风湿性心脏病患者心肌肌球蛋白轻链的变化
郎希龙 朱家麟 张宝仁 郝家骅 吴弘 朱泉芳 史沁卫
摘 要 目的:研究风湿性心脏病(RHD)心衰时心室肌中肌球蛋白轻链(VMLC)的变化与心脏重塑的关系。方法:采用Western blotting技术对13例RHD心衰患者及7例意外死亡者VMLC-1,VMLC-2含量进行定量分析。结果:RHD组VMLC-1,VMLC-2含量均显著低于正常对照组，以VMLC-2含量下降最明显，VMLC-1/VMLC-2比值在1∶0.95～1∶0.61。结论:RHD心衰发展过程中涉及了VMLC-1,VMLC-2蛋白水平的改变，这种改变可能对心功能的进行性恶化有直接影响。
关键词：风湿性心脏病 心脏重塑 肌球蛋白轻链，心室型
风湿性心脏病(RHD)是引起慢性心衰的常见病因。临床实践表明，部分患者在纠正瓣膜功能障碍后，心衰症状仍无明显改善，有些甚至继续恶化，表明心肌本身的舒缩功能异常亦是影响RHD患者心功能的重要因素。因此，探明RHD心脏重塑过程中心肌舒缩功能的变化，有助于对RHD心衰机制的进一步认识，可为临床治疗心衰提供依据。心室型肌球蛋白轻链(VMLC)是收缩蛋白中的一种,是肌球蛋白分子的主体和骨架，具有收缩特性[1,2]。以往对心衰时VMLC变化规律的研究鲜有报道。本研究拟探讨RHD心衰时VMLC在心脏重塑中的变化规律。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 临床资料 RHD心衰患者13例,男7例，女6例，年龄32～54岁，平均(45.3±7.9)岁,均为风心瓣膜病行二尖瓣及主动脉瓣双瓣膜置换术者，其中心功能(NYHA)Ⅲ级3例，Ⅳ级10例。对照组为健康人意外死亡者7例，均为男性，年龄22～45岁，平均(38.4±7.8)岁。
1.2 标本 心肌组织均取自左室乳头肌。RHD患者于术中建立体外循环、心脏停跳后30min内取材，对照组于死亡后2h内取材，液氮速冻。
1.3 实验方法 VMLC粗品的提取参照Shi等[3]报道的方法稍加改进完成,提取全过程中加入PMSF并保持浓度在1mmol/L，最后一步取上清，蛋白变性后行SDS-PAGE凝胶电泳。待溴酚兰移至凝胶底部后停止电泳,胶浸入转移缓冲液中>30min后电转移法转移至硝酸纤维素膜，2h内完成，丽春红S染色，膜上蛋白条带清晰，证明转膜成功。将干燥好的硝酸纤维素膜放入杂交管，加入封闭液，37℃转动2h，弃封闭液，加入杂交液及VMLCMcAbs，37℃转动杂交1h，弃杂交液，加入生物素标记的羊抗鼠IgG，37℃转动孵育1h，以NBT+BCIP显色后风干，摄片，密度积分扫描以杂交膜空白区1×1cm2面积密度值定为1个扫描单位，进行杂交条带半定量。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 实验数据均以
±s表示,采用配对及非配对资料t检验。
2 结 果
VMLC-1相对含量：RHD组0.992±0.247，对照组1.216±0.154，RHD组较对照组低18.43%(P<0.05)；VMLC-2相对含量:RHD组0.798±0.255,对照组1.191±0.132,RHD组较对照组低32.74%(P<0.01)；RHD组VMLC-2较VMLC-1低19.50%(P<0.01)，对照组VMLC-1，VMLC-2含量无显著差别(P>0.05)；VMLC-1/VMLC-2比值：RHD组为1∶0.95～1∶0.61，对照组为1∶1.02～1∶0.96。
3 讨 论
, 百拇医药
本研究采用Western blotting方法检测RHD心衰患者VMLC-1，VMLC-2含量，结果发现VMLC-1,VMLC-2均显著低于对照组，以VMLC-2含量下降最明显。Trahair等[4]在研究扩张性心肌病(DCM)终末期心衰患者时也发现心室肌VMLC-1的含量下降，但VMLC-2无明显变化，而Margossian等[5]检测发现DCM患者VMLC-2含量却明显下降甚至消失。这些结果的不一致性可能与引起心衰的病因和心衰发展的不同阶段有关。我们曾应用Northern blotting方法对RHD心衰患者心室肌VMLC-1，VMLC-2mRNA进行了检测[6]，结果发现RHD组mRNA含量显著高于对照组, 提示VMLC-1，VMLC-2mRNA水平的增高不伴有其相应蛋白产物的增多。由此可见,VMLC-1，VMLC-2的合成是在转录后水平调控的，其具体的调控机制目前仍不十分清楚。
