人化SCID鼠的建立及在人单抗制备中的应用
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国外医学免疫学分册 2000年第23卷第1期
人化SCID鼠的建立及在人单抗制备中的应用
第一军医大学热带病研究室，广东广州 510515 吴岚晓
摘 要 人化联合免疫缺陷鼠(hu-SCIK mice)可作为人类免疫系统的模型，在检测人体免疫应答、揭示HIV感染、肿瘤以及自身免疫系统疾病等的发病机理和人单克隆抗体的制备等领域中得以广泛应用。本文概述了人化SCID鼠的构建过程，并总结了其在制备人单克隆抗体中的应用进展。
关键词：人化SCID鼠 构建 人单克隆抗体
SCID鼠，全称为联合免疫缺陷鼠(severe combined immunodeficiency mice)。1983年由Bosma等[1]人培育成功，是一种淋巴细胞分化过程严重受损的突变小鼠，因其抗原受体基因重组异常，T、B淋巴细胞不能发育成熟，机体的体液和细胞免疫功能均缺陷，难检测到免疫球蛋白的分泌。这样，SCID鼠就成为异种移植的良好活体承载系统。1988年Moiser等[2]首次将人体外周血淋细胞(hu-PBL)移植入SCID鼠的皮下及肾包膜下，建立了人化的SCID(hu-PBL-SCID mice)，使一个有功能的人体免疫系统在SCID鼠内长期存活，在SCID鼠体内进行人免疫功能重建获初步成功，解决了长期以来动物模型不能确切反映人体免疫系统的特点，研究人体免疫应答仅限于体外实验的难题。人化后的SCID鼠在人类淋巴细胞的发生发育、器官移植免疫[3]、肿瘤免疫[4]、AIDS的防治[5]、疫苗检测[6]及人单抗的制备等研究领域得到广泛应用。
, 百拇医药
人化SCID鼠的构建方法是将用泛影葡胺-聚蔗糖(ficoll-hypaque)人淋巴细胞分离液分离得到和人外周淋巴细胞生理盐水悬液注入合格的SCID鼠腹腔，分别于注射4周和12周后采血检测其血清中人IgG含量。目前认为以2×107~4×107个人体外周血淋巴细胞腹腔植入SCID鼠，为建立具人化免疫功能SCID鼠的较佳方案，一般在移植后10周左右鼠血清中的人IgG含量可升至最高水平达1000μg/ml以上，接近正常人血清的水平。在构建人化SCID鼠时有两个最基本的问题，即SCID鼠的无菌饲养条件和其合格性的保证。国外有文献报道，饲养时在饮水中添加磺胺类药物可以维持SCID鼠的无菌条件。可经鼠尾采血获血清进行鼠IgG含量测定，是SCID鼠质量鉴定普遍采用的方法，经监测血清中鼠IgG含量低于5μg/ml者为合格[7]。有时SCID鼠会出现自身免疫功能恢复即“渗漏”(leaky)的现象，必须筛选掉。
人化SCID鼠构建成功后，具有功能的人体免疫系统能在SCID鼠体内长期稳定地存在。免疫重建的人化SCID鼠体内存在各类人免疫球蛋白，其外周血及淋巴器官中可检出人淋巴细胞，且其人淋巴细胞可在小鼠体内对破伤风毒素、乙肝核心抗原等形成原发性或继发性的免疫反应，说明有功能的人原抗原提呈细胞、辅助性T细胞和B细胞在人化SCID鼠内能长期存活[8]。一些小鼠的脾检出的人淋巴细胞可达80%~90%，移植入SCID鼠体内的人外周血淋巴细胞能在SCID鼠体内大量增殖并存活至少六个月 ，而并不发生异种移植物抗宿主疾病(XGVH disease)。T、B细胞在移植后5天可以从小鼠体内检出，在鼠的脾及淋巴结中存在人淋巴细胞，在小鼠血浆中可检测到可溶性人CD8和IL-2受体。在移植后4周，小鼠血清中可检测到人免疫球蛋白，尤以IgA、IgM浓度较高，而IgG浓度相对较低。在移植早期，腹腔液中的人Ig浓度总体高于血清，在移植后较长时间的4周后，则血清中出现较高浓度的人Ig，提示新增殖的人淋巴细胞产生了人Ig。同时，在移植后较长时间4周后，均可在其小鼠脾中检测到人淋巴细胞，通过间接免疫荧光染色作人淋巴细胞表面标记后，进行流式细胞分析，所检测到的8种免疫表型人淋巴细胞亚群均存在[9]。