人era基因的克隆测序及表达
作者：吴元明 张俊杰 纪宗玲 刘惠萍 陈南春 陈苏民
单位：吴元明(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；张俊杰(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；纪宗玲(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；刘惠萍(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；陈南春(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；陈苏民(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)
关键词：人era；基因克隆；序列测定；基因表达；大肠杆菌
第四军医大学学报000540 摘 要: 目的 克隆人的era基因(简称Hera)并利用大肠杆菌进行表达. 方法 PCR扩增Hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pGEX-4T3，受控于Ptac启动子,重组质粒pGEX-Hera以大肠杆菌DH5α为宿主菌,用IPTG进行诱导表达. 结果 克隆了Hera基因, 测序正确；含重组质粒pGEX-Hera的菌体诱导后在SDS-PAGE上出现一条新生蛋白带，相对分子质量为65 ku,占菌体总蛋白的23%. 结论 成功扩增、克隆Hera基因，并在大肠杆菌中得到高效表达.
, http://www.100md.com
中图号：Q78 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)05-0646-03
Cloning, sequencing and expression of cDNA gene of human era
WU Yuan-Ming, ZHANG Jun-Jie, JI Zhong-Lin, LIU Hui-Ping, CHEN Nan-Chun, CHEN Su-Min
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, 百拇医药
Abstract: AIM To amplify and to clone the human era gene and to express its recombinant protein in E.coli. METHODS After the human era gene was amplified by PCR and identified by sequencing, it was inserted into expression vector pGEX-4T3 in which exogenous gene was controlled by ptac promoters. The recombinant plasmid pGEX-Hera was transformed into DH5α and induced with IPTG chemically. RESULTS The human era gene was amplified and sequenced correctly. When the engineered bacteria were induced, an an-ticipated 65 ku protein band appeared on SDS-PAGE gel and amounted to 23% of total bacterial protein. CONCLUSION The human era gene has been successfully subcloned and efficiently expressed in E.coli.
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Keywords: human era; gene cloning; sequencing; gene expression; E.coli
0 引言
era是1986年在测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseⅢ的rnc基因下游发现的一个开放读框，因其编码的氨基酸序列与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处，命名为E.coli Ras-like(era)基因[1]. era是细菌生存繁殖所必需的基因[2] . 以往认为era只是细菌中的基因，随着“基因组计划”研究的进展，发现在C. Elegans、小鼠及人中存在与该序列高度同源的真核表达序列标签[2]. 我们根据与细菌era序列同源的人EST已成功地克隆了全长Hera-cDNA基因(Genebank 收录号 AF082657). Era和细菌的细胞周期调控以及蛋白质的合成有关. 但有关人的Era方面的研究至今还未见报道. 为了研究Hera的理化特性，进一步了解其功能，我们开展了以下基础性的工作.
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1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5α菌种，pUC19质粒均为本教研室保存；表达质粒pGEX-4T3为Pharmacia公司产品. pBS-Hera为陈苏民教授提供. 各种限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶 均为Gibco公司产品. DNA marker和蛋白marker为Takara公司产品. 柱式质粒纯化试剂盒为华舜公司产品.
1.2 方法 PCR引物: 正向： 5-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG, 反向： 5-AACTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC. PCR反应以pBS-Hera为模板在PE公司9600反应仪上进行. 循环参数为96℃ 30 s; 60℃ 50 s; 72℃ 40 s; 30个循环. 纯化的PCR产物用BamHI和PstI双酶切定向克隆入pUC19质粒，转化E.coli JM109,进行蓝白筛选，并经酶切鉴定筛选出含插入片段的阳性克隆. 核苷酸序列分析利用PE公司310型测序仪进行序列测定. Hera基因与表达载体的重组,细菌转化及阳性克隆筛选按参考文献[3]进行. 目的蛋白的诱导表达：工程菌在含氨苄青霉素(100 mg*L-1)的LB培养液中32℃振荡过夜，次日按4%转接扩大培养，继续在32℃振荡2～4 h，当A600=0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol*L-1进行化学诱导表达. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：4℃ 9000 g离心5 min收集菌体，用含3 mL*L-1巯基乙醇加样缓冲液处理(100℃， 10 min)， 12 000 g离心10 min，采用Laemmli不连续PAGE，150 g*L-1分离胶，考马斯亮蓝R-250染色.
