黄颜木素对HSC-T6细胞增殖和胶原合成的影响
张珉 张俊平 王杰松 钱定华
摘 要 目的：研究黄颜木素对激活的永生型大鼠肝储脂细胞--HSC-T6细胞增殖和胶原合成的影响。方法：细胞增殖采用结晶紫染色法检测，胶原合成采用3H-脯氨酸掺入法分析。结果：黄颜木素(6.25～50.00μmol/L)以剂量依赖方式显著抑制血小板源生长因子(PDGF)刺激的HSC-T6细胞增殖,并抑制转化生长因子β1(TGFβ1)诱导的细胞内胶原合成。结论：黄颜木素具有抑制激活的肝储脂细胞增殖和胶原合成的作用。
关键词：黄颜木素 血小板源生长因子 转化生长因子β 肝硬化
肝纤维化是各种慢性肝病的重要病理转归，其主要特征表现为胶原等细胞外基质成分过度沉积。现已证实肝储脂细胞是细胞外基质的主要产生细胞[1]。肝储脂细胞被激活转染为肌成纤维细胞，后者大量增殖并过度合成胶原等细胞外基质成分。在肝纤维化的发生、发展过程中，血小板源生长因子(PDGF)，转化生长因子β1(TGFβ1)是两个最重要的促纤维化因子。PDGF显著促进激活的肝储脂细胞增殖[2]，而TGFβ1则刺激过度合成胶原[3]。因此寻找有效抑制PDGF和TGFβ1作用的药物对肝纤维化的防治具有重要意义。
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中药皂角刺在临床上常用于治疗乙型肝炎[4]。黄颜木素是从皂角刺木质部分中提取的有效成分，至今其抗肝纤维化作用尚未见报道。本研究以激活的永生型大鼠肝储脂细胞--HSC-T6细胞为靶细胞[5]，以PDGF，TGFβ1为刺激因素，研究黄颜木素对细胞增殖和胶原合成的影响。
1 材料和方法
1.1 试剂 黄颜木素购自Sigma公司，DMEM购自Gibco公司,小牛血清为杭州四季青公司产品。
1.2 细胞增殖 96孔细胞培养板每孔加入1×104个HSC-T6细胞(Friedman赠送)，在37℃CO2孵箱中孵育24h。倾去上清，加入含0.4%小牛血清的DMEM培养液，继续孵育48h。然后加入PDGF与黄颜木素再孵育24h,以结晶紫染色法测定光密度值D(595)[6]。
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1.3 胶原合成 96孔细胞培养板每孔加入3×104个细胞，孵育24h使其生长至融合。加入TGFβ1与黄颜木素和维生素C(50μg/ml)，同时加入3H-脯氨酸7.4kBq，继续孵育48h。细胞用胰酶消化，收集于玻璃纤维纸上，液闪计数仪测Bq值[7]。
1.4 统计学处理 采用t检验判断差异的显著性。
2 结 果
2.1 PDGF对HSC-T6细胞增殖的影响 PDGF1，5，10，20ng/ml与HSC-T6细胞共同孵育24h，D(595)值从对照组的0.63±0.03分别增加到0.65±0.05，0.79±0.03(P<0.05)，0.92±0.06(P<0.01)，0.84±0.03(P<0.01)。10ng/ml时促增殖能力最强。
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2.2 黄颜木素对PDGF刺激的HSC-T6细胞增殖的影响 黄颜木素(6.25～50.00μmol/L)剂量依赖性地抑制PDGF(10ng/ml)刺激的HSC-T6细胞增殖。50.00μmol/L时完全抑制此作用(表1)。
表1 黄颜木素对血小板源生长因子刺激HSC-T6细胞增殖的影响
Tab 1 Effect of fisetin on PDGF- stimulated
proliferation of HSC-T6 cells (n=3, ±s)
Group
Dose
HSC-T6
[D(595)]
, 百拇医药
ρB/ng·ml-1
cB/μmol·L-1
Control
0.63±0.03
PDGF
10
0.89±0.05
Fisetin
6.25
0.82±0.05
12.50
, http://www.100md.com
0.72±0.04*
25.00
0.67±0.06**
50.00
0.62±0.04**
*P<0.05,**P<0.01 vs PDGF group 2.3 TGFβ1对HSC-T6细胞胶原合成的影响 TGFβ11，2，4，8ng/ml与HSC-T6细胞共孵育48h，Bq值从对照组的195±8分别变化为192±19，380±10(P<0.01)，321±23(P<0.01)，285±26(P<0.01)。2ng/ml时刺激胶原合成能力最强。