以上结果均表明人淋巴细胞移植于SCID鼠后不仅存活，而且出现增殖或重建。但是，人化SCID鼠构建模型的研究仍存在着许多问题，主要有：①重构建和SCID鼠并非每一只都可达到各种可检测到的免疫反应，不同实验室的研究结果以及同一试验的不同小鼠个体之间免疫重建的程度存在明显差异，说明该模型在一定程度上的不稳定性；②关于SCID鼠体内的淋巴细胞是否具有功能，能否形成继发或原发性免疫反应的研究结果不尽统一；③将由不同类型淋巴细胞组成的移植物移植于SCID鼠，T细胞易获免疫重建，分离到的大多数人T细胞属于CD45RO+和HLA-DR+记忆和激活T细胞。但虽然有高水平的Ig在小鼠外周血得以检测，活性B细胞的数目却极其有限，因而尽管有来自于记忆B细胞的继发性抗体反应产生，却难以形成原发性抗体[10]。另外，SCID鼠虽然T、B淋巴细胞免疫功能缺陷，但在胸腺、脾脏和淋巴结内含有一定数量的巨噬细胞，在脾脏和外周血中还可见中性粒细胞，而且SCID鼠具有正常的NK和LAK细胞功能[11]，这些特征都是在移植试验和骨髓干细胞分化等研究中值得注意的问题。
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由于SCID鼠体内本身所具有的鼠免疫球蛋白含量极低，用于异种单克隆抗体生产，可避免宿主本身免疫球蛋白的污染，建立具人化免疫功能SCID鼠后，SCID鼠能针对抗原产生具保护作用的人特异性抗体。因此人们在探索人单克隆抗体制备途径的研究中，设计建立人化的SCID鼠，使获取经任意预定抗原免疫的人特异性抗体成为可能。目前已有对EBV( Epstein Barr virus)和HIV-1(human immunodeficenty virus tpye 1)[12]等抗体制备的研究。但植入后的人抗体形成细胞数量尚少，活力较弱，且无较合适的免疫增强剂诸如佐剂的配合，使特异性抗体的分泌滴度较低，并且，目前已注意到人化SCID鼠很难对那些外周血淋巴细胞的供者未接触的陌生抗原产生免疫应答而分泌抗体，供体的免疫经历和免疫状况是影响人化SCID鼠免疫应答能力的重要因素[7，13]。人们还发现人化SCID鼠对抗原产生特异性抗体能力并不与其人IgG的分泌状况相平行，这应是人外周淋巴细胞供者个体因素的反映结果。有些学者认为[3，11]用抗原免疫人化SCID鼠应在人体外周淋巴细胞移植后第一天开始最佳，第一天腹腔注射抗原悬液，每隔两周重复一次，第三次重复后隔一周再加强一次，注射的抗原量随抗原的种类不同而不同，分别在第二次免疫和第五次免疫后检测血清中特异性抗体的滴度。
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设想通过构建人化SCID鼠来解决人单克隆抗体制备中不易获取任意预定抗原激活的B细胞及人细胞融合困难的难题，为人单克隆抗体的研制带来了新的希望。虽然有成功的例子[13，14]，但从更多的报道来看[13，15]，其中许多环节如人外周血淋巴细胞供者的选择、人外周血淋巴细胞的移植数量和方式、抗原免疫的最佳方案、人化SCID鼠对陌生抗原的免疫应答等都有待进一步研究[16]。只有当经抗原免疫后的人源化SCID鼠能产生足够高滴度的特异性抗体时，将其用于人单克隆抗体制备才具有现实意义。
目前构建的人化SCID鼠仍存在许多未解决的问题，可喜的是将人体免疫系统移植到SCID鼠体内的这种异种移植是成功的。随着进一步深入的探索和不断改进，我们相信，用人外周血淋巴细胞构建的SCID鼠可以被制成更接近人类本身免疫系统的模型，并将在检测人体免疫应答、揭示HIV感染、肿瘤以及自身免疫系统疾病等的发病机理，以及人单克隆抗体的制备等领域中得以广泛应用。
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作者简介：吴岚晓(1975-)，女(汉族)，福建福州人，第一军医大学，硕士
