从鱼油中分离高纯度的EPA和DHA
作者：陶海荣 李和
单位：陶海荣 李和(北京师范大学化学系，北京 100875)
关键词：鱼油，EPA，DHA，低温结晶，减压蒸馏，薄层色谱
中国海洋药物000507 摘 要 以鱼油为原料，经低温结晶、减压蒸馏及薄层色谱法逐步提纯，分别获得了含量高于99%的EPA(甲酯)和DHA(甲酯)。
THE SEPARATION OF EPA(METHYL ESTER)AND DHA (METHYL ESTER)OF HIGH PURITY FROM FISH OIL
Tao Hairong Li He
(Dept.of Chemistry,Beijing Normal University,Beijing 100875)
, 百拇医药
ABSTRACT The paper described the preparation of EPA(methyl ester)and DHA(methylester)of high purity(content more than 99%)from fish oil respectively by a three-step method:lower temperature crystallization,reduced pressure distillation and thin layer chromatograpy.
KEY WORDS fish oil, EPA, DHA, Lower temperature crystallization, Reduced pressure distillation, Thin layer chromatograpy
由于EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)所具有的特殊生理活性[1，2]，它们的富集及分离已广泛为人们所关注。我国有关EPA和DHA的研究起步比较晚，与国际发达国家相比，无论是分离纯化方法还是应用都存在着很大差距，尤其是从鱼油中分离出高纯度的EPA和DHA在国内还是个空白。由于EPA和DHA的药理作用不同，分离纯化高纯度的EPA和DHA对于人们深入系统地研究和了解其性质，进一步开发它的应用价值具有重要的意义。
, 百拇医药
我们在以往实验的基础上[3]，应用低温结晶、减压蒸馏及薄层色谱等分离方法，从鱼油中分离出了高纯度的EPA和DHA。
1 材料
1.1 原料：鱼油(大连产马面豚鱼鱼油)
1.2 主要试剂：无水乙醚(分析纯，北京益利精细化学品有限公司)；环己烷(分析纯，解放军第九○六六工厂)；丙酮(分析纯，北京化工厂)
1.3 层析用薄板：分离制备EPA用AgNO3-硅胶薄板：10g薄层层析用硅胶G与32mL 9% AgNO3水溶液混合均匀后，均匀涂在洁净的22cm×25cm玻璃板上，暗处晾干后在105℃烘箱中活化30min后使用；分离制备DHA用AgNO3-硅胶薄板：14g薄层层析用硅胶G与45mL 4% AgNO3水溶液混合均匀后，均匀涂在洁净的22cm×25cm玻璃板上，在暗处晾干后在105℃烘箱中活化40min后使用。
, http://www.100md.com
1.4 主要分析用仪器：气相色谱(ShimadzuGC-9A 气相色谱仪)；质谱(VG Zabspec 质谱仪)；红外光谱(Nicolet 170SX FTIR)；核磁共振谱(Brucker DMX-300MHz)；紫外光谱(岛津UV-240)
1.5 脂肪酸气相色谱分析条件表1 气相色谱分析条件 仪器型号
色谱柱
载体
固定液
(%)
载气
(mL*m-1)
气化室温度
, 百拇医药
(℃)
柱温
(℃)
燃气
(mL*min-1)
助燃气
(mL*min-1)
检测器
(℃)
进样量
(μL)
Shimadzu
, 百拇医药
GC-9A
2m×2mm
玻璃柱
Chromosorb W,AW-DMCS60-80目
DEGS 3
N2，40
230
180
H3，50
空气，500
FID 230
0.5
, http://www.100md.com
由于脂肪酸沸点高不易气化，待分析的脂肪酸分析前均先转化成相应的脂肪酸甲酯，脂肪酸百分含量的确定采用面积归一法，由仪器直接给出。气相色谱分析条件见表1。
2 方法与结果
