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编号:10494172
早期慢性肾衰大鼠残余肾维生素D受体和28ku钙结合蛋白的表达
http://www.100md.com 南京医科大学学报 2000年第5期第20卷 论著
     作者:孙彬 王笑云 彭韬 周富华 赵卫红 赵秀芬

    单位:孙彬 王笑云 赵卫红 赵秀芬(南京医科大学第一附属医院肾内科);彭韬(病理学教研室,南京 210029);周富华(南京医科大学第二附属医院肾内科,南京 210011)

    关键词:慢性肾功能衰竭;甲状旁腺功能亢进症;继发性;维生素D受体;钙结合蛋白

    南京医科大学学报000506

    摘 要 目的 1,25(OH)2D3、钙代谢紊乱是慢性肾衰继发性甲状旁腺功能亢进症(SHPT)的主要原因,它们分别与维生素D受体(VDR)、28ku钙结合蛋白(CaBP-D28k)结合而发挥作用,通过观察5/6肾切除大鼠残余肾VDR、CaBP-D28k表达,探讨其在早期SHPT中的作用。方法 采用免疫组化ABC法观察5/6肾切除大鼠残余肾VDR、CaBP-D28K蛋白阳性表达。结果 慢性肾功能衰竭(CRF)大鼠血清全段甲状旁腺素水平增高,肾小管CaBP-D28K阳性率明显增加,而VDR表达无明显改变。结论 早期CRF已有SHPT表现,残余肾CaBP-D28K表达增强可能为纠正CRF钙、磷代谢紊乱的代偿机制之一。
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    中图号 R582.1; R-33

    Expression of VDR and CaBP-D28K in the Kidney Tissue of Subtotally Nephrectomized Rats (5/6) in Experimental Uremia

    Sun Bin, Wang Xiaoyun, Pong Tao,et al.

    (Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)

    Abstract Objective 1,25(OH)2D3 and Ca2+ are critical to the pathogenesis of secondary hyperparathyroidism (SHPT). Their actions are mediated through binding to vitamin D receptor (VDR) and Ca2+-binding protein (CaBP-D) of cells. Methods The expression of VDR and CaBP-D28K in the kidney tissue of subtotally nephrectomized rats (5/6) in experimental uremia with SHPT were detected by immunohistochemistry. Results Serum intact PTH levels in 5/6 NX rats were significantly higher than controls [(40.85±5.22)×10-9 g/L vs (25.15±4.24)×10-9 g/L, P<0.01)]. The expression of CaBP-D28K was more increased in NX group than the control. However, the density of VDR in the kidney of NX rats was same as the sham-operated rats. Conclusion These results suggested that SHPT may occur in earlytage of renal failure and the increased expression of CaBP-D28K may play a role to maintain metabolic balance of calcium, phosphorus.
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    Key words chronic renal failure; hyperparathyroidism, secondary; vitamin D receptor; CaBP-D28K

    继发性甲状旁腺功能亢进症(SHPT)是慢性肾功能衰竭(CRF)的严重并发症之一。高磷、低钙和1,25(OH)2D3缺乏都可直接或间接地引起全段甲状旁腺素(i-PTH)分泌增加,但只有严重的进行性CRF时血磷、钙和1,25(OH)2D3水平才会发生明显的变化。CRF早期三者变化及相互之间的关系文献报道不一致,尚无肯定的结论,提示高磷、低钙血症和1,25(OH)2D3缺乏均非CRF早期必有的症状[1]。在CRF早期动物实验三者关系的研究中,人们多关注磷、钙和1,25(OH)2D3对甲状旁腺、肠和骨等靶器官的作用,而对残余肾肾小管1,25(OH)2D3相关蛋白的作用研究较少。因此,我们采用免疫组化方法研究维生素D受体(VDR)、28ku钙结合蛋白(CaBP-D28K)表达改变在早期SHPT中的作用。
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    1 材料和方法

    1.1 CRF动物模型制备

    6周龄雄性SD大鼠,体质量210~250 g,购于南京医科大学动物实验中心。鼠饲料亦由该中心提供,其成分约含:0.85%钙,0.6%磷以及1 000 IU/kg维生素D。大鼠分为两组:CRF组(n=6),采用两步法切除大鼠5/6肾脏[2];假手术对照组(n=6),手术程序相同,但保留双肾。术后予以自由饮水和饮食,饲养10周后全部大鼠置代谢笼收集24 h尿量,次日在1%戊巴比妥腹腔内注射麻醉后取出肾脏并采血,肾脏立即置于4%多聚甲醛固定,24 h后常规石蜡包埋,苏木精-伊红染色。