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2.4 黄颜木素对TGFβ1刺激的HSC-T6细胞胶原合成的影响 黄颜木素(6.25～50.00μmol/L)与细胞共同孵育48h，剂量依赖性地抑制TGFβ1(2ng/ml)刺激的HSC-T6细胞胶原合成(表2)。
表2 黄颜木素对转化生长因子β1刺激HSC-T6细胞胶原合成的影响
Tab 2 Effect of fisetin on TGFβ1-stimulated
collagen synthesis of HSC-T6 cells (n=3, ±s)
Group
Dose
Collagen
, http://www.100md.com
(A/Bq)
ρB/ng·ml-1
cB/μmol·L-1
Control
195±8
TGFβ1
2
346±4
Fisetin
6.25
368±44
, 百拇医药
12.50
283±37*
25.00
220±8**
50.00
183±31**
*P<0.05,**P<0.01 vs TGFβ1 group 3 讨 论
原代分离培养肝储脂细胞是一项费时、费力、耗资较大的工作。而HSC-T6细胞是一个激活的永生型大鼠肝储脂细胞株，具有稳定的形态和细胞生物学特性[5]。若可用HSC-T6细胞替代分离培养激活的肝储脂细胞，则可使实验简便易行。本研究结果表明，PDGF显著促进HSC-T6细胞增殖，TGFβ1显著提高HSC-T6细胞胶原合成，与分离培养激活的肝储脂细胞的作用相似[2，3]，提示用HSC-T6细胞替代分离培养激活的肝储脂细胞进行研究是可行的。
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本文首次报道黄颜木素剂量依赖性地抑制PDGF诱导的激活的肝储脂细胞增殖，并抑制TGFβ1诱导的胶原合成。PDGF诱导的激活的肝储脂细胞增殖与TGFβ1诱导的胶原合成是肝纤维化发生、发展的两个关键环节，黄颜木素在这两个关键环节上具双重抑制作用。结果提示黄颜木素具有抗肝纤维化作用。由于黄颜木素具有多种生物学活性，其具体作用机制尚有待进一步探讨。
致 谢 感谢Friedman博士惠赠HSC-T6细胞。
* 国家自然科学基金资助项目，批准号 39670837
作者简介：张 珉，女，1972年5月生，硕士生
作者单位 张 珉 张俊平 王杰松 钱定华 第二军医大学药学院生化药学教研室，上海，200433
参考文献
, 百拇医药
1 Alcolado R, Arthur MJP, Iredale JP. Pathogenesis of liver fibrosis. C lin Sci，1997, 92(2): 103
2 Pinzani M, Gesualdo L, Sabbah GM, et al. Effects of platelet-derived growth factor and other polypeptide mitogens on DNA synthesis and growth of cultured rat liver fat-storing cells. J Clin Invest，1989, 84(6):1786
3 Czaja MJ, Weiner FR, Flanders KC, et al. In vitro and in vivo ass ociation of transforming growth factor beta-1 with hepatic fibrosis. J Cell Bio l, 1989, 108(6):2477
, http://www.100md.com
4 阴 建 主编. 中药现代研究与临床应用(3). 北京：中国古籍出版社，1997.133
5 Friedman SL, Lalazar A, Wong L, et al. HSC-T6 cells, an immortalized rat hepatic stellate cell line. Hepatology, 1997， 27(5): 338A
6 张俊平，胡振林，冯增辉，等. 水飞蓟宾对小鼠肝脏炎症损伤和肿瘤坏死因子的产生及活性的影响. 药学学报，1996，31(8)：577
7 Liu Hai-Lin, Lu Han-Ming, Li Ding-Guo, et al. E ffects of tetrandrine and chlorpromazine on synthesis of collagen and hyaluronic acid in cultured human lung fibroblasts. Acta Pharmacologica Sinica, 1995, 16 (5): 412, 百拇医药