2.1 鱼油混合脂肪酸的制备与成分分析
于2000mL圆底烧瓶中加入300g原料鱼油、1000mL皂化用氢氧化钾乙醇溶液(其中含有氢氧化钾90g)，在氮 气保护下加热回流5h。趁热将所得皂化溶液倒入适量蒸馏水中，酸化皂化液(pH1)，溶液分层。分出混合脂肪酸，经水洗后得鱼油混合脂肪酸，为暗红色粘稠状物质。由气相色谱分析结果可知，原料鱼油混合脂肪酸中EPA的含量为5.6%，DHA的含量为6.8%。
2.2 低温结晶法从混合脂肪酸中富集EPA和DHA
称量120g原料鱼油混合脂肪酸于2000mL烧杯中，加入适量丙酮使脂肪酸全部溶解。用丙酮-干冰致冷液冷却，温度降至
, http://www.100md.com
-47℃时恒温搅拌20min。收集母液。除去溶剂后得约20g富集后的混合脂肪酸，为暗红色粘稠状液体。由气相色谱分析结果可知，经低温丙酮法处理后混合脂肪酸中EPA和DHA的含量分别提高至10.1%和27.3%。
2.3 用减压蒸馏法初步提纯EPA和DHA
将2.2中所得富集混合脂肪酸甲酯化，取所得甲酯适量于50mL圆底烧瓶中，在氮气保护下进行减压蒸馏(体系压力始终维持在0.5mmHg)。分别收集187～192℃和204～218℃间的馏出物(1＃和2＃馏出物)，两种馏出物均为淡黄色液体。经气相色谱检测，1＃馏出物中EPA和DHA的含量分别为24.6%和10.98%；2＃馏出物中EPA和DHA的含量分别为25%和50%。
2.4 采用薄层色谱法制备高纯度的EPA和DHA
, http://www.100md.com
取适量2.3中减压蒸馏收集到的1＃馏出物，加入适量乙醚溶解，在分离EPA用AgNO3-硅胶薄板上点样，以环己烷：丙酮=1∶1(V/V)为展开剂展开。收集EPA带(Rf=0.41)。以无水乙醚为洗脱剂洗脱，除去溶剂后得富含EPA甲酯的混合脂肪酸甲酯。经气相色谱分析，上述所得混合脂肪酸甲酯中EPA的含量不低于67%。将此混合脂肪酸甲酯在分离制备EPA用AgNO3-硅胶薄板上点样，以环乙烷：丙酮＝1∶1(V/V)为展开剂展开，收集EPA带(Rf=0.41)。以无水乙醚为洗脱剂洗脱，除去溶剂得EPA甲酯，为淡黄色蜡状固体。经气相色谱分析可知，EPA(甲酯)的含量为99.1%。EPA(甲酯)：IR(液腊) 3011，2917，2849，1737，1718，1648，1460，1376，1199，718cm-1；MS m/z 315.9(M+，12%)，59(7)，69.1(100)，81.1(85)，95.1(71)，109.1(44)，135.2(26)，149.1(14)，287.3(3)
, http://www.100md.com
取适量2.3中减压蒸馏收集到的2＃馏出物，加入适量乙醚溶解，在分离制备DHA用AgNO3-硅胶薄板上点样，以环乙烷：丙酮＝4∶6(V/V)为展开剂展开。收集薄板上的DHA带(Rf＝0.16)。以无水乙醚为洗脱剂洗脱，除去溶剂得DHA甲酯，为淡黄色蜡状固体。经气相色谱分析可知，DHA(甲酯)的含量为99.4%。DHA(甲酯)：IR(液膜) 3012，2925，2853，1741，1710，1657，1460，1377，1199，720cm-1；UVλmax=213.0 nm;1HNMR(CDCL3，ppm) δ5.4(m,12H),3.7(s,3H),2.8(m,10H),2.3(t,2H),2.0(m,2H),0.9(t,3H);MS m/z 342.4(M+，4%)，59(6)，69.1(100)，81.1(80)，95.1(64)，109.2(34)，135.2(28)，149.2(18)，313.4(8)
, 百拇医药
3 讨论
EPA和DHA高度不饱和的结构特点使得它们非常不稳定[4～6]，在实验过程中我们也确实注意到了EPA和DHA的这一特点。在获得EPA和DHA纯品后，可以对它们的稳定性进行深入系统的研究。与此同时，由于EPA和DHA具有不同的药理作用，而目前在对它们的药理作用进行研究时，使用的都是EPA和DHA的混合物，因此，在获得EPA和DHA的纯品后，也可以对它们各自的药理作用进行深入的研究。
致谢
北京师范大学化学系的李佩文老师和杜宝山老师为本文提供了许多有益的建议和帮助，杨亦平老师协助进行气相色谱分析，在此谨表感谢!
