 杆菌均具有一个或多个质普。Wang TT等研究发现约有38%的乳酸杆菌中含有大小不等的质粒 ，约在1.2-150kb之间。且数量各异，1个或多个。这些小的质粒同其他革兰氏阳性菌的线 型 质粒具有高度的相似性。一些乳杆菌质粒复制子具有广泛宿主范围，因而可在其他种类的革 兰氏阳性菌及大肠杆菌中发挥作用。但大多数乳杆菌质粒均为隐弊型。但有些质粒编码功能 已 经明确，并已应用于乳杆菌的鉴定，定性，载体构建及修饰中(Wang TT et al 1997)。不同 的 研究者得到的质粒检测结果也不同。造成这个差异的关键在于不同的质粒提取方法。同时菌 种来源不同也是一个方面。而Ruiz-Barba(Ruiz-Barba, et al 1991) 等在35株来自于橄榄 的乳杆菌中均发现有不同大小的质粒存在。其中许多质粒的分子量较以前发现的要大得多。 而分离自鸡，小鼠肠道内的乳杆菌株，质粒阳性菌株却较少(Lin & Savage 1985: Posno, P ers. Comm)。质粒也极少在L.bulgarious中发现(Chassy,pers. Comm)。但L.burgarious 10 (Culture Collection aat North Carolina State University)和L.burgarious M-878 (Me iji Institute of Health Science, Japan)看来却是个例外(Chagneaud, et al 1992, Sas akii pers Comm)。由于乳杆菌中大部分质粒尤其是小质粒均属隐蔽型的，因此对质粒的功 能知之甚少。大多数的乳杆菌质粒表现出了分离稳定性，尤其是小的隐性质粒较大质粒更加 相对稳定。现已有多种乳杆菌质粒被提出及鉴定，如来自L.plantarum的pLB4(Bates & Glbe t 1989),pC30il(Skaugen 1989),pLD1(Bouia et al 1989), p8014-2(Leer et al 1992)和p A1(Vujcic & Topisirovic 1993);来自L.pentosus的p353-2(Leer, et al 1992);来自L.hel veticus的pLJ1(Takiguchi et al 1989)和来自L.hilgaraelii的pLAB1000(Josson et al 19 90)。质粒的大小都非常相似，在1.9-3.5kb。除了pLJ1外，所有质粒均具有一个与革兰氏 阳 性细菌分离(Takiguchi et al 1989)和来自L.hilgaraelii的pLAB1000(Josson et al 1990) 。质粒的大小都非常相似，在1.9-3.5kb。除了pLJ1外，所有质粒均具有一个与革兰氏阳 性细菌分离出的质粒相似的复制蛋白(Rep)。而且乳杆菌中的小质粒是以滚环形式进行复制 的(RCR)。对乳杆菌质粒特点的归纳请详见表1。
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表1 乳杆菌质粒特点
质粒
Strain
Size(kb)
dos
Mob
pLJ1
L.helveticus
3.3
?
-
pLAB(1000)
L.hilgardii
, http://www.100md.com
3.3
pC194
+
p353-2
L.pentosus
2.4
pC194
-
pA1
L.plantarum
2.8
pE194
-
, http://www.100md.com
pLP1
L.plantarum
2.1
pC194
-
p8014-2
L.plantarum
1.9
pC194
-
pC30il
L.plantarum
, 百拇医药 2.1
pC194
-
pLB4
L.plantarum
3.5
pE194
+
2 乳杆菌质粒载体
研究表明，广泛宿主范围的载体，如乳酸球菌质粒pGK12，可以在许多种类的细菌中进行复 制(Posno et al 1991a)。由此，构建出许多的乳酸杆菌基因转化系统。到目前为止，已构 建了许多携带乳杆菌复制子的质粒载体。这些质粒载体都来自于不同种类乳杆菌小的以滚环 式复制的隐蔽型质粒。载体有携带抗红霉素基因的pE1194,pAMB1,和带有抗绿霉素基因的pA1 94和pBR328。由于乳杆菌本身就具有较强的抗卡那霉素(新霉素)的抗性，因此这类选择标记 不适合应用于此类载体。而且氨苄青霉素的抗性基因同样不适合选用(Shinizu-Kadota.et al 1991)。很多乳杆菌载体，vk pLP825和pLPE323 适用于广泛宿主范围，因而它们可在许多不同种类乳杆菌中进增殖(Posno et al 1991a)。 而且它们在不同种类乳杆菌中的扩增拷贝数并没有 明显不同，这说明其在不同宿主菌中的DNA复制调控机制是相似的。质粒的平均拷贝数为30 ～50/cell。最近，根据θ型质粒pAMB1(Simon & Chopini 1988；O' Sullivan & Klaenhamm er 1993)的复制机制而构建出了一系列乳酸球菌广泛宿主范围载体。它们将有助于在乳杆菌 中进行基因克隆。近来，对载体pLPE323改造后获得一新载体，pLPE23M携带有19个单限制酶 切 位点(附质粒图谱)。应用该载体已成功地在乳杆菌中克隆并超表达了几种蛋白。另一窄宿主 范围的载体也已构建成功，质粒pLUL631分离自L.reuteri携带有红霉素抗性基因，经试验可 在L.reuteri和一株L.fermentum及其他受试的革兰氏阳性菌中复制。与之相仿，一来自L.cr ispatus的3.6kb大小的质粒，只能在它原始的宿主菌中才能复制(Posno pers. comm)。这 一独特的性质对于在食品工业中应用活的重组DNA工程菌有着极为重要的意义。这是因为窄 宿主范围载体与广泛宿主范围载体相比，细菌种间水平传播发生的机会较少，因而更具安全 性。
, http://www.100md.com
Plasmid
replicon
Origin
E>coli DNA
Size(kb)
Mark
Cloning Sites
pLE16
pLB10
L.bulgaricus
pBR328
7.6
, http://www.100md.com
cml
Hind111
pBG10
pLJ1
L.helveticus
pBR329
6.0
lacZ
BamH1.Pst1
p:P3537
p353-2
L.pentosus
, http://www.100md.com
pUC19
6.3
ery
BamHl.Hindlll.Kpn.Pat1.Sph1
pLP317
p353-1
Lpentosus
no
2.9
ery
(Sjph1)
pLP317cop
, 百拇医药
p353-1
L.pentosus
no
2.9
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(Sph1)
pLPE323
p353-2
L.pentosus
no
3.6
ery
EcoR1.Xba1
, 百拇医药
p:PE350
p353-2
L.pentosus
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Hind111.Kpn1.Pst1.Smal.Sph1
pLEP24Mcop
p353-2
L.pentosus
no
3.7
, 百拇医药
ery
MCS
pLP3537xy1