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2 结果
2.1 Hera基因的扩增 经PCR扩增获得Hera基因片段，大小与理论值相符(Fig 1).
图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig 1 Electrophoretic analysis of PCR products in agrose gel
A： DNA Marker DL2000; B： Amplification of Hera.
2.2 扩增片段的克隆与鉴定 Hera基因片段与pUC19的重组质粒经转化后，从培养板上随机挑选5个白色克隆，质粒经BamHI和PstI双酶切鉴定，都含有插入片段. 酶切鉴定结果见Fig 2.
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图2 重组pUC19-Hera质粒经BamHI和PstI酶切鉴定
Fig 2 Restriction mapping of recombinant plasmid pUC19-Hera with BamHI plus PstI
A: Recombinant plasmid pUC19-Hera digested with BamHI plus PstI; B: Recombinant plasmid pUC19-Hera; C: pUC19; D: λDNA/HindⅢ marker.
2.3 核苷酸序列测定 挑选一个含插入片段的阳性克隆命名为pUC19-Hera,以pUC19通用测序引物进行序列测定. 测序结果表明，所扩增的Hera基因与已知序列完全相符.
2.4 pGEX-Hera表达质粒的构建 用PstI酶切pUC19-Hera，Klenow补平，再用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳后，回收1038 bp目的片段；亚克隆入经BamHI和SmaI双酶切的pGEX-4T3载体，用氯化钙法转化DH5α感受态，用酶切鉴定法挑取克隆，将正确的阳性克隆命名pGEX-Hera. 酶切鉴定结果见Fig 3.
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图3 重组质粒pGEX-Hera经BamHI和NotI酶切鉴定
Fig 3 Restriction mapping of recombinant plasmid pGEX-Hera with BamHI plus NotI
A: Recombinant plasmid pGEX-Hera digested with BamHI plus NotI; B: Recombinant plasmid pGEX-Hera; C: pGEX-4T3; D: λDNA/HindⅢ marker.
2.5 重组pGEX-Hera在大肠杆菌中的表达 pGEX-Hera重组质粒进行化学诱导，收菌，经还原处理后作SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，与空白对照菌株比较，含pGEX-Hera的菌株在Mr 65 000处出现一条明显的新生蛋白带(Fig 4)，其含量随诱导时间的延长而增加，4～5 h最高，以后趋于稳定(Fig 5). 经5 h诱导后电泳薄层扫描显示新表达条带约占菌体总蛋白的23%.
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图4 重组Hera诱导表达后的SDS-PAGE结果
Fig 4 SDS-PAGE of expressed Hera in E.coli
A: Protein molecular weight marker B: Non-induced bacteria with pGEX-4T3; C: Induced bacteria with pGEX-4T3; D: Non-induced bacteria with pGEX-Hera; E: Induced bacteria with pGEX-Hera.
3 讨论
era是在细菌中能正常表达的基因，尽管其表达水平极低，但era基因缺失细菌就不能生存. 当Era功能减弱时，细菌的DNA虽能复制、子代DNA能分离，但细胞不能分裂，停滞在胞核分离和胞质分离之间，证明Era功能与细菌细胞分裂相关[2].
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era是从细菌到人高度保守的G蛋白基因, 人Era蛋白与大肠杆菌Era蛋白的氨基酸序列有30%相同，两者的相似性为53%[2]. era基因的N端含有4个鸟苷酸结合区(G1，G2，G3，G4). 高表达的Era蛋白特性显示：Era是一种G蛋白，能特异地与鸟苷酸结合，并具有GTP酶的活性[4]. era基因的C端也相当保守，且含有一个能与此同时RNA特异结合的KH domain[5]. 体外实验证明Era能与16sRNA结合，但RNA结合与GTP酶活性之间的关系还不清楚[6]. 总之，era是一种有别于Ras的小G蛋白家族的新成员.
