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编号:10497176
硒多糖和酵母聚糖对栉孔扇贝血淋巴中二种抗氧化酶活力的影响
http://www.100md.com 《中国海洋药物》 2000年第5期
     作者:孙虎山 李光友

    单位:孙虎山(烟台师范学院生物系,烟台 264025);李光友(国家海洋局第一海洋研究所,青岛 266061)

    关键词:硒多糖,酵母聚糖,栉孔扇贝,血淋巴,抗氧化酶,酶活力

    中国海洋药物000506 摘 要 栉孔扇贝,分别注射硒多糖和酵母聚糖后,采用生化方法,于1、15和30h分别测定了栉孔扇贝血清和血细胞中两种可清除自由基的抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力。结果表明,注射硒多糖后,血清中SOD活力在1h和30h时及血细胞中SOD活力在1h时均为实验组显著高于对照组:血清中CAT活力在1、15和30h时、血细胞中CAT活力在30h时,实验组显著高于对照组。注射酵母聚糖后,血清中SOD活力均为实验组高于对照组,但仅在30h时差异显著,血清和血细胞中CAT活力除了血清1h时外均为实验组显著高于对照组。说明硒多糖和酵母聚糖对栉孔扇贝血淋巴中SOD和CAT的活力均有增强作用。
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    THE EFFECTS OF SELENO-POLYSACCHARIDE AND ZYMOSAN ON THE ACTIVITIES OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN THE HAEMOLYMPH OF CHLAMYS FARRERI

    Sun Hushan Li Guangyou

    (Yantai Normal College,Yantai 264025 The First Institute of Oceanography,SOA,Qingdao 266003)

    ABSTRACT Two kinds of antioxidant enzymes superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)to participate in the immune defence in the haemolymph of Chlamys farreri were assayed at 1,15 and 30h after injection with Seleno-polysaccharide or zymosan.The results were as follow.After injection with Seleno-polysaccharide,the SOD activities of experimental groups were much higher than that of control groups at 1h and 30h in serum or at 1h in haemocytes.The CAT activities of experimental groups were much higher than that of control groups at 1,15 and 30h in serum or at 30h in haemocytes .After injection with zymosan,the SOD activities of experimental groups in serum were much higher than that of control groups only at 30h.The CAT activities of experimental groups in serum and haemocytes were much higher than that of cotrol groups except the group in serum at 1h.It was suggested that Seleno-polysaccharide and zymosan could stimulate and enhence the activities of SOD and CAT in serum and haemocytes of Chlamys farreri.
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    KEY WORDS Seleno-polysaccharide, Zymosan, Chlamys farreri, Haemolymph, Antioxidant enzyme, Activities of enzyme

    硒多糖是一种广谱的非特异性免疫促进剂,具有抗肿瘤等作用[1]。有关硒多糖对无脊椎动物免疫系统影响的研究较少。酵母聚糖做为免疫激活剂常用于免疫学研究中。在新兴学科无脊椎动物免疫学中甲壳动物免疫学和昆虫免疫学两个分枝学科的研究方面,国外已有报道[2]。酵母聚糖在贝类免疫学研究方面应用较少[3]。有关硒多糖和酵母聚糖对栉孔扇贝血淋巴中酶活力的影响,国内外还未见报道。本文选用我国人工养殖产量最高的贝类栉孔扇贝做为实验材料,注射硒多糖和酵母聚糖后测定其血淋巴中两种抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力,以得到硒多糖和酵母聚糖对栉孔扇贝血淋巴中抗氧化酶活力影响的规律,为将硒多糖和酵母聚糖做为免疫激活剂应用于贝类养殖业增强其免疫能力,预防病害提供理论依据。
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    1 材料与方法

    1.1 材料

    从青岛麦岛海珍品养殖场购买栉孔扇贝chlamys farreri(Jones et Preston),为三龄贝。体长45~55mm。硒多糖由国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室提供,硒含量为99.57mg*g-1。实验所用酵母聚糖A为Sigma公司产品。其它试剂均为国产分析纯。

    1.2 方法与步骤

    用无菌海水分别将硒多糖和酵母聚糖A配成0.2%的溶液或悬浊液。按每克体重5μg的剂量用微量进样器从栉孔扇贝闭壳肌背后缘注射硒多糖溶液或酵母聚糖A悬浊液。对照组注射等量的无菌海水。养于室内水族箱中。分别于注射后1、15和30h各从5只扇贝闭壳肌血窦中取血约5mL,3 000rpm的转速离心10min,移出血清,血细胞中加入与血清等量的双蒸水,溶血后3 000rpm的转速离心 10min,取上清液用于酶活力测定。
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    SOD(超氧化物歧化酶,EC 1.15.1.1)活力的测定采用改良的邻苯三酚自氧化法[4]。酶活力单位定义:每毫克蛋白质每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶活力单位,以U表示。CAT(过氧化氢酶,EC 1.11.1.6)活力的测定采用过氧化氢法[5],酶活力单位定义:每克蛋白质每秒钟分解底物过氧化氢(吸收度A为0.50~0.55)的相对量定义为一个酶活力单位,以U表示。测定条件:SOD和CAT 均采用50mmol*L-1磷酸缓冲液、温度均为30℃、pH分别为8.3和7.0。蛋白质含量的测定采用Lowry等[6]的福林-酚试剂法。结果统计处理采用t检验。SOD 和CAT的酶活力分别按下式计算:

