双硫仑的化学稳定性及降解产物
作者：史向国 钟大放 郭继芬 杜宗敏
单位：沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室,沈阳 110015
关键词：双硫仑；稳定性；液相色谱；质谱联用法
沈阳药科大学学报000512 摘 要 利用高效液相色谱法和液相色谱/质谱联用法对双硫仑在溶液中的化学稳定性进行了考察，采用氢化可的松作为内标物，对双硫仑进行定量.方法准确，重现性好.并对其不稳定的因素进行了深入的研究，并确定了最终降解产物.
分类号 R913
The Chemical Stability of Disulfiram and Its Products of Decomposition
Shi Xiangguo，Zhong Dafang，Guo Jifen，Du Zongmin
, http://www.100md.com
(Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract The chemical stability of disulfiram in the liquid was investigated by HPLC and LC/MS in this report. Hydrocortisone was used as the internal standard to determine DSF, the assay method is accurate and reproducible. Furthermore,the unstable reason of DSF was researched and the final decomposition products were identified.
, 百拇医药
Key words disulfiram；stability；LC/MS
双硫仑又叫做戒酒硫(disulfiram,DSF),为亲脂性药物，结构式见图1.由于其能干扰乙醇在体内的代谢，使饮酒者产生不适症状〔1〕，自1948年以来，DSF在欧洲广泛用做戒酒药，主要以片剂口服，稳定性较好.近来,日本研究人员发现,通过眼部给药，双硫仑透过角膜后,可增强生物抗氧能力,在治疗白内障方面具有明显的活性,是一种很有前途的治疗白内障新药〔2，3〕.为使其能顺利通过角膜，将其制成滴眼乳剂和滴眼液，但其在溶液中的化学稳定性不好.作者对其原料药在溶液中的稳定性进行了考察，并且对其降解产物进行了研究.
Fig.1 The structure of disulfiram(DSF)
1 材料与条件
, 百拇医药 1.1 原料与试剂
双硫仑及二乙基二硫代氨基甲酸(diethyldit-hiocarbamic acid,DDC)均由沈阳药科大学药物合成研究室提供；氢化可的松由中国药品生物制品检定所提供；甲醇和乙腈为色谱纯(山东禹王公司试剂厂)；水为重蒸亚沸水；二硫化碳和碘为北京试剂厂生产；维生素E为东北制药总厂生产.
1.2 色谱条件
高效液相色谱仪：LC—10AD泵，SPD—10A紫外检测器，C—R6A积分仪(均为日本岛津公司产品)；色谱柱为Nucleosil C18，5 μm,250 mm×4.6 mmI.D.(德国Macherey-Nagel公司生产)；条件(A)：流动相为甲醇-水(体积比为70∶30),检测波长为254 nm；条件(B)：流动相为甲醇-乙腈-水(体积比为35∶30∶30)，pH=7.5,检测波长为215 nm;流速为1.0 mL/min，进样量50 μL,纸速为2 mm/min.
, 百拇医药
1.3 质谱仪及分析条件
美国Finnigan公司LCQ型液相色谱/质谱联用仪，配有ESI(Electrospray ionization)源以及LCQ 1.2数据处理系统，具有软电离和多级离子阱质谱功能.
电喷雾质谱；正/负离子检测；离子源喷射电压：4.25 kV；毛细管温度：180℃；毛细管电压：+/-6.50 V；鞘气流速：60流量单位(a.u.)；辅助气流速：5 a.u..采用一级全扫描质谱(full scan ms)、选择离子监测(SIM)及二级全扫描质谱(full scan ms2)三种方式同时检测.
2 方法与结果
2.1 标准曲线的制备
分别向6支具塞试管中加入1.5 mL浓度分别为125.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0、5 000.0 ng/mL的DSF标准溶液(甲醇)和50 μL内标溶液(20 μg/mL的氢化可的松甲醇溶液)，在色谱条件(A)下通过HPLC法测定并记录各色谱峰的峰高，以待测物与内标物的峰高比值(Y)对DSF的浓度(C)进行回归计算，色谱图如图2所示.结果表明DSF在125.0～5 000 ng/mL范围内线性关系良好，所得到的典型标准曲线的回归方程为：Y=-0.027 1+0.000 7X，r=0.999 8.