RHD患者心脏重塑中VMLC-2含量下降，其原因可能是由于其特异的蛋白酶被激活致使VMLC-2分解所致。这种激酶在正常人心脏中处于失活状态,心衰时通过某种途径被激活[5]。VMLC-2本身可氧化磷酸化，参与心肌舒缩时的能量供应，其含量的下降，致使心肌舒缩时所需能量供应减少。同时，我们还发现RHD心衰患者VMLC-1/VMLC-2比值亦发生了改变,而正常人心室肌中VMLC-1/VMLC-2比值接近于1。Hailstones等[7]研究提示正常人各种肌肉组织中，MLC-1,MLC-2是成对出现的，这种组合的收缩效能最高，RHD心衰患者VMLC-1/VMLC-2比值的改变势必影响了其收缩效能。综上所述，RHD患者发生心衰时,不仅瓣膜功能出现了异常，而且心肌收缩与舒张功能的最终承担者--心肌收缩蛋白亦发生了明显的改变。这种改变使收缩蛋白组成与结构遭到了损伤,心肌细胞生成相对不完整的、功能低下的收缩蛋白，含有这种收缩蛋白的心肌细胞易于衰竭，且其寿命相对缩短，从而直接参与了心衰的发生发展。由此可见，对RHD患者的治疗，单纯纠正瓣膜功能障碍并不能完全改善心衰症状，这为我们今后进一步防治RHD心衰提供了理论依据。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目，批准号 39670716
作者简介：郎希龙，男，1966年7月生，博士，主治医师
作者单位 郎希龙 朱家麟 张宝仁 郝家骅 朱泉芳 第二军医大学长海医院胸心外科,上海,200433；
吴 弘 第二军医大学 长海医院心血管内科；
史沁卫加拿大多伦多大学临床生化研究室
参考文献
1 Holt JC, Caulfield JB, Norton P, et al. Human cardiac myosin light chains: sequence comparisons between myosi n LC1 and LC2 from normal and idiopathic dilated cardiomyopathic hearts. Mol Cell Biochem, 1995,145(1): 89
, 百拇医药
2 Morano I, Ritter O, Bonz A, et al. Myosin light chain-actin interaction regulates cardiac contractility. Circ Res, 1995,76(5): 720
3 Shi QW, Olley PM, Jackowski G. Comparison of ion-exchange chromatography, is oelectric precipitation and reversed-phase high-performance liquid chromatogra phy for the separation of individual cardiac myosin light chains. J Chromatogr, 1991,572(1/2):59
4 Trahair T, Yeoh T, Cartmill T, et al. Myosin light chain gene expression associated with disease states of the human heart. J Mol Cell Cardiol, 1993,25( 5):577
, 百拇医药
5 Margossian SS, White HD, Caulfield JB, et al. Light chain 2 profile and a ctivity of human ventricular myosin during dilated cardiomyopathy. Identificatio n of a causal agent for impaired myocardial function. Circulation, 1992, 85(5): 1720
6 郎希龙,朱家麟,张宝仁,等. 风湿性心脏病心肌肌球蛋白轻链前体基因转录的变化.第二 军医大学学报,1997,18(增刊):47
7 Hailstones D, Barton P, Chan-Thomas P, et al. Differential regulation of the atrial isoforms of the myosin light chains during striated muscle developme nt. J Biol Chem, 1992, 267(32): 23295, 百拇医药
