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编号:10497179
红藻海头红药效学及化学成分的研究(Ⅰ)
http://www.100md.com 《中国海洋药物》 2000年第5期
     作者:苑辉卿 时岩鹏 曲显俊 姚庆强 韦兴光

    单位:苑辉卿 时岩鹏 曲显俊 姚庆强 韦兴光(山东省医学科学院药物研究所,济南 250062)

    关键词:红藻,海头红,抑瘤,化学成分

    中国海洋药物000503 摘 要 对红藻门海藻海头红的不同极性部位进行了抗肿瘤活性研究,其中石油醚部位在125~500mg.kg-1剂量范围内,对小鼠S180肉瘤、H22肝癌、艾氏腹水癌均具有明显的抑制作用,并具有一定的剂量依赖性,在对肿瘤生长产生抑制作用的同时,不影响动物的体重增长。对人宫颈癌HeLa细胞、白血病HL60细胞也具有一定的体外细胞毒作用;氯仿部位及正丁醇部位抑瘤作用稍差,水部位毒性较大。对海头红全藻进行了化学成分的分离,现已从石油醚部位分离得到5个化合物,经化学方法和光谱分析鉴定了其中4个化合物的结构,分别为β-谷甾醇(Ⅰ)、硬脂酸(Ⅱ)、十八烷酸三十四烷醇酯(Ⅲ)和β-谷甾醇十六烷酸酯(Ⅳ)。
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    STUDIES ON THE PHARMACOLOGY AND CONSTITUENTS OF PLOCAMIUM TELFAIRIAE HARV

    Yuan Huiqing Shi Yanpeng Qu Xianjun Yao Qingqiang Wei Xingguang

    (Institute of Meterial Medica,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062)

    ABSTRACT Anti-tumor activities was tested on the different fraction of red alga P.telfairiae.It was shown that the petroleum ether fraction showed a obvious inhibition effects on Sarcoma 180 (S180),Hepatic carcinoma(Hep A)and Ehrlich carcinoma(EAC)under a dosedependent relation in the range of 125~500mg.kg-1 in vitro,meanwhile,the inhibitory effects on tumor didn′t affect the increasing of the body weight of mice. In addition,the petroleum fraction showed some cell toxicity on HeLa cell and HL60 cell in vitro.The chlorlform and butanol fraction had a less effects compared with the petroleum ether fraction and the water fraction had a strong toxicity.Five compounds were isolated from petroleum ether fraction,and structures of four were elucidated as β-Sitosterol(Ⅰ),Stearilacid(Ⅱ),Tetratriacontyl stearate(Ⅲ)and β-Sitosterol palmitate(Ⅳ)on the basis of chemical and spectral evidence.
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    KEY WORDS Red algae,Plocamium telfairiae, Antitumor, Compounds

    海头红(Plocamium telfairiae Harv.)系红藻门杉藻目海头红科海头红属海藻,多生长在低潮带岩石上或石沼中,我国的南北方沿海均有分布。国外对红藻的研究报道较多,从中分到了许多具有抗肿瘤、杀虫、抗菌、抗病毒活性的化合物,日本学者对日本沿海的海头红属海藻海头红进行了初步的研究,从中分到两个具有杀虫活性的卤代单萜[1]。我国学者曾对25种海藻进行了抗肿瘤活性筛选[2],海头红在体外对S180、HeLa细胞具有很好的抑制作用,但有关其化学成分的研究未见报道。我们对采自青岛沿海的海头红进行了抑瘤活性和化学成分的研究,海头红的不同极性部位其抑瘤活性不同,其中以石油醚部位的抑瘤活性最为显著,氯仿部位和正丁醇部位作用稍差,而水部位毒性较大。通过对石油醚部位化学成分的研究,已分离到5个化合物,并通过光谱数据分析和化学方法鉴定了其中4个化合物的结构,目前化学部分的工作仍在进行。
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    1 实验仪器与材料