, 百拇医药
2.2 降解产物的研究
2.2.1 降解产物的结构
Fig.2 The chromatogram of DSF and internal standard
1—DSF,tR=11.2 min；2—Hydrocortisone,tR=5.0 min
取做加热加速实验中已部分降解的DSF甲醇水溶液，在色谱条件(B)下进样50 μL,得到色谱图3，发现在10.6 min处有明显的峰，并且在做加速实验前的色谱图中未发现此峰.将二硫化碳对照品稀释后进样50 μL后得到色谱图4，二硫化碳tR=10.6 min，说明降解产物之一是二硫化碳.并且通过质谱仪注射泵直接进样，可以发现有很强的二乙胺分子离子峰(二乙胺的相对分子质量为73，在正离子检测方式下，其准分子离子峰[M+H]+为m/z 74，见图5).说明DSF的最终降解产物是二硫化碳和二乙胺,与文献〔4,5〕中DSF在体内生成的代谢产物相同.
, 百拇医药
Fig.3 The chromatogram of DSF partly decomposed
1—CS2,tR=10.6 min;2—DSF,tR=23.2 min
2.2.2 降解产物的稳定性
为研究DSF的降解机制，对DDC的稳定性进行了考察，其结构式如图6.取30 μg/mL的DDC的水溶液，在色谱条件(B)下进样量为50 μL,其色谱图如图7所示，在此条件下DDC保留时间很短，但经液相色谱-质谱联用法测定，断定其为DDC的色谱峰.
Fig.4 The chromatogram of CS2
1—CS2;tR=10.6 min
, http://www.100md.com
Fig.5 The mass spectum of diethylamine([M+H]+=m/z 74),after DSF fully decomposed
Fig.6 Diethyldithiocarbamic acid(DDC)
Fig.7 The chromatogram of DDC
1—DDC,tR=1.7 min；2—CS2,tR=10.6 min
图4为二硫化碳对照品稀释后进样50 μL后的色谱图，二硫化碳tR=10.6 min，而图7中在10.6 min处有色谱峰，说明DDC在水中很不稳定，迅速发生分解反应生成二硫化碳，将DDC的水溶液用质谱仪在正离子方式下检测也能发现其中含有大量二乙胺的[M+H]+离子，说明DDC在水中发生分解反应生成的另一产物是二乙胺. 将DDC的水溶液放置20 min后，可以发现在色谱图中有DSF色谱峰，说明在空气中，DDC有少量被氧化，生成具有二硫键的DSF，但由于在水中的分解反应速度大于氧化反应速度，所以DDC主要发生分解反应,而且反应速度快.将DDC溶液放置一段时间后，可以嗅到二硫化碳的恶臭气味(二硫化碳为易挥发性气体，人的嗅觉可嗅到空气体积中1×10-7以上有味物质〔6〕)，这也有力地证明了这一点.由于生成的DDC不稳定，故在实验中不易测到, 经衍生化后, 可以准确定量.
, 百拇医药
2.2.3 DSF的分解过程
DSF的二硫键具有弱的氧化性，所以在还原性条件下易发生还原反应，生成的DDC在水溶液中迅速发生分解反应，按合成路线〔7〕逆方向进行，如图8所示.
Fig.8 The decomposition route of DSF
DSF的甲醇水溶液在氧化的条件下，也能生成二硫化碳和二乙胺，其作用机制尚需进一步考察，可能是在氧化的条件下，水的极性增加，导致分解反应速度加快，不稳定性增加.
2.3 稳定性影响因素的考察
2.3.1 溶液pH值的影响
分别在不同pH值下考察DSF的稳定性，发现其在酸性和碱性条件下均不稳定,在碱性条件下更易降解.在pH为6～7时相对较为稳定，推测其原因为DSF在碱性条件下易生成DDC，而DDC为有机弱酸,故在弱酸性条件下DSF向DDC转化速度变慢，降解速度变慢，较为稳定(表1).