审校者：第一军医大学热带病研究室李明
参考文献
1 Bosma GC et al .Nature ,1985;301:527-530
2 Moiser DE et al .Nature,1988；335:256-259
3 Shiroki R et al .Transplantation,1997;63
4 Nokihara H et al.Int J Cancer,1999;80(5):773-780
, 百拇医药
5 Parren PW et al .AIDS,1995;9(6):1-6
6 Choi JI et al.Infect Immun,1998;66(1):391-393
7 Armstrong N et al .Clin Exp Immunol,1992;90:476-478
8 Steinsvik TE et al .Scand J Immunol,1999;49(1):67-72
9 魏泓，中国实验动物学报，1994;2(2):12-14
10 Stallmach AZ.Gastroenterol,1998;36(4):353-355
11 Kim HM et al .J Pharmacol Toxicol Methods,1997;37(2):83-89
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12 Cauduin MC et al .Nat Med,1997;3(12):1389-1393
13 Andrus L et al .J Infect Dis,1998;177(4):889-897
14 Arai K et al .J Immunol Methods,.1998;217(1-2):79-85
15 Martino G et al .Eur J Immunol.1993;23:1023-1027
16 Crow AR et al .Br J Haematol,1999;104(4):919-924, http://www.100md.com
第一军医大学热带病研究室，广东广州 510515 吴岚晓
摘 要 人化联合免疫缺陷鼠(hu-SCIK mice)可作为人类免疫系统的模型，在检测人体免疫应答、揭示HIV感染、肿瘤以及自身免疫系统疾病等的发病机理和人单克隆抗体的制备等领域中得以广泛应用。本文概述了人化SCID鼠的构建过程，并总结了其在制备人单克隆抗体中的应用进展。
关键词：人化SCID鼠 构建 人单克隆抗体
SCID鼠，全称为联合免疫缺陷鼠(severe combined immunodeficiency mice)。1983年由Bosma等[1]人培育成功，是一种淋巴细胞分化过程严重受损的突变小鼠，因其抗原受体基因重组异常，T、B淋巴细胞不能发育成熟，机体的体液和细胞免疫功能均缺陷，难检测到免疫球蛋白的分泌。这样，SCID鼠就成为异种移植的良好活体承载系统。1988年Moiser等[2]首次将人体外周血淋细胞(hu-PBL)移植入SCID鼠的皮下及肾包膜下，建立了人化的SCID(hu-PBL-SCID mice)，使一个有功能的人体免疫系统在SCID鼠内长期存活，在SCID鼠体内进行人免疫功能重建获初步成功，解决了长期以来动物模型不能确切反映人体免疫系统的特点，研究人体免疫应答仅限于体外实验的难题。人化后的SCID鼠在人类淋巴细胞的发生发育、器官移植免疫[3]、肿瘤免疫[4]、AIDS的防治[5]、疫苗检测[6]及人单抗的制备等研究领域得到广泛应用。