    1.1 仪器 熔点测定用X4显微熔点测定仪(温度未校正):红外光谱测定仪为NICOLET NEXUS 470 FT-IRSPECTROMETERS

    (KBr压片);氢谱及碳谱测定用INOVA-500型核磁共振光谱仪;电子轰击质谱用VGZAB-2F质谱仪;Forma 3111型水套式二氧化碳培养箱为美国Forma公司的产品;DG3022A型酶联免疫检测仪由南京华东电子管厂出品。

    1.2 材料 海头红全藻于1997、1998年春季采自青岛的燕儿岛、麦岛、太平湾;其提取物的石油醚部位(A)、氯仿部位(B)、正丁醇部位(C)、水部位(D),由本课题组提供,使用时用土温80配制成所需浓度的混悬液。

    1.3 化学试剂和药品 阳性对照药:呋喃氟尿嘧啶(FT-207,批号为871024)为济南制药厂生产,使用时用5%淀粉溶液制成混悬液;RPMI 1640培养基为美国GIBCO BRL公司的产品,批号为:31800-089;胰蛋白酶由上海化学试剂采购供应站分装厂提供,批号为:870102;柱层硅胶、薄层硅胶均为青岛海洋化工厂生产;硅胶GF254(Tape60)为Merck公司的产品;化学试剂均为分析纯。
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    1.4 动物 昆明种小鼠,体重19~22g,雌雄兼用(每批试验用同一个性别),山东医科大学实验动物中心提供,合格证号:鲁动质960102。

    肿瘤细胞株 小鼠S180肉瘤、小鼠H22肝癌、小鼠艾氏腹水癌(EAC)、人宫颈癌HeLa细胞、白血病HL60细胞株均为本所药品临床前药理实验中心保存瘤株。

    2 提取与分离

    海头红全藻自然凉干后,粉碎,用95%的乙醇回流提取,提取液减压浓缩过程析出大量白色结晶,经烧灼确定为无机盐,减压过滤并洗涤多次得到白色无机盐,然后浓缩其余提取液得黑色浸膏。浸膏用少量甲醇溶解后,加水稀释,分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取,各萃取液分别减压浓缩后,得石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位和水部位。取石油醚部位样品约20g,用硅胶柱层析进行分离,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,得A、B、C、D、E5部分。取C部分,硅胶柱层析进行分离,得流份30~34,合并后丙酮重结晶,得白色片状和粉末状结晶,为化合物Ⅰ;取B部分,经反复硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯洗脱,得化合物Ⅱ、Ⅳ;取A部分,反复硅胶柱层析进行分离,石油醚-乙酸乙酯洗脱,最后合并流份6~9,制备薄层层析分离,正己烷-乙酸乙酯(20∶1)为展开剂,刮板后,石油醚- 乙酸乙酯重结晶,得化合物Ⅲ、Ⅴ。
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    3 抑瘤实验方法

    3.1 各极性部位体内抑瘤活性的观察

    无菌抽取接种瘤细胞6~7d的小鼠腹水,经稀释后调整细胞数至每毫升0.7~2.5×107个细胞,接种于小鼠右侧部皮下,每只0.2mL。接种次日按体重随机分组,每组10只(对照组鼠数=每组鼠数×√试验组数),分别为海头红A组分3个剂量组:500、250、125mg.kg-1;海头红B组分2个剂量组:500mg.kg-1、250mg.kg-1;海头红C组分2个剂量组:700mg.kg-1、350mg.kg-1;海头红D组分2个剂量组:700mg.kg-1、350
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    mg.kg-1;阳性对照组,呋喃氟尿嘧啶(FT-207)125mg.kg-1及蒸馏水对照组。灌胃给药,每日1次,给药体积每只0.5mL,连续10~13d。末次给药24h后,处死动物,解剖瘤块并称重,计算抑瘤率。