, http://www.100md.com
2.3.2 温度的影响
将浓度相同的4组DSF甲醇水溶液分别置于冰箱及20、40、60℃恒温水浴中，分别于不同时间取样，测定其中DSF的相对百分含量.发现随着温度的增加，DSF的不稳定性增强，降解速度也随之加快(表2).
Tab.1 The concentration of DSF in the aqueous solution of different pH/μg*mL-1 Condition
pH
5.0
6.0
6.5
7.0
, 百拇医药
8.0
9.0
0 h
1.81
1.81
1.81
1.81
1.81
1.81
40℃,52 h
0.99
1.17
1.19
, http://www.100md.com
1.16
0.76
0.12
Tab.2 The relative percentage content of DSF at different temperatres Temperature/℃
Time/d
0
3
6
9
12
4
, 百拇医药 100
98
97
95
94
20
100
96
90
86
83
40
100
92
, 百拇医药
86
79
73
60
100
83
63
48
36
推导出不同温度下的动力学方程，并且根据其不同的速率常数，得出DSF降解的Arrhenius方程及表观活化能(表3).Tab.3 The Arrhenius equation and active energy Temperature/℃
Dynamic equation
, 百拇医药
|r|
Arrhenius equation
ΔE/kJ*mol-1
4
Y=-5.167×10-3X+4.603 4
0.994 1
20
Y=-0.016X+4.604 8
0.995 5
lnk=-4 420.7/T+10.64
36.75
, 百拇医药
40
Y=-0.026X+4.604 6
0.999 5
60
Y=-0.086X+4.642 4
0.997 4
Tab.4 The relative percentage content of DSF in the different condition Condition
Time/h
0
12
, 百拇医药 15
24
36
44
56
Blank
100
86
82
71
64
58
54
Solvent+I2
, 百拇医药
100
79
69
56
44
39
33
Solvent+VE
100
76
67
58
49
, 百拇医药
41
30
2.3.3 溶剂的影响
DSF为亲脂性药物，不溶于水，有文献〔3〕报道DSF的悬浊液较为稳定，但是取10 μL DSF标准储备液(甲醇)分别溶于0.5 mL的水中和甲醇中，放置20 min后再次测定，发现其在水中不稳定，降解速度较快.其原因可能为DSF在水中生成DDC，DDC在水中非常容易发生水解，生成二硫化碳和二乙胺，而DDC在甲醇溶液中相对较为稳定.所以在制剂研究中,应将DSF制成包合物等能减少药物与水接触的剂型.
2.3.4 氧化和还原条件的影响
取10 μL DSF甲醇溶解的标准储备液溶于0.5 mL的水中,并平行操作配制浓度相等的3组DSF甲醇水溶液，一组作为空白，向另外两组中分别加入少量维生素E和碘的醇溶液，置于45℃恒温水浴中，分别于不同时间点取样测定含量，并计算出其相对百分含量，发现加入氧化剂和还原剂后，降解速度都增大，说明DSF在氧化和还原条件下均不稳定(表4).
, 百拇医药
参考文献
1，Colin B.Recent development in disulfiram treatment. Alcohol,1993,28(4)：283～295
2，Terao M, Ken H, Ito Y. Method for treatment of cataract with radical scavenger. United States Patent 5665770, 1997-09-09
3，Terao K, Ito Y. Pharmaceutical compositions containing radical scavengers for cataract. Jpn.Kokai Tokyo JP 07233057, 1995-09-05
4，Benny J. Rapid and sensitive on-line precolumn purification and HPLC assay for disulfiram and its metabolites. J Chromatogr, 1986,378(2):419～429
, 百拇医药
5，Morris F. Elimination kinetics of disulfiram in alcoholics after single and repeated doses. Clin Pharmacol Ther, 1984,378(2):520～526
6，Das G. Stability of aqueous suspensions of disulfiram. Am J Hosp Pharm, 1981, 38:363～364
7，Cummings A D,Simmens H E.Some observations with Ultra-Accelerators.Industrial and Engineering Chemistry，1928,20(2):1173～1176
收稿日期:2000-01-01
, http://www.100md.com
单位：沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室,沈阳 110015
关键词：双硫仑；稳定性；液相色谱；质谱联用法
沈阳药科大学学报000512 摘 要 利用高效液相色谱法和液相色谱/质谱联用法对双硫仑在溶液中的化学稳定性进行了考察，采用氢化可的松作为内标物，对双硫仑进行定量.方法准确，重现性好.并对其不稳定的因素进行了深入的研究，并确定了最终降解产物.