摘 要 目的：研究黄颜木素对激活的永生型大鼠肝储脂细胞--HSC-T6细胞增殖和胶原合成的影响。方法：细胞增殖采用结晶紫染色法检测，胶原合成采用3H-脯氨酸掺入法分析。结果：黄颜木素(6.25～50.00μmol/L)以剂量依赖方式显著抑制血小板源生长因子(PDGF)刺激的HSC-T6细胞增殖,并抑制转化生长因子β1(TGFβ1)诱导的细胞内胶原合成。结论：黄颜木素具有抑制激活的肝储脂细胞增殖和胶原合成的作用。
关键词：黄颜木素 血小板源生长因子 转化生长因子β 肝硬化
肝纤维化是各种慢性肝病的重要病理转归，其主要特征表现为胶原等细胞外基质成分过度沉积。现已证实肝储脂细胞是细胞外基质的主要产生细胞[1]。肝储脂细胞被激活转染为肌成纤维细胞，后者大量增殖并过度合成胶原等细胞外基质成分。在肝纤维化的发生、发展过程中，血小板源生长因子(PDGF)，转化生长因子β1(TGFβ1)是两个最重要的促纤维化因子。PDGF显著促进激活的肝储脂细胞增殖[2]，而TGFβ1则刺激过度合成胶原[3]。因此寻找有效抑制PDGF和TGFβ1作用的药物对肝纤维化的防治具有重要意义。
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中药皂角刺在临床上常用于治疗乙型肝炎[4]。黄颜木素是从皂角刺木质部分中提取的有效成分，至今其抗肝纤维化作用尚未见报道。本研究以激活的永生型大鼠肝储脂细胞--HSC-T6细胞为靶细胞[5]，以PDGF，TGFβ1为刺激因素，研究黄颜木素对细胞增殖和胶原合成的影响。
1 材料和方法
1.1 试剂 黄颜木素购自Sigma公司，DMEM购自Gibco公司,小牛血清为杭州四季青公司产品。
1.2 细胞增殖 96孔细胞培养板每孔加入1×104个HSC-T6细胞(Friedman赠送)，在37℃CO2孵箱中孵育24h。倾去上清，加入含0.4%小牛血清的DMEM培养液，继续孵育48h。然后加入PDGF与黄颜木素再孵育24h,以结晶紫染色法测定光密度值D(595)[6]。
, http://www.100md.com
1.3 胶原合成 96孔细胞培养板每孔加入3×104个细胞，孵育24h使其生长至融合。加入TGFβ1与黄颜木素和维生素C(50μg/ml)，同时加入3H-脯氨酸7.4kBq，继续孵育48h。细胞用胰酶消化，收集于玻璃纤维纸上，液闪计数仪测Bq值[7]。
1.4 统计学处理 采用t检验判断差异的显著性。
2 结 果
2.1 PDGF对HSC-T6细胞增殖的影响 PDGF1，5，10，20ng/ml与HSC-T6细胞共同孵育24h，D(595)值从对照组的0.63±0.03分别增加到0.65±0.05，0.79±0.03(P<0.05)，0.92±0.06(P<0.01)，0.84±0.03(P<0.01)。10ng/ml时促增殖能力最强。
, http://www.100md.com
2.2 黄颜木素对PDGF刺激的HSC-T6细胞增殖的影响 黄颜木素(6.25～50.00μmol/L)剂量依赖性地抑制PDGF(10ng/ml)刺激的HSC-T6细胞增殖。50.00μmol/L时完全抑制此作用(表1)。
表1 黄颜木素对血小板源生长因子刺激HSC-T6细胞增殖的影响
Tab 1 Effect of fisetin on PDGF- stimulated
proliferation of HSC-T6 cells (n=3, ±s)
Group
Dose
HSC-T6
[D(595)]
, 百拇医药
ρB/ng·ml-1
cB/μmol·L-1
Control
0.63±0.03
PDGF
10
0.89±0.05
Fisetin
6.25
0.82±0.05
12.50
, http://www.100md.com
0.72±0.04*
25.00
0.67±0.06**
50.00
0.62±0.04**
*P<0.05,**P<0.01 vs PDGF group 2.3 TGFβ1对HSC-T6细胞胶原合成的影响 TGFβ11，2，4，8ng/ml与HSC-T6细胞共孵育48h，Bq值从对照组的195±8分别变化为192±19，380±10(P<0.01)，321±23(P<0.01)，285±26(P<0.01)。2ng/ml时刺激胶原合成能力最强。
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2.4 黄颜木素对TGFβ1刺激的HSC-T6细胞胶原合成的影响 黄颜木素(6.25～50.00μmol/L)与细胞共同孵育48h，剂量依赖性地抑制TGFβ1(2ng/ml)刺激的HSC-T6细胞胶原合成(表2)。