    3.2 石油醚部位体外抑瘤作用的观察

    将体外培养的人宫颈癌HeLa细胞、白血病HL60细胞经胰酶消化或用Hank′s 洗涤后用含15%小牛血清的RPMI1640培养基稀释细胞(HL60细胞为10%小牛血清),按每孔1万×0.1mL-1(HL60细胞每孔1.5万×0.1mL-1)接种于96孔培养板中,12h后分别加入不同稀释度的红藻海头红A和CDDP,每个稀释度设3个复孔,置37℃、5%CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h各孔加入MTT 10μL(5g.L-1)。培养结束,经离心、PBS洗涤后,各孔加入DMSO 200uL,充分振荡混匀,于酶标仪570nm处测Α值,并根据下列公式计算IC50
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    4 抑瘤试验结果

    4.1 各部位的体内抑瘤试验结果

    体内实验表明,荷瘤小鼠用海藻各部位以不同剂量灌胃给药,各部位的使用剂量分别为:石油醚部位(A)500、250、125mg.kg-1,氯仿部位(B)500mg.kg-1、250mg.kg-1, 正丁醇部位(C)700mg.kg-1、350mg.kg-1,水部位(D)700mg.kg-1、350mg.kg-1,末次给药24h后,处死动物,计算抑瘤率。

    对小鼠S180肉瘤的抑瘤率分别为A:43.06%、42.35%、30.25%;B:20.05%、27.05%;C:43.82%、31.32%;D:毒性太大,小鼠死亡。结果见表1。
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    表1 海藻各极性部位对S180小鼠肉瘤的抑制作用 组别

    剂量

    (mg.kg-1)

    动物数(只)

    开始 结束

    体重(g)

    开始 结束

    平均瘤重

    (g,±s)

    抑瘤率
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    (%)

    P值

    蒸馏水组

    FT-207组

    A部位组

    B部位组

    C部位组

    —

    125

    500

    250

    125

    500
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    250

    700

    350

    21

    10

    10

    10

    10

    10

    10

    10

    10

    21

    10
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    10

    10

    10

    9

    9

    7

    7

    19.5

    19.5

    19.5

    19.5

    19.5

    19.5

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    19.5

    19.5

    21.0

    19.5

    22.0

    21.8

    20.0

    22.6

    22.1

    20.0

    22.3

    2.81±0.89
, 百拇医药
    1.37±0.62

    1.60±0.82

    1.62±0.41

    1.96±0.84

    2.25±0.64

    2.05±0.88

    0.77±0.30

    1.58±0.84

    —

    51.25

    43.06

    42.35
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    30.25

    20.05

    27.05

    43.82

    31.32

    —

    <0.01

    <0.01

    <0.01

    <0.05

    >0.05

    >0.05

    <0.01
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    <0.05

    对小鼠H22肝癌的抑瘤率分别为A:47.87%、39.89%、25.53%;B:31.91%、25.00%;C:56.38%、23.94%;D:毒性太大,小鼠死亡,结果见表2。表2 海藻各极性部位对小鼠H22肝癌的抑制作用 组别

    剂量

    (mg.kg-1)

    动物数(只)

    开始 结束

    体重(g)

    开始 结束

    平均瘤重
, 百拇医药
    (g,±s)

    抑瘤率

    (%)

    P值

    蒸馏水组

    FT-207组

    A部位组

    B部位组

    C部位组

    —

    125

    500
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    250

    125

    500

    250

    700

    350

    17

    10

    10

    10

    10

    10

    10

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    10

    17

    10

    10

    10

    10

    10

    10

    6

    7

    20.0

    20.0

    20.0
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    20.0

    20.0

    20.0

    20.0

    20.0

    20.0

    25.6

    21.6

    24.8

    25.1

    25.7

    23.6

    24.5
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    19.8

    22.1

    1.88±0.56

    0.92±0.48

    0.98±0.42

    1.13±0.71

    1.40±0.78

    1.28±0.76

    1.41±0.42

    0.82±0.39

    1.43±0.75

    —
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    51.06

    47.87

    39.89

    25.53

    31.91

    25.00

    56.38

    23.94

    —

    <0.01

    <0.01

    <0.05

    >0.05
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    >0.05

    <0.05

    <0.01

    >0.05

    对小鼠艾氏腹水癌(EAC)的抑瘤率分别为A:48.83%、34.77%、21.09%;B:28.12%、30.86%;C:49.38%、28.46%;D:毒性太大,小鼠死亡,结果见表3。表3 海藻各极性部位对小鼠艾氏腹水癌(EAC0的抑制作用 组别