图5 重组Hera不同时间诱导表达后的SDS-PAGE结果
Fig 5 SDS-PAGE of expressed Hera after the bacteria has been induced for different time
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A: Protein molecular mass marker; B: Non-induced bacteria with pGEX-Hera; C～H: Induced bacteria with pGEX-Hera from 1 to 6 h.
本研究通过基因重组的手段，利用GST融合表达载体在大肠杆菌高表达了Hera基因. 这就为Era的纯化、特性分析、抗体制备打下了基础.
编辑 许福明
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870380，39670006); 全军医药卫生科研基金资助项目(98M108)
作者简介：吴元明(1972-)， 男(汉族)， 安徽省东至县人. 硕士, 助教. Tel.(029)3374516 Ext.13 Email. wuyuanming@usa.net
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参考文献：
[1] Ahnn J, March PE, Takiff HE et al. A GTP-binding protein of Escherichia coli has homology to yeast RAS proteins [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1986; 83(3): 8849-8853.
[2] Britton RA, Powell BS, Dasgupta S et al. Cell cycle arrest in Era GTPase mutants: A potential growth rate regulated cell cycle checkpoint in Escherichia coli [J]. Mol Microbiol,1998;27(13):739-750.
[3] J.萨姆布鲁克, E.F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京： 科学出版社，1992：822-849.
, 百拇医药
[4] 陈苏民， Court DL. 大肠杆菌中高表达重组Era可溶性蛋白的纯化及其生化特性[J]. 生物化学杂志,1992;8(1):33-41.
[5] Xin Chen, Court DL, Xin-Hua Ji. Crystal structure of Era: A GTPase-dependent cell cycle regulator containing an RNA binding motif [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999;96(2): 8396-8401.
[6] Meier TI, Peery RB, Jaskunas SR et al. 16S rRNA is bound to era of streptococcus pneumoniae [J]. J Bacteriol, 1999; 181(17): 5242-5249.
收稿日期:1999-03-03; 修回日期:1999-12-08, 百拇医药
单位：吴元明(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；张俊杰(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；纪宗玲(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；刘惠萍(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；陈南春(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)；陈苏民(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西 西安 710033)
关键词：人era；基因克隆；序列测定；基因表达；大肠杆菌
第四军医大学学报000540 摘 要: 目的 克隆人的era基因(简称Hera)并利用大肠杆菌进行表达. 方法 PCR扩增Hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pGEX-4T3，受控于Ptac启动子,重组质粒pGEX-Hera以大肠杆菌DH5α为宿主菌,用IPTG进行诱导表达. 结果 克隆了Hera基因, 测序正确；含重组质粒pGEX-Hera的菌体诱导后在SDS-PAGE上出现一条新生蛋白带，相对分子质量为65 ku,占菌体总蛋白的23%. 结论 成功扩增、克隆Hera基因，并在大肠杆菌中得到高效表达.
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中图号：Q78 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)05-0646-03
Cloning, sequencing and expression of cDNA gene of human era
WU Yuan-Ming, ZHANG Jun-Jie, JI Zhong-Lin, LIU Hui-Ping, CHEN Nan-Chun, CHEN Su-Min
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
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Abstract: AIM To amplify and to clone the human era gene and to express its recombinant protein in E.coli. METHODS After the human era gene was amplified by PCR and identified by sequencing, it was inserted into expression vector pGEX-4T3 in which exogenous gene was controlled by ptac promoters. The recombinant plasmid pGEX-Hera was transformed into DH5α and induced with IPTG chemically. RESULTS The human era gene was amplified and sequenced correctly. When the engineered bacteria were induced, an an-ticipated 65 ku protein band appeared on SDS-PAGE gel and amounted to 23% of total bacterial protein. CONCLUSION The human era gene has been successfully subcloned and efficiently expressed in E.coli.