分类号 R913
The Chemical Stability of Disulfiram and Its Products of Decomposition
Shi Xiangguo，Zhong Dafang，Guo Jifen，Du Zongmin
, http://www.100md.com
(Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract The chemical stability of disulfiram in the liquid was investigated by HPLC and LC/MS in this report. Hydrocortisone was used as the internal standard to determine DSF, the assay method is accurate and reproducible. Furthermore,the unstable reason of DSF was researched and the final decomposition products were identified.
, 百拇医药
Key words disulfiram；stability；LC/MS
双硫仑又叫做戒酒硫(disulfiram,DSF),为亲脂性药物，结构式见图1.由于其能干扰乙醇在体内的代谢，使饮酒者产生不适症状〔1〕，自1948年以来，DSF在欧洲广泛用做戒酒药，主要以片剂口服，稳定性较好.近来,日本研究人员发现,通过眼部给药，双硫仑透过角膜后,可增强生物抗氧能力,在治疗白内障方面具有明显的活性,是一种很有前途的治疗白内障新药〔2，3〕.为使其能顺利通过角膜，将其制成滴眼乳剂和滴眼液，但其在溶液中的化学稳定性不好.作者对其原料药在溶液中的稳定性进行了考察，并且对其降解产物进行了研究.
Fig.1 The structure of disulfiram(DSF)
1 材料与条件
, 百拇医药 1.1 原料与试剂
双硫仑及二乙基二硫代氨基甲酸(diethyldit-hiocarbamic acid,DDC)均由沈阳药科大学药物合成研究室提供；氢化可的松由中国药品生物制品检定所提供；甲醇和乙腈为色谱纯(山东禹王公司试剂厂)；水为重蒸亚沸水；二硫化碳和碘为北京试剂厂生产；维生素E为东北制药总厂生产.
1.2 色谱条件
高效液相色谱仪：LC—10AD泵，SPD—10A紫外检测器，C—R6A积分仪(均为日本岛津公司产品)；色谱柱为Nucleosil C18，5 μm,250 mm×4.6 mmI.D.(德国Macherey-Nagel公司生产)；条件(A)：流动相为甲醇-水(体积比为70∶30),检测波长为254 nm；条件(B)：流动相为甲醇-乙腈-水(体积比为35∶30∶30)，pH=7.5,检测波长为215 nm;流速为1.0 mL/min，进样量50 μL,纸速为2 mm/min.
, 百拇医药
1.3 质谱仪及分析条件
美国Finnigan公司LCQ型液相色谱/质谱联用仪，配有ESI(Electrospray ionization)源以及LCQ 1.2数据处理系统，具有软电离和多级离子阱质谱功能.
电喷雾质谱；正/负离子检测；离子源喷射电压：4.25 kV；毛细管温度：180℃；毛细管电压：+/-6.50 V；鞘气流速：60流量单位(a.u.)；辅助气流速：5 a.u..采用一级全扫描质谱(full scan ms)、选择离子监测(SIM)及二级全扫描质谱(full scan ms2)三种方式同时检测.
2 方法与结果
2.1 标准曲线的制备
分别向6支具塞试管中加入1.5 mL浓度分别为125.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0、5 000.0 ng/mL的DSF标准溶液(甲醇)和50 μL内标溶液(20 μg/mL的氢化可的松甲醇溶液)，在色谱条件(A)下通过HPLC法测定并记录各色谱峰的峰高，以待测物与内标物的峰高比值(Y)对DSF的浓度(C)进行回归计算，色谱图如图2所示.结果表明DSF在125.0～5 000 ng/mL范围内线性关系良好，所得到的典型标准曲线的回归方程为：Y=-0.027 1+0.000 7X，r=0.999 8.