参考文献
1，刘玉军.鱼油二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的生物效应与作用机理.生理科学进展，1987，18(3)：230
, http://www.100md.com
2，万新祥，张立.鱼油的药用价值.中国药学杂志，1990，25(7)：392
3，李和，李佩文，杨亦平.低温结晶富集鱼油中EPA和DHA的方法。中国海洋药物，1997，16(4)：50
4，Ann C noble and WW Nawar.The Autoxidation of Highly Unsaturated Fatty Acids:Methyl 4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoate.J Am Oil Chem Soc,1971,48(12):800
5，Soon-Yeong cho,Kazuo miyazawa,teruo miyazawa,et al.Autoxidation of Ethyl Eicosapentaenoate and Docosahexaenoate.J Am Oil Chem Soc,1987,64(6):876
6，Kevin L.fritsche and patricia V.Johnston.Rapid Autoxidation of Fish Oil in Diets Without Added Antioxidants.J Nutri 1988,118:425, 百拇医药
单位：陶海荣 李和(北京师范大学化学系，北京 100875)
关键词：鱼油，EPA，DHA，低温结晶，减压蒸馏，薄层色谱
中国海洋药物000507 摘 要 以鱼油为原料，经低温结晶、减压蒸馏及薄层色谱法逐步提纯，分别获得了含量高于99%的EPA(甲酯)和DHA(甲酯)。
THE SEPARATION OF EPA(METHYL ESTER)AND DHA (METHYL ESTER)OF HIGH PURITY FROM FISH OIL
Tao Hairong Li He
(Dept.of Chemistry,Beijing Normal University,Beijing 100875)
, 百拇医药
ABSTRACT The paper described the preparation of EPA(methyl ester)and DHA(methylester)of high purity(content more than 99%)from fish oil respectively by a three-step method:lower temperature crystallization,reduced pressure distillation and thin layer chromatograpy.
KEY WORDS fish oil, EPA, DHA, Lower temperature crystallization, Reduced pressure distillation, Thin layer chromatograpy
由于EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)所具有的特殊生理活性[1，2]，它们的富集及分离已广泛为人们所关注。我国有关EPA和DHA的研究起步比较晚，与国际发达国家相比，无论是分离纯化方法还是应用都存在着很大差距，尤其是从鱼油中分离出高纯度的EPA和DHA在国内还是个空白。由于EPA和DHA的药理作用不同，分离纯化高纯度的EPA和DHA对于人们深入系统地研究和了解其性质，进一步开发它的应用价值具有重要的意义。
, 百拇医药
我们在以往实验的基础上[3]，应用低温结晶、减压蒸馏及薄层色谱等分离方法，从鱼油中分离出了高纯度的EPA和DHA。
1 材料
1.1 原料：鱼油(大连产马面豚鱼鱼油)
1.2 主要试剂：无水乙醚(分析纯，北京益利精细化学品有限公司)；环己烷(分析纯，解放军第九○六六工厂)；丙酮(分析纯，北京化工厂)
1.3 层析用薄板：分离制备EPA用AgNO3-硅胶薄板：10g薄层层析用硅胶G与32mL 9% AgNO3水溶液混合均匀后，均匀涂在洁净的22cm×25cm玻璃板上，暗处晾干后在105℃烘箱中活化30min后使用；分离制备DHA用AgNO3-硅胶薄板：14g薄层层析用硅胶G与45mL 4% AgNO3水溶液混合均匀后，均匀涂在洁净的22cm×25cm玻璃板上，在暗处晾干后在105℃烘箱中活化40min后使用。
, http://www.100md.com
1.4 主要分析用仪器：气相色谱(ShimadzuGC-9A 气相色谱仪)；质谱(VG Zabspec 质谱仪)；红外光谱(Nicolet 170SX FTIR)；核磁共振谱(Brucker DMX-300MHz)；紫外光谱(岛津UV-240)
1.5 脂肪酸气相色谱分析条件表1 气相色谱分析条件 仪器型号
色谱柱
载体
固定液
(%)
载气
(mL*m-1)
气化室温度
, 百拇医药
(℃)
柱温
(℃)
燃气
(mL*min-1)
助燃气
(mL*min-1)
检测器
(℃)
进样量
(μL)
Shimadzu
, 百拇医药
GC-9A
2m×2mm
玻璃柱
Chromosorb W,AW-DMCS60-80目
DEGS 3
N2，40
230
180
H3，50
空气，500
FID 230
0.5
, http://www.100md.com
由于脂肪酸沸点高不易气化，待分析的脂肪酸分析前均先转化成相应的脂肪酸甲酯，脂肪酸百分含量的确定采用面积归一法，由仪器直接给出。气相色谱分析条件见表1。
2 方法与结果
2.1 鱼油混合脂肪酸的制备与成分分析