    2 结果

    2.1 硒多糖对血淋巴中两种抗氧化酶活力的影响
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    注射硒多糖后,血清和血细胞中SOD和CAT活力的测定结果见表1。结果表明,血清中 SOD活力在1h和30h时实验组高于对照组,且1h时差异显著,30h时差异极显著,但在15h时实验组却低于对照组,且差异不显著。血细胞中SOD活力在1、15h和30h时均为实验组高于对照组,但仅在1h时差异显著,而在15h和30h时差异不显著。血清中CAT活力在1,15和30h时均为实验组高于对照组,且均为差异显著。血细胞中CAT活力在1,15和30h时,也均为实验组高于对照组,但仅在30h时差异显著,而在1h和15h时差异不显著。

    表1 注射硒多糖后栉孔扇贝血淋巴中两种抗氧化酶活力的测定结果(±s,n=5)

    Tab1 The activities of two kinds of antioxidant enzymes in the haemolymph of C. farreri after injection of Seleno-polysaccharide 时间(h)
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    1

    15

    30

    血清SOD实验组(U)

    血清SOD对照组(U)

    P

    血清SOD实验组(U)

    血清SOD对照组(U)

    P

    血清CAT实验组(U)

    血清CAT对照组(U)

    P
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    血清CAT实验组(U)

    血清CAT对照组(U)

    P

    9.41±1.85

    4.79±0.62

    <0.05

    7.30±0.00

    4.98±1.40

    <0.05

    9.10±0.74

    7.06±0.78

    <0.05
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    22.29±3.48

    17.09±2.20

    >0.05

    9.90±0.00

    10.07±0.84

    >0.05

    17.52±3.10

    15.33±2.00

    >0.05

    12.44±0.90

    8.56±1.52

    <0.05
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    48.08±7.92

    42.80±6.11

    >0.05

    8.71±1.19

    4.22±0.74

    <0.01

    7.30±0.00

    7.05±0.18

    >0.05

    10.34±0.80

    7.83±1.46

    <0.05
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    95.651±6.65

    55.79±8.68

    <0.05

    2.2 酵母聚糖A对血淋巴中两种抗氧化酶活力的影响

    血清和血细胞中SOD和CAT 活力的测定结果见表2。结果表明。血清中SOD活力均为实验组高于对照组,但仅在30h时差异极显著,而在1h和15h时则差异不显著。血细胞中SOD活力在1h和30h时均为实验组高于对照组,但差异均不显著,在15h时则实验组低于对照组,且差异显著。血清中CAT活力均为实验组高于对照组,其中在1h时差异不显著,15h时差异极显著,30h时差异显著。血细胞中CAT活力均为实验组高于对照组,其中1h和15h时差异极显著,而在30h时差异显著。表2 注射酵母聚糖A后栉孔扇贝血淋巴中两种抗氧化酶活力的测定结果(±s,n=5)
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    Tab2 The activities of two kinds of antioxidant enzymes in haemolymph of C.farreri after Injection of Zymosan-A

    时间(h)

    1

    15

    30

    血清SOD实验组(U)

    血清SOD对照组(U)

    P

    血清SOD实验组(U)

    血清SOD对照组(U)
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    P

    血清CAT实验组(U)

    血清CAT对照组(U)

    P

    血清CAT实验组(U)

    血清CAT对照组(U)