, 百拇医药
2.2 降解产物的研究
2.2.1 降解产物的结构
Fig.2 The chromatogram of DSF and internal standard
1—DSF,tR=11.2 min；2—Hydrocortisone,tR=5.0 min
取做加热加速实验中已部分降解的DSF甲醇水溶液，在色谱条件(B)下进样50 μL,得到色谱图3，发现在10.6 min处有明显的峰，并且在做加速实验前的色谱图中未发现此峰.将二硫化碳对照品稀释后进样50 μL后得到色谱图4，二硫化碳tR=10.6 min，说明降解产物之一是二硫化碳.并且通过质谱仪注射泵直接进样，可以发现有很强的二乙胺分子离子峰(二乙胺的相对分子质量为73，在正离子检测方式下，其准分子离子峰[M+H]+为m/z 74，见图5).说明DSF的最终降解产物是二硫化碳和二乙胺,与文献〔4,5〕中DSF在体内生成的代谢产物相同.
, 百拇医药
Fig.3 The chromatogram of DSF partly decomposed
1—CS2,tR=10.6 min;2—DSF,tR=23.2 min
2.2.2 降解产物的稳定性
为研究DSF的降解机制，对DDC的稳定性进行了考察，其结构式如图6.取30 μg/mL的DDC的水溶液，在色谱条件(B)下进样量为50 μL,其色谱图如图7所示，在此条件下DDC保留时间很短，但经液相色谱-质谱联用法测定，断定其为DDC的色谱峰.
Fig.4 The chromatogram of CS2
1—CS2;tR=10.6 min
, http://www.100md.com
Fig.5 The mass spectum of diethylamine([M+H]+=m/z 74),after DSF fully decomposed
Fig.6 Diethyldithiocarbamic acid(DDC)
Fig.7 The chromatogram of DDC
1—DDC,tR=1.7 min；2—CS2,tR=10.6 min
图4为二硫化碳对照品稀释后进样50 μL后的色谱图，二硫化碳tR=10.6 min，而图7中在10.6 min处有色谱峰，说明DDC在水中很不稳定，迅速发生分解反应生成二硫化碳，将DDC的水溶液用质谱仪在正离子方式下检测也能发现其中含有大量二乙胺的[M+H]+离子，说明DDC在水中发生分解反应生成的另一产物是二乙胺. 将DDC的水溶液放置20 min后，可以发现在色谱图中有DSF色谱峰，说明在空气中，DDC有少量被氧化，生成具有二硫键的DSF，但由于在水中的分解反应速度大于氧化反应速度，所以DDC主要发生分解反应,而且反应速度快.将DDC溶液放置一段时间后，可以嗅到二硫化碳的恶臭气味(二硫化碳为易挥发性气体，人的嗅觉可嗅到空气体积中1×10-7以上有味物质〔6〕)，这也有力地证明了这一点.由于生成的DDC不稳定，故在实验中不易测到, 经衍生化后, 可以准确定量.
, 百拇医药
2.2.3 DSF的分解过程
DSF的二硫键具有弱的氧化性，所以在还原性条件下易发生还原反应，生成的DDC在水溶液中迅速发生分解反应，按合成路线〔7〕逆方向进行，如图8所示.
Fig.8 The decomposition route of DSF
DSF的甲醇水溶液在氧化的条件下，也能生成二硫化碳和二乙胺，其作用机制尚需进一步考察，可能是在氧化的条件下，水的极性增加，导致分解反应速度加快，不稳定性增加.
2.3 稳定性影响因素的考察
2.3.1 溶液pH值的影响
分别在不同pH值下考察DSF的稳定性，发现其在酸性和碱性条件下均不稳定,在碱性条件下更易降解.在pH为6～7时相对较为稳定，推测其原因为DSF在碱性条件下易生成DDC，而DDC为有机弱酸,故在弱酸性条件下DSF向DDC转化速度变慢，降解速度变慢，较为稳定(表1).