    1.2 血清及尿液生化检测

    手术前后于眼眶内眦静脉丛采血,每次约0.5 ml。血标本离心取血清待测。尿标本测24 h尿量,离心2 000 r/min,10 min后取上清待测。用自动生化分析仪检测碱性磷酸酶(ALP)、钙、磷以及血、尿肌酐。采用放免法测定i-PTH水平。内生肌酐清除率(Ccr)按标准公式计算。
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    1.3 VDR、CaBP-D28K免疫组化

    切片使用3′-氨丙基三乙氧硅烷(APES)作为粘附剂,厚度4 μm。烤箱60℃,1 h。常规脱蜡至水,柠檬酸盐缓冲液中经微波行抗原修复,免疫组化采用ABC法,DAB显色。大鼠抗人VDR(Chemicon公司,USA)、CaBP-D28K(Sigma公司)用时1∶100 PBS稀释。阳性对照片采用乳腺癌组织。同时作苏木精-伊红切片。VDR采用每例随机选择20个视野(×400),在光镜下计数肾小管上皮细胞阳性百分率。CaBP-D28K采用每例随机选择20个视野(×400),计数残余肾脏肾小管阳性百分率。

    1.4 统计学处理

    所有数据均采用均数±标准差表示,并经t检验作统计学处理。

    2 结 果
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    2.1 血清及尿液生化检测结果

    10周后CRF组大鼠Ccr比假手术组下降近一半,分别为(5.28±1.21) ml/(min.kg)、(2.85±0.57) ml/(min.kg),P<0.001;CRF组血清ALP明显升高,分别为(395.3±156.51)、(190±40.49) IU/L(P<0.05);血清钙亦升高,分别为(2.53±0.15)、(2.04±0.21) mmol/L(P<0.01);而磷则无明显变化,分别为(2.46±0.49)、(2.41±0.26) mmol/L(P>0.05);血清i-PTH水平:CRF组为(40.85±5.22)×109 g/L,比假手术组(25.15±4.24)×109 g/L明显升高(P<0.10),约1.62倍,表明SHPT处于早期。

    2.2 大鼠残余肾VDR、CaBP-D28K表达
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    VDR表达结果:VDR主要表达于大鼠肾脏近端肾小管、远端肾小管细胞核,呈棕黄染色。本文主要计数肾小管上皮细胞核阳性率。CRF组阳性率为(96.82±0.53)%,假手术组为(96.52±0.62)%,两者统计学差异无显著性(P>0.05)。

    CaBP-D28K表达结果:CaBP-D28K分布于大鼠远端肾小管和集合管上皮细胞,在细胞质、细胞核中表达,细胞膜不表达。CRF组大鼠肾脏平均每高倍视野肾小管CaBP-D28K率为(53.33±6.84)%(图1,见封三),而假手术组为(41.57±5.67)%(图2,见封三),两者相比较有统计学差异(P<0.01)。