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人化SCID鼠的构建方法是将用泛影葡胺-聚蔗糖(ficoll-hypaque)人淋巴细胞分离液分离得到和人外周淋巴细胞生理盐水悬液注入合格的SCID鼠腹腔，分别于注射4周和12周后采血检测其血清中人IgG含量。目前认为以2×107~4×107个人体外周血淋巴细胞腹腔植入SCID鼠，为建立具人化免疫功能SCID鼠的较佳方案，一般在移植后10周左右鼠血清中的人IgG含量可升至最高水平达1000μg/ml以上，接近正常人血清的水平。在构建人化SCID鼠时有两个最基本的问题，即SCID鼠的无菌饲养条件和其合格性的保证。国外有文献报道，饲养时在饮水中添加磺胺类药物可以维持SCID鼠的无菌条件。可经鼠尾采血获血清进行鼠IgG含量测定，是SCID鼠质量鉴定普遍采用的方法，经监测血清中鼠IgG含量低于5μg/ml者为合格[7]。有时SCID鼠会出现自身免疫功能恢复即“渗漏”(leaky)的现象，必须筛选掉。
人化SCID鼠构建成功后，具有功能的人体免疫系统能在SCID鼠体内长期稳定地存在。免疫重建的人化SCID鼠体内存在各类人免疫球蛋白，其外周血及淋巴器官中可检出人淋巴细胞，且其人淋巴细胞可在小鼠体内对破伤风毒素、乙肝核心抗原等形成原发性或继发性的免疫反应，说明有功能的人原抗原提呈细胞、辅助性T细胞和B细胞在人化SCID鼠内能长期存活[8]。一些小鼠的脾检出的人淋巴细胞可达80%~90%，移植入SCID鼠体内的人外周血淋巴细胞能在SCID鼠体内大量增殖并存活至少六个月 ，而并不发生异种移植物抗宿主疾病(XGVH disease)。T、B细胞在移植后5天可以从小鼠体内检出，在鼠的脾及淋巴结中存在人淋巴细胞，在小鼠血浆中可检测到可溶性人CD8和IL-2受体。在移植后4周，小鼠血清中可检测到人免疫球蛋白，尤以IgA、IgM浓度较高，而IgG浓度相对较低。在移植早期，腹腔液中的人Ig浓度总体高于血清，在移植后较长时间的4周后，则血清中出现较高浓度的人Ig，提示新增殖的人淋巴细胞产生了人Ig。同时，在移植后较长时间4周后，均可在其小鼠脾中检测到人淋巴细胞，通过间接免疫荧光染色作人淋巴细胞表面标记后，进行流式细胞分析，所检测到的8种免疫表型人淋巴细胞亚群均存在[9]。以上结果均表明人淋巴细胞移植于SCID鼠后不仅存活，而且出现增殖或重建。但是，人化SCID鼠构建模型的研究仍存在着许多问题，主要有：①重构建和SCID鼠并非每一只都可达到各种可检测到的免疫反应，不同实验室的研究结果以及同一试验的不同小鼠个体之间免疫重建的程度存在明显差异，说明该模型在一定程度上的不稳定性；②关于SCID鼠体内的淋巴细胞是否具有功能，能否形成继发或原发性免疫反应的研究结果不尽统一；③将由不同类型淋巴细胞组成的移植物移植于SCID鼠，T细胞易获免疫重建，分离到的大多数人T细胞属于CD45RO+和HLA-DR+记忆和激活T细胞。但虽然有高水平的Ig在小鼠外周血得以检测，活性B细胞的数目却极其有限，因而尽管有来自于记忆B细胞的继发性抗体反应产生，却难以形成原发性抗体[10]。另外，SCID鼠虽然T、B淋巴细胞免疫功能缺陷，但在胸腺、脾脏和淋巴结内含有一定数量的巨噬细胞，在脾脏和外周血中还可见中性粒细胞，而且SCID鼠具有正常的NK和LAK细胞功能[11]，这些特征都是在移植试验和骨髓干细胞分化等研究中值得注意的问题。
, 百拇医药
由于SCID鼠体内本身所具有的鼠免疫球蛋白含量极低，用于异种单克隆抗体生产，可避免宿主本身免疫球蛋白的污染，建立具人化免疫功能SCID鼠后，SCID鼠能针对抗原产生具保护作用的人特异性抗体。因此人们在探索人单克隆抗体制备途径的研究中，设计建立人化的SCID鼠，使获取经任意预定抗原免疫的人特异性抗体成为可能。目前已有对EBV( Epstein Barr virus)和HIV-1(human immunodeficenty virus tpye 1)[12]等抗体制备的研究。但植入后的人抗体形成细胞数量尚少，活力较弱，且无较合适的免疫增强剂诸如佐剂的配合，使特异性抗体的分泌滴度较低，并且，目前已注意到人化SCID鼠很难对那些外周血淋巴细胞的供者未接触的陌生抗原产生免疫应答而分泌抗体，供体的免疫经历和免疫状况是影响人化SCID鼠免疫应答能力的重要因素[7，13]。人们还发现人化SCID鼠对抗原产生特异性抗体能力并不与其人IgG的分泌状况相平行，这应是人外周淋巴细胞供者个体因素的反映结果。有些学者认为[3，11]用抗原免疫人化SCID鼠应在人体外周淋巴细胞移植后第一天开始最佳，第一天腹腔注射抗原悬液，每隔两周重复一次，第三次重复后隔一周再加强一次，注射的抗原量随抗原的种类不同而不同，分别在第二次免疫和第五次免疫后检测血清中特异性抗体的滴度。