摘 要 目的:研究风湿性心脏病(RHD)心衰时心室肌中肌球蛋白轻链(VMLC)的变化与心脏重塑的关系。方法:采用Western blotting技术对13例RHD心衰患者及7例意外死亡者VMLC-1,VMLC-2含量进行定量分析。结果:RHD组VMLC-1,VMLC-2含量均显著低于正常对照组，以VMLC-2含量下降最明显，VMLC-1/VMLC-2比值在1∶0.95～1∶0.61。结论:RHD心衰发展过程中涉及了VMLC-1,VMLC-2蛋白水平的改变，这种改变可能对心功能的进行性恶化有直接影响。
关键词：风湿性心脏病 心脏重塑 肌球蛋白轻链，心室型
风湿性心脏病(RHD)是引起慢性心衰的常见病因。临床实践表明，部分患者在纠正瓣膜功能障碍后，心衰症状仍无明显改善，有些甚至继续恶化，表明心肌本身的舒缩功能异常亦是影响RHD患者心功能的重要因素。因此，探明RHD心脏重塑过程中心肌舒缩功能的变化，有助于对RHD心衰机制的进一步认识，可为临床治疗心衰提供依据。心室型肌球蛋白轻链(VMLC)是收缩蛋白中的一种,是肌球蛋白分子的主体和骨架，具有收缩特性[1,2]。以往对心衰时VMLC变化规律的研究鲜有报道。本研究拟探讨RHD心衰时VMLC在心脏重塑中的变化规律。
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1 材料和方法
1.1 临床资料 RHD心衰患者13例,男7例，女6例，年龄32～54岁，平均(45.3±7.9)岁,均为风心瓣膜病行二尖瓣及主动脉瓣双瓣膜置换术者，其中心功能(NYHA)Ⅲ级3例，Ⅳ级10例。对照组为健康人意外死亡者7例，均为男性，年龄22～45岁，平均(38.4±7.8)岁。
1.2 标本 心肌组织均取自左室乳头肌。RHD患者于术中建立体外循环、心脏停跳后30min内取材，对照组于死亡后2h内取材，液氮速冻。
1.3 实验方法 VMLC粗品的提取参照Shi等[3]报道的方法稍加改进完成,提取全过程中加入PMSF并保持浓度在1mmol/L，最后一步取上清，蛋白变性后行SDS-PAGE凝胶电泳。待溴酚兰移至凝胶底部后停止电泳,胶浸入转移缓冲液中>30min后电转移法转移至硝酸纤维素膜，2h内完成，丽春红S染色，膜上蛋白条带清晰，证明转膜成功。将干燥好的硝酸纤维素膜放入杂交管，加入封闭液，37℃转动2h，弃封闭液，加入杂交液及VMLCMcAbs，37℃转动杂交1h，弃杂交液，加入生物素标记的羊抗鼠IgG，37℃转动孵育1h，以NBT+BCIP显色后风干，摄片，密度积分扫描以杂交膜空白区1×1cm2面积密度值定为1个扫描单位，进行杂交条带半定量。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 实验数据均以
±s表示,采用配对及非配对资料t检验。2 结 果
VMLC-1相对含量：RHD组0.992±0.247，对照组1.216±0.154，RHD组较对照组低18.43%(P<0.05)；VMLC-2相对含量:RHD组0.798±0.255,对照组1.191±0.132,RHD组较对照组低32.74%(P<0.01)；RHD组VMLC-2较VMLC-1低19.50%(P<0.01)，对照组VMLC-1，VMLC-2含量无显著差别(P>0.05)；VMLC-1/VMLC-2比值：RHD组为1∶0.95～1∶0.61，对照组为1∶1.02～1∶0.96。
3 讨 论
, 百拇医药
本研究采用Western blotting方法检测RHD心衰患者VMLC-1，VMLC-2含量，结果发现VMLC-1,VMLC-2均显著低于对照组，以VMLC-2含量下降最明显。Trahair等[4]在研究扩张性心肌病(DCM)终末期心衰患者时也发现心室肌VMLC-1的含量下降，但VMLC-2无明显变化，而Margossian等[5]检测发现DCM患者VMLC-2含量却明显下降甚至消失。这些结果的不一致性可能与引起心衰的病因和心衰发展的不同阶段有关。我们曾应用Northern blotting方法对RHD心衰患者心室肌VMLC-1，VMLC-2mRNA进行了检测[6]，结果发现RHD组mRNA含量显著高于对照组, 提示VMLC-1，VMLC-2mRNA水平的增高不伴有其相应蛋白产物的增多。由此可见,VMLC-1，VMLC-2的合成是在转录后水平调控的，其具体的调控机制目前仍不十分清楚。