    P

    12.39±1.12

    11.19±1.14

    >0.05

    7.30±2.58

    2.77±0.00
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    >0.05

    4.06±0.61

    3.70±0.87

    >0.05

    24.82±3.61

    11.31±1.54

    <0.01

    31.05±0.00

    29.67±0.98

    >0.05

    29.21±0.00

    34.16±2.25
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    <0.05

    7.32±0.78

    3.75±0.72

    <0.01

    31.65±3.35

    18.37±3.18

    <0.01

    25.58±0.91

    19.47±1.59

    <0.01

    37.77±2.14

    28.64±9.53
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    >0.05

    3.69±0.58

    2.37±0.58

    <0.05

    29.27±3.45

    22.70±2.60

    <0.05

    3 讨论

    贝类血细胞杀死被吞噬的病原菌等异物的主要机制之一是伴随吞噬引起呼吸突发产生大量的具杀菌作用的氧自由基等活性氧[7],包括超氧阴离子(O2(-)/(*))、羟自由基(*OH)、单线态氧(1O2)和过氧化氢(H2O2)。活性氧对贝类本身也有毒害作用,需及时清除。SOD可清除体内的O2(-)/(*)和*OH,CAT可清除H2O2,从而保护贝类本身免受伤害,因此SOD和CAT在贝类免疫防御中发挥重要作用。作者在过去的研究中已证实栉孔扇贝体内也有SOD和CAT[4]。本研究表明,硒多糖可显著地提高栉孔扇贝血清和血细胞中的SOD和CAT活力,说明硒多糖和酵母聚糖A是两种可应用于栉孔扇贝的很好的免疫激活剂,可增强其免疫能力。
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    本研究所用硒多糖是用亚硒酸根取代从红藻提取的多糖-卡拉胶分子上的硫酸根,使硒稳定地结合在红藻多糖分子上。硒多糖既可以做为有机硒制剂发挥硒做为动物必需微量元素的营养性作用而避免无机硒的毒性,又可以发挥多糖做为一种广谱的非特异性免疫促进剂的作用[1]。硒与多糖结合后成为一种效果更好的免疫促进剂。本文所采用的酵母聚糖A是从啤酒酵母(Saccharomyces ceresiae)细胞壁中提取的β-1,3-葡聚糖。酵母细胞壁主要由D-葡萄聚糖和D-甘露聚糖组成,前者主要是由葡萄糖以β-D-(1→3)键结合的,但也有的酵母具有α-D-(1→3)结合的单位。其中β-1,3-葡聚糖在免疫学中最为常用。

    本文结果表明,硒多糖和酵母聚糖A不仅能提高栉孔扇贝血细胞中的SOD和CAT酶活力,而且还能提高血清中的酶活力,说明两种多糖既可以促进血细胞中酶的形成,又可以促进血细胞内的酶向血清中释放。贝类血细胞脱颗粒是血细胞内的酶释放到血清的主要机制[8],因此硒多糖可能具有促进血细胞脱颗粒的作用。酶的形成与酶脱颗粒释放间相互影响,可能是血清和血细胞中酶活力变化规律不同的原因。Pipe等[9]用免疫细胞化学技术将SOD定位于贻贝血细胞的溶酶体、过氧物酶体及微绒毛内,而将CAT仅定位于过氧物酶体内,两种酶向细胞外分泌的方式应是不同的,这可能是两种酶活性变化规律不同的原因。
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    本文因是用无菌海水配制硒多糖和酵母聚糖溶液,所以对照组也注射了与实验组等量的无菌海水,结果对照组的SOD和CAT活力也有较大变化。而且变化的规律与实验组极为相似,其原因可能有以下两个方面,一是注射针刺的刺激,二是因海水的成分与扇贝血淋巴的渗透压及化学成分有差异,这两个突然的外加刺激都可能使扇贝发生应激反应,引起呼吸突发,并产生大量的自由基,从而引起可清除自由基的SOD和CAT的活力增强。

    参考文献

    1,索金良.4-硒(代)硫酸脂多糖的抗肿瘤免疫调节作用及其机制研究.生理科学进展,1996,27(1):43

    2,Smith VJ and Soderhall K.β-1,3-glucan activiation of crustacean haemocytes in vitro and in vivo.Biol Bull,1983,164:299
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    3,Coles JA and Pipe RK,Phenoloxidase activity in the haemolymph and haemocytes of the mussel Mytilus edulis. Fish Shellfish Immunol,1994,4:337

    4,孙虎山,李光友.栉孔扇贝血淋巴中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性及其性质研究.海洋与湖沼,2000,31(3):259

    5,孙虎山,李光友.大肠杆菌感染后栉孔扇贝血淋巴中7种酶活力的变化.海洋科学,1999,5:40

    6,Lowry OH,Rosebrough NT and Farr AL, et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265
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    7,Keller GA,Warner TG,Steimer KS,et al.Cu,Zn superoxide dismutase is a peroxisomal enzyme in human fibroblasts and nepatoma cells.Pro Nati Acad Sci USA.1991,88:7 381~7 385

    8,Foley DA,Cheng TC,Degranulation and other changes of molluscan granulocytes associated with phagocytosis.J Invertebr Pathol, 1977,29:321

    9,Pipe RK,Porte C,Livingstone DR,Antioxidant enzymes associated with the blood cells and haemolymph of the mussels Mytilus edulis.Fish Shellfish Immunology,1993,3:221, http://www.100md.com