p353-2
L.pentosus
pUC
6.3
sy1.ery
BanH1.Kpn1.Sma1.Sa11.Sph1
pLP825
p8014-2
L.plantarum
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pBR322
5.8
cm1
Sall.Sph1
pLP82H
p8014-2
L.plantarum
pUC
5.8
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BamH1.Sac1.Sph1.Xba1
pLPC37
, 百拇医药
p8014-2
L.plantarum
**
3.7
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EcoRV.Sph1
pULP8/9
pLP1
L.plantarum
pUC
6.6
ery
Hind111
, 百拇医药
pSC10
L.plantarum
no
3.0
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pPSC20
L.plantarum
no
5.5
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pPSC22
L.plantarum
, 百拇医药 no
4.3
cml.ery
pLUL634
pLUL631
L.reuteri
no
5.1
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Clal.Hpal
对于长期从事微生态学研究，尤其是从事益生菌与益生素研究与开发的同仁，大家都会 有这 样一个共识，对正常菌群的研究已经进入而且必须深入到分子和基因水平上，这样才能更明 确地揭示其代谢及生理作用的机制，并且在基因水平上进行遗传性状的改善。从而研制开发 出更为优良的益生菌基因工程菌。可喜的是这一方面的研究已取得了很大进展。今后对于益 生菌分子生物学的研究及益生菌基因工程菌的开发和利用将是一个十分重要的研究方向。
, 百拇医药
作者简介：易庆(1969～)，女，大连医科大学微生态教研室讲师，现在大连理工大学化工学院读
博士，从事微生态结合分子生物的理论和技术研制及微生态系列制剂研究。
作者单位：易 庆 大连理工大学化工学院，116012
王关林 辽宁省植物生物工程重点实验室，大连 116029
方宏筠 辽宁省植物生物工程重点实验室，大连 116029
参考文献
[1]Ahrne S,Molin G and Axelsson L.Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631.Curr Microbiol 1992,24:199～205.
, 百拇医药
[2]Chagnaud P,et al.Construction of a new shuttle vector for Lactobacillus.Can J Microbiol,1992,38:69～74.
[3]Hammes WP,et al.The potential of Lactic acid bacterila for the production of safe and wholesome food.Z Lebensm Unters Forsch,1994 Mar,198(3):193～201.
[4]Hashiba H,et al.Establishment of a host-vector system in Lactobaci llus helveticus with β-galactosedase activity as a selection marker.Biosci Biotechnol Biochem,1992,50:190～194.
, 百拇医药
[5]Ho NW,et al.Genetivally engineered Sacchaaromyces yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose.Appl Environ Microbiol,1998 Ma y,64(5):1852～1859.
[6]Leer RJ,et al.Structural and functional analysis of two cryptic plasmids from Lactobacillus pentosus MD353 and Lactobacllus plantarum ATCC8014.Mol Gen Genet,1992,234:264～274.
[7]Morlon-Gutyot J,et al.Lactobacillus manihotivorans.sp.nov.,a new starch hydrolysing lactic acid bacteriun isolated during cassava sour starch fermentation.Int J syot Bacteriol,1998 Oct,48pt4:1101～1109.
, 百拇医药
[8]O'Sullivan DJ and Klaenhammer TR.High and low copy number Lactococc us shuttle cloning vectors with fecture for clone selection.Submitted,1993.
[9]Okafor N,et al.Improvement of garri puality by the inoculation of microorganisms into cassava mash.Int.J Food Microbiol,1998 Mar 3,40(1-2():43～49.
[10]Okafor N,et al.Secretion of lysine in a broth medium by lactic bacteria and yeasts associated with garri production using a synthetic gene.Lett Appl Microbial,1999 Junk 28(6) 419～422.
, 百拇医药
[11]Pouwels PH,et al.The potential of Lactobacillus as a carrier for oral immunization,development and preliminary characterization of vector system for targeted delivery of antigens.J Biotechnol,1996 Jan,26k44(1-3):183～192.
[12]Vujcic M and Topisirovie L.Molecular analysis of the rolling circle replicating plasmid pA1 of Lactobacillus plantarum A112.Appl Environ Microbiol,[13]Wang TT,et al.Plasmid in Lactobacillus.Crit Rev Biotechnol,1997,17(3):227～272., http://www.100md.com