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Keywords: human era; gene cloning; sequencing; gene expression; E.coli
0 引言
era是1986年在测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseⅢ的rnc基因下游发现的一个开放读框，因其编码的氨基酸序列与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处，命名为E.coli Ras-like(era)基因[1]. era是细菌生存繁殖所必需的基因[2] . 以往认为era只是细菌中的基因，随着“基因组计划”研究的进展，发现在C. Elegans、小鼠及人中存在与该序列高度同源的真核表达序列标签[2]. 我们根据与细菌era序列同源的人EST已成功地克隆了全长Hera-cDNA基因(Genebank 收录号 AF082657). Era和细菌的细胞周期调控以及蛋白质的合成有关. 但有关人的Era方面的研究至今还未见报道. 为了研究Hera的理化特性，进一步了解其功能，我们开展了以下基础性的工作.
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1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5α菌种，pUC19质粒均为本教研室保存；表达质粒pGEX-4T3为Pharmacia公司产品. pBS-Hera为陈苏民教授提供. 各种限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶 均为Gibco公司产品. DNA marker和蛋白marker为Takara公司产品. 柱式质粒纯化试剂盒为华舜公司产品.
1.2 方法 PCR引物: 正向： 5-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG, 反向： 5-AACTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC. PCR反应以pBS-Hera为模板在PE公司9600反应仪上进行. 循环参数为96℃ 30 s; 60℃ 50 s; 72℃ 40 s; 30个循环. 纯化的PCR产物用BamHI和PstI双酶切定向克隆入pUC19质粒，转化E.coli JM109,进行蓝白筛选，并经酶切鉴定筛选出含插入片段的阳性克隆. 核苷酸序列分析利用PE公司310型测序仪进行序列测定. Hera基因与表达载体的重组,细菌转化及阳性克隆筛选按参考文献[3]进行. 目的蛋白的诱导表达：工程菌在含氨苄青霉素(100 mg*L-1)的LB培养液中32℃振荡过夜，次日按4%转接扩大培养，继续在32℃振荡2～4 h，当A600=0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol*L-1进行化学诱导表达. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：4℃ 9000 g离心5 min收集菌体，用含3 mL*L-1巯基乙醇加样缓冲液处理(100℃， 10 min)， 12 000 g离心10 min，采用Laemmli不连续PAGE，150 g*L-1分离胶，考马斯亮蓝R-250染色.
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2 结果
2.1 Hera基因的扩增 经PCR扩增获得Hera基因片段，大小与理论值相符(Fig 1).
图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig 1 Electrophoretic analysis of PCR products in agrose gel
A： DNA Marker DL2000; B： Amplification of Hera.
2.2 扩增片段的克隆与鉴定 Hera基因片段与pUC19的重组质粒经转化后，从培养板上随机挑选5个白色克隆，质粒经BamHI和PstI双酶切鉴定，都含有插入片段. 酶切鉴定结果见Fig 2.
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图2 重组pUC19-Hera质粒经BamHI和PstI酶切鉴定
Fig 2 Restriction mapping of recombinant plasmid pUC19-Hera with BamHI plus PstI
A: Recombinant plasmid pUC19-Hera digested with BamHI plus PstI; B: Recombinant plasmid pUC19-Hera; C: pUC19; D: λDNA/HindⅢ marker.
2.3 核苷酸序列测定 挑选一个含插入片段的阳性克隆命名为pUC19-Hera,以pUC19通用测序引物进行序列测定. 测序结果表明，所扩增的Hera基因与已知序列完全相符.
2.4 pGEX-Hera表达质粒的构建 用PstI酶切pUC19-Hera，Klenow补平，再用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳后，回收1038 bp目的片段；亚克隆入经BamHI和SmaI双酶切的pGEX-4T3载体，用氯化钙法转化DH5α感受态，用酶切鉴定法挑取克隆，将正确的阳性克隆命名pGEX-Hera. 酶切鉴定结果见Fig 3.
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图3 重组质粒pGEX-Hera经BamHI和NotI酶切鉴定
Fig 3 Restriction mapping of recombinant plasmid pGEX-Hera with BamHI plus NotI
A: Recombinant plasmid pGEX-Hera digested with BamHI plus NotI; B: Recombinant plasmid pGEX-Hera; C: pGEX-4T3; D: λDNA/HindⅢ marker.