    3 讨 论

    本研究发现5/6肾切除大鼠组较假手术组Ccr下降约46%,表明CRF已经形成,而此时血清i-PTH比假手术组升高约1.62倍,提示SHPT处于早期。5/6肾切除大鼠随着健存肾单位减少,近端肾小管细胞线粒体1α-羟化酶活性也降低,1,25(OH)2D3合成则减少,导致PTH基因转录和分泌增加。CRF未出现磷潴留、低钙血症,但出现高钙血症。Llach[1]指出:在“矫枉失衡”学说基础上,引起PTH过度分泌的原因众多,包括磷潴留、维生素D代谢改变、钙调定点损害、PTH代谢改变、VDR和钙受体(CaR)降低、降钙素升高、PTH受体抵抗(受体下调)等。因而磷、钙和1,25(OH)2D3的改变可能通过其他的机制导致SHPT。
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    CaBP-D9K、CaBP-D28K是依赖于1,25(OH)2D3作用的钙结合蛋白(CaBP),和钙调素同属于CaBP家族,肠、肾脏的CaBP在CRF进展时增加钙重吸收以维持内环境Ca2+稳定。肾脏CaBP-D28K的功能及作用机制尚未完全阐明,但主要功能包括:促进钙转运和某些酶的激活,如ALP、Ca2+-Mg2+ ATP酶等[3]。Bouthiauy等[4]报道,在体外CaBP-D28K通过细胞膜蛋白-蛋白间的相互作用增加Ca2+重吸收,这种作用不需要信使、激酶、ATP或GTP的存在,Nitrendipine不能阻断它,因而CaBP-D28K可直接调节Ca2+转运。本实验表明大鼠CaBP-D28K表达于肾脏远端肾小管、集合管细胞质和细胞核上,而且在CRF组大鼠残余肾阳性率明显增高,说明其可能促进残余肾Ca2+重吸收,可部分解释CRF早期大鼠血钙的升高;此外,低钙、PTH和低磷各自可直接刺激远端肾小管1-羟化酶活性从而增加1,25(OH)2D3合成,1,25(OH)2D3增加肠钙吸收并促进骨和软组织钙动员,从而维持血钙稳定。因此,CRF大鼠血钙升高也可能是由于PTH升高促进钙重吸收或激活骨细胞动员骨钙入血。
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    1,25(OH)2D3在体内Ca2+平衡中起重要作用,肠、肾、骨等各种靶组织的VDR(可作为转录因子)与1,25(OH)2D3结合后经基因组作用增加各种基因的表达,如CaBP-D9K、CaBP-D28K、24-羟化酶及VDR本身等。我们使用VDR单抗(1-165)显示大鼠肾脏近端肾小管、远端肾小管细胞核表达VDR抗原,与Kumar等[5]的结果相似,但该作者用多克隆抗体(2-165)发现在肾脏近端肾小管VDR主要表达于细胞质,提示可能存在其他作用方式,如非基因组作用(经细胞膜介导)。本研究采用免疫组化方法,结果表明残余肾肾小管细胞VDR表达无明显改变,可能原因是大鼠采用正常1,25(OH)2D3饮食,血1,25(OH)2D3水平不升高;同时CRF处于早期,未出现低钙血症、磷潴留;由于生理状况下1,25(OH)2D3上调各组织(肠、骨、肾、甲状旁腺等)VDR mRNA和蛋白表达[6],故此时不足以发生VDR表达改变。
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    综上所述,CRF早期大鼠i-PTH明显升高,肾脏VDR表达尚无明显改变,亦未出现高磷血症、低钙血症,相反却出现高钙血症。CaBP-D28K增高可能为纠正慢性肾衰钙、磷代谢紊乱的代偿机制之一。进一步研究CaBP-D28K和VDR的作用对临床防治SHPT可能有一定的意义。

    图1 CRF组大鼠肾脏CaBP-D28k表达明显增强(ABC法,DAB显色×200)

    图2 假手术组大鼠肾计CaBP-D28k表达(ABC法,DAB显色×200)

    江苏省教委科研基金资助项目(No182FA9707)

    参考文献

    1,Llach F. Secondary hyperparathyroidism in renal failure: the Trade-off hypothesis revisited. Am J Kidney Dis, 1995,25:663
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    2,Brakenhoff GJ, Visscher K. Imaging models for bilateral confocal scanning microscopy. J Microsc, 1993,17:17

    3,Gagnon AM, Simboll CM, Welsh JE. Induction of Calbindin-D28K in Madin-Darby bovine kidney cells by 1,25(OH)2D3. Kidney Int, 1994,45:95

    4,Bouthiauy H, Lajeunesse D, Christakos S, et al. Two vitamin D-dependent calcium binding proteins increase calcium reabsorption by different mechanism Ⅰ: effect of CaBP-D28K. Kidney Int, 1994,45:461
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    5,Kumar R, Schaefer J, Grande JP, et al. Immunolocalization of calcitriol receptor, 24-hydroxylase cytochrome P-450, and Calbindin-D28K in human kidney. Am J Physiol, 1994,F477

    6,Farach CM, Riddle AL. Dual 1,25-dihydroxyvitamin D3 signal response pathway in osteoblast: cross-talk between genomic and membrane-initiated pathways. Am J Kidney Dis, 1998,31:729

    (1999-11-09收稿), http://www.100md.com