于2000mL圆底烧瓶中加入300g原料鱼油、1000mL皂化用氢氧化钾乙醇溶液(其中含有氢氧化钾90g)，在氮 气保护下加热回流5h。趁热将所得皂化溶液倒入适量蒸馏水中，酸化皂化液(pH1)，溶液分层。分出混合脂肪酸，经水洗后得鱼油混合脂肪酸，为暗红色粘稠状物质。由气相色谱分析结果可知，原料鱼油混合脂肪酸中EPA的含量为5.6%，DHA的含量为6.8%。
2.2 低温结晶法从混合脂肪酸中富集EPA和DHA
称量120g原料鱼油混合脂肪酸于2000mL烧杯中，加入适量丙酮使脂肪酸全部溶解。用丙酮-干冰致冷液冷却，温度降至
, http://www.100md.com
-47℃时恒温搅拌20min。收集母液。除去溶剂后得约20g富集后的混合脂肪酸，为暗红色粘稠状液体。由气相色谱分析结果可知，经低温丙酮法处理后混合脂肪酸中EPA和DHA的含量分别提高至10.1%和27.3%。
2.3 用减压蒸馏法初步提纯EPA和DHA
将2.2中所得富集混合脂肪酸甲酯化，取所得甲酯适量于50mL圆底烧瓶中，在氮气保护下进行减压蒸馏(体系压力始终维持在0.5mmHg)。分别收集187～192℃和204～218℃间的馏出物(1＃和2＃馏出物)，两种馏出物均为淡黄色液体。经气相色谱检测，1＃馏出物中EPA和DHA的含量分别为24.6%和10.98%；2＃馏出物中EPA和DHA的含量分别为25%和50%。
2.4 采用薄层色谱法制备高纯度的EPA和DHA
, http://www.100md.com
取适量2.3中减压蒸馏收集到的1＃馏出物，加入适量乙醚溶解，在分离EPA用AgNO3-硅胶薄板上点样，以环己烷：丙酮=1∶1(V/V)为展开剂展开。收集EPA带(Rf=0.41)。以无水乙醚为洗脱剂洗脱，除去溶剂后得富含EPA甲酯的混合脂肪酸甲酯。经气相色谱分析，上述所得混合脂肪酸甲酯中EPA的含量不低于67%。将此混合脂肪酸甲酯在分离制备EPA用AgNO3-硅胶薄板上点样，以环乙烷：丙酮＝1∶1(V/V)为展开剂展开，收集EPA带(Rf=0.41)。以无水乙醚为洗脱剂洗脱，除去溶剂得EPA甲酯，为淡黄色蜡状固体。经气相色谱分析可知，EPA(甲酯)的含量为99.1%。EPA(甲酯)：IR(液腊) 3011，2917，2849，1737，1718，1648，1460，1376，1199，718cm-1；MS m/z 315.9(M+，12%)，59(7)，69.1(100)，81.1(85)，95.1(71)，109.1(44)，135.2(26)，149.1(14)，287.3(3)
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取适量2.3中减压蒸馏收集到的2＃馏出物，加入适量乙醚溶解，在分离制备DHA用AgNO3-硅胶薄板上点样，以环乙烷：丙酮＝4∶6(V/V)为展开剂展开。收集薄板上的DHA带(Rf＝0.16)。以无水乙醚为洗脱剂洗脱，除去溶剂得DHA甲酯，为淡黄色蜡状固体。经气相色谱分析可知，DHA(甲酯)的含量为99.4%。DHA(甲酯)：IR(液膜) 3012，2925，2853，1741，1710，1657，1460，1377，1199，720cm-1；UVλmax=213.0 nm;1HNMR(CDCL3，ppm) δ5.4(m,12H),3.7(s,3H),2.8(m,10H),2.3(t,2H),2.0(m,2H),0.9(t,3H);MS m/z 342.4(M+，4%)，59(6)，69.1(100)，81.1(80)，95.1(64)，109.2(34)，135.2(28)，149.2(18)，313.4(8)
, 百拇医药
3 讨论
EPA和DHA高度不饱和的结构特点使得它们非常不稳定[4～6]，在实验过程中我们也确实注意到了EPA和DHA的这一特点。在获得EPA和DHA纯品后，可以对它们的稳定性进行深入系统的研究。与此同时，由于EPA和DHA具有不同的药理作用，而目前在对它们的药理作用进行研究时，使用的都是EPA和DHA的混合物，因此，在获得EPA和DHA的纯品后，也可以对它们各自的药理作用进行深入的研究。
致谢
北京师范大学化学系的李佩文老师和杜宝山老师为本文提供了许多有益的建议和帮助，杨亦平老师协助进行气相色谱分析，在此谨表感谢!
参考文献
1，刘玉军.鱼油二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的生物效应与作用机理.生理科学进展，1987，18(3)：230
, http://www.100md.com
2，万新祥，张立.鱼油的药用价值.中国药学杂志，1990，25(7)：392
3，李和，李佩文，杨亦平.低温结晶富集鱼油中EPA和DHA的方法。中国海洋药物，1997，16(4)：50
4，Ann C noble and WW Nawar.The Autoxidation of Highly Unsaturated Fatty Acids:Methyl 4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoate.J Am Oil Chem Soc,1971,48(12):800
5，Soon-Yeong cho,Kazuo miyazawa,teruo miyazawa,et al.Autoxidation of Ethyl Eicosapentaenoate and Docosahexaenoate.J Am Oil Chem Soc,1987,64(6):876
6，Kevin L.fritsche and patricia V.Johnston.Rapid Autoxidation of Fish Oil in Diets Without Added Antioxidants.J Nutri 1988,118:425, 百拇医药