    剂量

    (mg.kg-1)

    动物数(只)

    开始 结束
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    体重(g)

    开始 结束

    平均瘤重

    (g,±s)

    抑瘤率

    (%)

    P值

    蒸馏水组

    FT-207组

    A部位组

    B部位组

    C部位组
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    —

    125

    500

    250

    125

    500

    250

    700

    350

    17

    10

    10

    10

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    10

    10

    10

    10

    17

    10

    10

    9

    10

    9

    8

    5

    8
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    19.0

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    19.0

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    19.0

    20.0

    19.0

    21.2

    21.4
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    22.0

    20.0

    21.3

    19.8

    20.0

    2.56±1.07

    1.22±0.64

    1.31±0.62

    1.67±0.91

    2.02±0.88

    1.84±0.63

    1.77±0.90
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    1.26±0.79

    1.82±0.72

    —

    52.34

    48.83

    34.77

    21.09

    28.12

    30.86

    49.36

    28.46

    —

    <0.01
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    <0.01

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    <0.05

    >0.05

    4.2 石油醚部位体外细胞毒试验结果

    海藻的石油醚部位(A)对人宫颈癌HeLa细胞、白血病HL60细胞的IC50分别为52.30μg.mL-1、52.58μg.mL-1,结果见表4。表4 海藻A部位对两种细胞的体外抑制作用(抑制率%) 细胞株(ug.mL-1)
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    HeLa(%)

    HL60(%)

    200.00

    100.00

    50.00

    25.00

    12.50

    6.25

    98.00

    73.00

    30.00

    21.00

    12.00
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    8.00

    86.00

    62.00

    43.00

    26.00

    18.00

    9.00

    5 化合物结构鉴定

    化合物Ⅰ 白色片状和粉末状结晶,Libermann-Burchard反应阳性,mp 138~140℃(丙酮),与已知化合物β-谷甾醇的红外光谱对照,完全一致;与已知化合物的熔点一致,且混合熔点不下降;与已知化合物共薄层,Rf值一致。鉴定化合物Ⅰ为β-谷甾醇(β-Sitosterol)。
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    化合物Ⅱ 为白色粉末状结晶,mp

    56℃(石油醚-乙酸乙酯),经EI-MS、IR光谱分析以及和标准化合物的光谱相对照[3、4],确定化合物Ⅱ为硬脂酸(Stearic acid)。

    化合物Ⅲ 化合物Ⅲ为白色粉末,mp 68~69℃(石油醚-乙酸乙酯)。EI-MS(m/z):734(M+-28),678,369,313,285(base peak),257,97,83,71,57,43。1H-NMR(CDCL3,TMS,δ):4.05(2H,t,-O-CH2-),2.29(2H,t,-CH2-C=O),0.88-1.62(102H,m,-CH2-,-CH3)。13C-NMR(CDCL3,TMS,δ):174.0(C=O),64.3(-Ο-C),14.1(C18,C34′),22.6(C17),31.9(C16),29.3(C15),29.6(C5-C14),29.3(C4),25.0(C3),34.4(C2),31.9(C2′),25.9(C3′),29.2(C4′-C30′),28.6(C31′),31.9(C32′),22.6(C33′)。经光谱数据分析以及与类似化合物的氢谱、碳谱、质谱[5~8]数据相比较,鉴定化合物Ⅲ为十八烷酸三十四烷醇酯(Tetratriacontyl stearate)。
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    化合物Ⅳ 为白色结晶性粉末,mp 79~81℃(石油醚-乙酸乙酯),Libermann-Burchard 反应阳性。EI-MS(m/z):652(M+),396(M+-C16H32O2),368(M+-C16H32O2-28),353,313,255,213,147,121,95,81,69,57,43。1H-NMR(CDCl3,TMS,δ):0.69(3H,s,C18-Me),0.86(3H,d,J=4.9Hz,C20-Me),0.88(3H,d,J=4.9Hz,C27-Me),0.91(3H,t,C29-Me),0.91(3H,t,C16′-Me),1.00(3H,t,J=6.6Hz,C21-Me),1.02(3H,s,C19-Me),2.26(2H,t,C2′-H),2.32(2H,d,C4-H),4.65(1H,m,C3-H),5.38(1H,d,C6-H),1.02-2.02(51H,m,>CH2,>CH)。13C-NMR(CDCL3,TMS,δ):37.1(C1),31.9(C2),73.7(C3),42.4(C4),139.8(C5),122.6(C6),31.9(C7),31.9(C8),50.2(C9),36.3(C10),21.1(C11),39.8(C12),42.4(C13),56.8(C14),24.3(C15)28.2(C16),56.3(C17),11.9(C18),19.3(C19),36.3(C20),19.3(C21),34.8(C22),29.1(C23),50.2(C24),25.1(C25),18.8(C26),19.3(C27),23.9(C28),11.9(C29),173.3(C1′),34.8(C2′),27.9(C3′),29.5(C4′),29.7(C5′-C12′),29.4(C13′),35.8(C14′),22.8(C15′),14.1(C16′)。与已知化合物β-谷甾醇和胆固醇十六烷酸酯的光谱[9~11]相比较,鉴定化合物Ⅳ为β-谷甾醇十六烷酸酯(β-sitosterol palmitate)。
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    6 讨论