RHD患者心脏重塑中VMLC-2含量下降，其原因可能是由于其特异的蛋白酶被激活致使VMLC-2分解所致。这种激酶在正常人心脏中处于失活状态,心衰时通过某种途径被激活[5]。VMLC-2本身可氧化磷酸化，参与心肌舒缩时的能量供应，其含量的下降，致使心肌舒缩时所需能量供应减少。同时，我们还发现RHD心衰患者VMLC-1/VMLC-2比值亦发生了改变,而正常人心室肌中VMLC-1/VMLC-2比值接近于1。Hailstones等[7]研究提示正常人各种肌肉组织中，MLC-1,MLC-2是成对出现的，这种组合的收缩效能最高，RHD心衰患者VMLC-1/VMLC-2比值的改变势必影响了其收缩效能。综上所述，RHD患者发生心衰时,不仅瓣膜功能出现了异常，而且心肌收缩与舒张功能的最终承担者--心肌收缩蛋白亦发生了明显的改变。这种改变使收缩蛋白组成与结构遭到了损伤,心肌细胞生成相对不完整的、功能低下的收缩蛋白，含有这种收缩蛋白的心肌细胞易于衰竭，且其寿命相对缩短，从而直接参与了心衰的发生发展。由此可见，对RHD患者的治疗，单纯纠正瓣膜功能障碍并不能完全改善心衰症状，这为我们今后进一步防治RHD心衰提供了理论依据。
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* 国家自然科学基金资助项目，批准号 39670716
作者简介：郎希龙，男，1966年7月生，博士，主治医师
作者单位 郎希龙 朱家麟 张宝仁 郝家骅 朱泉芳 第二军医大学长海医院胸心外科,上海,200433；
吴 弘 第二军医大学 长海医院心血管内科；
史沁卫加拿大多伦多大学临床生化研究室
参考文献
1 Holt JC, Caulfield JB, Norton P, et al. Human cardiac myosin light chains: sequence comparisons between myosi n LC1 and LC2 from normal and idiopathic dilated cardiomyopathic hearts. Mol Cell Biochem, 1995,145(1): 89
, 百拇医药
2 Morano I, Ritter O, Bonz A, et al. Myosin light chain-actin interaction regulates cardiac contractility. Circ Res, 1995,76(5): 720
3 Shi QW, Olley PM, Jackowski G. Comparison of ion-exchange chromatography, is oelectric precipitation and reversed-phase high-performance liquid chromatogra phy for the separation of individual cardiac myosin light chains. J Chromatogr, 1991,572(1/2):59
4 Trahair T, Yeoh T, Cartmill T, et al. Myosin light chain gene expression associated with disease states of the human heart. J Mol Cell Cardiol, 1993,25( 5):577
, 百拇医药
5 Margossian SS, White HD, Caulfield JB, et al. Light chain 2 profile and a ctivity of human ventricular myosin during dilated cardiomyopathy. Identificatio n of a causal agent for impaired myocardial function. Circulation, 1992, 85(5): 1720
6 郎希龙,朱家麟,张宝仁,等. 风湿性心脏病心肌肌球蛋白轻链前体基因转录的变化.第二 军医大学学报,1997,18(增刊):47
7 Hailstones D, Barton P, Chan-Thomas P, et al. Differential regulation of the atrial isoforms of the myosin light chains during striated muscle developme nt. J Biol Chem, 1992, 267(32): 23295, 百拇医药