, http://www.100md.com
2.3.2 温度的影响
将浓度相同的4组DSF甲醇水溶液分别置于冰箱及20、40、60℃恒温水浴中，分别于不同时间取样，测定其中DSF的相对百分含量.发现随着温度的增加，DSF的不稳定性增强，降解速度也随之加快(表2).
Tab.1 The concentration of DSF in the aqueous solution of different pH/μg*mL-1 Condition
pH
5.0
6.0
6.5
7.0
, 百拇医药
8.0
9.0
0 h
1.81
1.81
1.81
1.81
1.81
1.81
40℃,52 h
0.99
1.17
1.19
, http://www.100md.com
1.16
0.76
0.12
Tab.2 The relative percentage content of DSF at different temperatres Temperature/℃
Time/d
0
3
6
9
12
4
, 百拇医药 100
98
97
95
94
20
100
96
90
86
83
40
100
92
, 百拇医药
86
79
73
60
100
83
63
48
36
推导出不同温度下的动力学方程，并且根据其不同的速率常数，得出DSF降解的Arrhenius方程及表观活化能(表3).Tab.3 The Arrhenius equation and active energy Temperature/℃
Dynamic equation
, 百拇医药
|r|
Arrhenius equation
ΔE/kJ*mol-1
4
Y=-5.167×10-3X+4.603 4
0.994 1
20
Y=-0.016X+4.604 8
0.995 5
lnk=-4 420.7/T+10.64
36.75
, 百拇医药
40
Y=-0.026X+4.604 6
0.999 5
60
Y=-0.086X+4.642 4
0.997 4
Tab.4 The relative percentage content of DSF in the different condition Condition
Time/h
0
12
, 百拇医药 15
24
36
44
56
Blank
100
86
82
71
64
58
54
Solvent+I2
, 百拇医药
100
79
69
56
44
39
33
Solvent+VE
100
76
67
58
49
, 百拇医药
41
30
2.3.3 溶剂的影响
DSF为亲脂性药物，不溶于水，有文献〔3〕报道DSF的悬浊液较为稳定，但是取10 μL DSF标准储备液(甲醇)分别溶于0.5 mL的水中和甲醇中，放置20 min后再次测定，发现其在水中不稳定，降解速度较快.其原因可能为DSF在水中生成DDC，DDC在水中非常容易发生水解，生成二硫化碳和二乙胺，而DDC在甲醇溶液中相对较为稳定.所以在制剂研究中,应将DSF制成包合物等能减少药物与水接触的剂型.
2.3.4 氧化和还原条件的影响
取10 μL DSF甲醇溶解的标准储备液溶于0.5 mL的水中,并平行操作配制浓度相等的3组DSF甲醇水溶液，一组作为空白，向另外两组中分别加入少量维生素E和碘的醇溶液，置于45℃恒温水浴中，分别于不同时间点取样测定含量，并计算出其相对百分含量，发现加入氧化剂和还原剂后，降解速度都增大，说明DSF在氧化和还原条件下均不稳定(表4).
, 百拇医药
参考文献
1，Colin B.Recent development in disulfiram treatment. Alcohol,1993,28(4)：283～295
2，Terao M, Ken H, Ito Y. Method for treatment of cataract with radical scavenger. United States Patent 5665770, 1997-09-09
3，Terao K, Ito Y. Pharmaceutical compositions containing radical scavengers for cataract. Jpn.Kokai Tokyo JP 07233057, 1995-09-05
4，Benny J. Rapid and sensitive on-line precolumn purification and HPLC assay for disulfiram and its metabolites. J Chromatogr, 1986,378(2):419～429
, 百拇医药
5，Morris F. Elimination kinetics of disulfiram in alcoholics after single and repeated doses. Clin Pharmacol Ther, 1984,378(2):520～526
6，Das G. Stability of aqueous suspensions of disulfiram. Am J Hosp Pharm, 1981, 38:363～364
7，Cummings A D,Simmens H E.Some observations with Ultra-Accelerators.Industrial and Engineering Chemistry，1928,20(2):1173～1176
收稿日期:2000-01-01
, http://www.100md.com