    海头红提取物的药效学试验结果表明,极性小的部位显示出良好的抑瘤效果,特别是石油醚部位对S180小鼠肉瘤、小鼠H22肝癌及艾氏腹水癌均具有明显的抑制作用,且在本实验的剂量范围内有一定的剂量依赖性,在对肿瘤生长产生抑制作用的同时,不影响动物的体重增长,在体外对人宫颈癌HeLa细胞和白血病HL60细胞也有一定的体外细胞毒作用;而水部分毒性较大,可能与含盐量 高有关,这有待于进一步研究。在红藻的研究中,许多有生物活性的化合物是卤代萜类,特别是卤代单萜类,这类化合物的极性较小,易溶于石油醚、乙醚、氯仿等有机溶媒;海头红的低极性部位显示出的良好抑瘤效果,很有可能也是这类化合物。

    日本学者曾对日本沿海的海头红属海藻海头红进行了初步的研究,从中分到2个具有杀虫活性的卤代单萜。我国学者曾对25种海藻进行了抗肿瘤活性筛选[2],海头红在体外对S180、HeLa细胞具有很好的抑制作用,但有关其化学成分的研究未见报道。我们重点对石油醚部位进行了化学成分的分离,已分离到的成分均首次从该植物中分离得到,但尚未发现有活性的化合物。目前,这部分工作仍在进行中。
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    参考文献

    1,Watanabe K,Umeda K,Kurita Y,et al.Two Insecticidal Monoterpenes,Telfairine and Aplysiaterpenoid A,from the red alga Plocamium telfairiae;Structure Elucidation,Biological Activity,and Molecular Orbital Study.Pestic Biochem Physiol,1990;37(3):275

    2,殷丽明,魏云莉,丁伟,等.青岛沿海常见海藻抗肿瘤及抗菌活性初报.中国海洋药物杂志,1988;(1-2):39

    3,Sadtler Research Lab.Inc.,IR,1971;21003k

    4,Helter S R,EPA/NIH Mass Spectral Data Base,1978;2090
, http://www.100md.com
    5,Sadtler Research Lab.Inc.1HNMR,1979;29629M

    6,Helter S.R.EPA/NIH Mass Spectral Data Base,1978,3521

    7,Sadtler Research Lab.Inc.13CNMR,1978;4606C

    8,Sadtler Research Lab.Inc.1HNMR,1970;9661M

    9,Ian Rubinstein,John Goad,LADH.Clague,et al.The 220 MHz NMR Spectra of Phytosterols.Phytochem,1976,15:195

    10,Sadtler Research Lab.Inc.1HNMR 1974;18984M

    11,Sadtler Research Lab.Inc.13CNMR 1978;4786C, 百拇医药