表2 黄颜木素对转化生长因子β1刺激HSC-T6细胞胶原合成的影响
Tab 2 Effect of fisetin on TGFβ1-stimulated
collagen synthesis of HSC-T6 cells (n=3, ±s)
Group
Dose
Collagen
, http://www.100md.com
(A/Bq)
ρB/ng·ml-1
cB/μmol·L-1
Control
195±8
TGFβ1
2
346±4
Fisetin
6.25
368±44
, 百拇医药
12.50
283±37*
25.00
220±8**
50.00
183±31**
*P<0.05,**P<0.01 vs TGFβ1 group 3 讨 论
原代分离培养肝储脂细胞是一项费时、费力、耗资较大的工作。而HSC-T6细胞是一个激活的永生型大鼠肝储脂细胞株，具有稳定的形态和细胞生物学特性[5]。若可用HSC-T6细胞替代分离培养激活的肝储脂细胞，则可使实验简便易行。本研究结果表明，PDGF显著促进HSC-T6细胞增殖，TGFβ1显著提高HSC-T6细胞胶原合成，与分离培养激活的肝储脂细胞的作用相似[2，3]，提示用HSC-T6细胞替代分离培养激活的肝储脂细胞进行研究是可行的。
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本文首次报道黄颜木素剂量依赖性地抑制PDGF诱导的激活的肝储脂细胞增殖，并抑制TGFβ1诱导的胶原合成。PDGF诱导的激活的肝储脂细胞增殖与TGFβ1诱导的胶原合成是肝纤维化发生、发展的两个关键环节，黄颜木素在这两个关键环节上具双重抑制作用。结果提示黄颜木素具有抗肝纤维化作用。由于黄颜木素具有多种生物学活性，其具体作用机制尚有待进一步探讨。
致 谢 感谢Friedman博士惠赠HSC-T6细胞。
* 国家自然科学基金资助项目，批准号 39670837
作者简介：张 珉，女，1972年5月生，硕士生
作者单位 张 珉 张俊平 王杰松 钱定华 第二军医大学药学院生化药学教研室，上海，200433
参考文献
, 百拇医药
1 Alcolado R, Arthur MJP, Iredale JP. Pathogenesis of liver fibrosis. C lin Sci，1997, 92(2): 103
2 Pinzani M, Gesualdo L, Sabbah GM, et al. Effects of platelet-derived growth factor and other polypeptide mitogens on DNA synthesis and growth of cultured rat liver fat-storing cells. J Clin Invest，1989, 84(6):1786
3 Czaja MJ, Weiner FR, Flanders KC, et al. In vitro and in vivo ass ociation of transforming growth factor beta-1 with hepatic fibrosis. J Cell Bio l, 1989, 108(6):2477
, http://www.100md.com
4 阴 建 主编. 中药现代研究与临床应用(3). 北京：中国古籍出版社，1997.133
5 Friedman SL, Lalazar A, Wong L, et al. HSC-T6 cells, an immortalized rat hepatic stellate cell line. Hepatology, 1997， 27(5): 338A
6 张俊平，胡振林，冯增辉，等. 水飞蓟宾对小鼠肝脏炎症损伤和肿瘤坏死因子的产生及活性的影响. 药学学报，1996，31(8)：577
7 Liu Hai-Lin, Lu Han-Ming, Li Ding-Guo, et al. E ffects of tetrandrine and chlorpromazine on synthesis of collagen and hyaluronic acid in cultured human lung fibroblasts. Acta Pharmacologica Sinica, 1995, 16 (5): 412, 百拇医药