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设想通过构建人化SCID鼠来解决人单克隆抗体制备中不易获取任意预定抗原激活的B细胞及人细胞融合困难的难题，为人单克隆抗体的研制带来了新的希望。虽然有成功的例子[13，14]，但从更多的报道来看[13，15]，其中许多环节如人外周血淋巴细胞供者的选择、人外周血淋巴细胞的移植数量和方式、抗原免疫的最佳方案、人化SCID鼠对陌生抗原的免疫应答等都有待进一步研究[16]。只有当经抗原免疫后的人源化SCID鼠能产生足够高滴度的特异性抗体时，将其用于人单克隆抗体制备才具有现实意义。
目前构建的人化SCID鼠仍存在许多未解决的问题，可喜的是将人体免疫系统移植到SCID鼠体内的这种异种移植是成功的。随着进一步深入的探索和不断改进，我们相信，用人外周血淋巴细胞构建的SCID鼠可以被制成更接近人类本身免疫系统的模型，并将在检测人体免疫应答、揭示HIV感染、肿瘤以及自身免疫系统疾病等的发病机理，以及人单克隆抗体的制备等领域中得以广泛应用。
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作者简介：吴岚晓(1975-)，女(汉族)，福建福州人，第一军医大学，硕士
审校者：第一军医大学热带病研究室李明
参考文献
1 Bosma GC et al .Nature ,1985;301:527-530
2 Moiser DE et al .Nature,1988；335:256-259
3 Shiroki R et al .Transplantation,1997;63
4 Nokihara H et al.Int J Cancer,1999;80(5):773-780
, 百拇医药
5 Parren PW et al .AIDS,1995;9(6):1-6
6 Choi JI et al.Infect Immun,1998;66(1):391-393
7 Armstrong N et al .Clin Exp Immunol,1992;90:476-478
8 Steinsvik TE et al .Scand J Immunol,1999;49(1):67-72
9 魏泓，中国实验动物学报，1994;2(2):12-14
10 Stallmach AZ.Gastroenterol,1998;36(4):353-355
11 Kim HM et al .J Pharmacol Toxicol Methods,1997;37(2):83-89
, http://www.100md.com
12 Cauduin MC et al .Nat Med,1997;3(12):1389-1393
13 Andrus L et al .J Infect Dis,1998;177(4):889-897
14 Arai K et al .J Immunol Methods,.1998;217(1-2):79-85
15 Martino G et al .Eur J Immunol.1993;23:1023-1027
16 Crow AR et al .Br J Haematol,1999;104(4):919-924, http://www.100md.com