2.5 重组pGEX-Hera在大肠杆菌中的表达 pGEX-Hera重组质粒进行化学诱导，收菌，经还原处理后作SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，与空白对照菌株比较，含pGEX-Hera的菌株在Mr 65 000处出现一条明显的新生蛋白带(Fig 4)，其含量随诱导时间的延长而增加，4～5 h最高，以后趋于稳定(Fig 5). 经5 h诱导后电泳薄层扫描显示新表达条带约占菌体总蛋白的23%.
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图4 重组Hera诱导表达后的SDS-PAGE结果
Fig 4 SDS-PAGE of expressed Hera in E.coli
A: Protein molecular weight marker B: Non-induced bacteria with pGEX-4T3; C: Induced bacteria with pGEX-4T3; D: Non-induced bacteria with pGEX-Hera; E: Induced bacteria with pGEX-Hera.
3 讨论
era是在细菌中能正常表达的基因，尽管其表达水平极低，但era基因缺失细菌就不能生存. 当Era功能减弱时，细菌的DNA虽能复制、子代DNA能分离，但细胞不能分裂，停滞在胞核分离和胞质分离之间，证明Era功能与细菌细胞分裂相关[2].
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era是从细菌到人高度保守的G蛋白基因, 人Era蛋白与大肠杆菌Era蛋白的氨基酸序列有30%相同，两者的相似性为53%[2]. era基因的N端含有4个鸟苷酸结合区(G1，G2，G3，G4). 高表达的Era蛋白特性显示：Era是一种G蛋白，能特异地与鸟苷酸结合，并具有GTP酶的活性[4]. era基因的C端也相当保守，且含有一个能与此同时RNA特异结合的KH domain[5]. 体外实验证明Era能与16sRNA结合，但RNA结合与GTP酶活性之间的关系还不清楚[6]. 总之，era是一种有别于Ras的小G蛋白家族的新成员.
图5 重组Hera不同时间诱导表达后的SDS-PAGE结果
Fig 5 SDS-PAGE of expressed Hera after the bacteria has been induced for different time
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A: Protein molecular mass marker; B: Non-induced bacteria with pGEX-Hera; C～H: Induced bacteria with pGEX-Hera from 1 to 6 h.
本研究通过基因重组的手段，利用GST融合表达载体在大肠杆菌高表达了Hera基因. 这就为Era的纯化、特性分析、抗体制备打下了基础.
编辑 许福明
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870380，39670006); 全军医药卫生科研基金资助项目(98M108)
作者简介：吴元明(1972-)， 男(汉族)， 安徽省东至县人. 硕士, 助教. Tel.(029)3374516 Ext.13 Email. wuyuanming@usa.net
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参考文献：
[1] Ahnn J, March PE, Takiff HE et al. A GTP-binding protein of Escherichia coli has homology to yeast RAS proteins [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1986; 83(3): 8849-8853.
[2] Britton RA, Powell BS, Dasgupta S et al. Cell cycle arrest in Era GTPase mutants: A potential growth rate regulated cell cycle checkpoint in Escherichia coli [J]. Mol Microbiol,1998;27(13):739-750.
[3] J.萨姆布鲁克, E.F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京： 科学出版社，1992：822-849.
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[4] 陈苏民， Court DL. 大肠杆菌中高表达重组Era可溶性蛋白的纯化及其生化特性[J]. 生物化学杂志,1992;8(1):33-41.
[5] Xin Chen, Court DL, Xin-Hua Ji. Crystal structure of Era: A GTPase-dependent cell cycle regulator containing an RNA binding motif [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999;96(2): 8396-8401.
[6] Meier TI, Peery RB, Jaskunas SR et al. 16S rRNA is bound to era of streptococcus pneumoniae [J]. J Bacteriol, 1999; 181(17): 5242-5249.
收稿日期:1999-03-03; 修回日期:1999-12-08, 百拇医药