尼古丁对小鼠巨噬细胞凋亡的影响
王昌惠 刘忠令 李强 李莉 钟晓松
摘 要 目的: 研究尼古丁对小鼠巨噬细胞(M
)凋亡的影响。方法:用不同浓度(10-8～10-2 mol/L)的尼古丁与小鼠腹腔M体外共同培养，测定M存活率；采用荧光染色和流式细胞术观察M凋亡的发生情况。结果:一定浓度(10-4～10-8 mol/L)的尼古丁对M凋亡具有抑制作用。结论:尼古丁可能通过抑制M凋亡在肺气肿的发病中起重要作用。
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关键词：巨噬细胞 凋亡 尼古丁
吸烟可引起肺气肿已成为共识，但其发生机制尚不完全明了。目前的观点认为：肺组织内的蛋白酶-抗蛋白酶系统的失衡对肺气肿的形成具有重要意义。蛋白酶主要由中性粒细胞和巨噬细胞(M)产生，而吸烟者肺泡内M明显增多，M释放的多种趋化因子可募集大量中性粒细胞，在肺气肿的发病中起重要作用[1]。因此研究肺泡M增多的原因，对了解吸烟引起肺气肿的机制，具有重要意义。本实验拟通过观察尼古丁对小鼠M凋亡的影响，阐述肺M增多的原因。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 M的制备 取2 月龄 BALB/c 小鼠(本校实验动物中心提供，体质量15～20 g)，处死后腹腔内注射RPMI 1640 10 ml，轻轻按摩后将腹腔内液体抽出，4℃离心(1 000 r/min×5 min)，PBS 液冲洗2 次。加入RPMI 1640+15%小牛血清，制成细胞密度为2 ×106个/ml的细胞悬液，加样于12孔培养板内，每孔1 ml，置于5% CO2培养箱中37℃培养24 h。取出培养板, 吸去培养液，加入RPMI 1640 1 ml , 用吸管轻轻吹打，吸去培养液，重复两次，贴壁生长的为M。再次加入RPMI 1640 +15 %小牛血清，5% CO2 37℃ 培养, 备用。
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1.2 观察指标
1.2.1 M体外存活率测定 每隔24 h取备用培养板内细胞2孔，锥虫蓝染色，用细胞计数板计数,计算每孔存活细胞数。取2孔平均值，重复3次，计算细胞存活率。
1.2.2 尼古丁对M存活率的影响 在培养备用的细胞培养板内加入不同浓度(10-8～10-2 mol/L)的尼古丁(Sigma 产品),每种浓度 12 孔。每隔2 4 h取不同浓度培养板内细胞2孔，锥虫蓝染色，计数，取2孔的平均值，并重复3次。
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1.2.3 尼古丁对M凋亡的影响 (1) 荧光染色观察[2]： 在已培养备用的细胞培养板内加入10-6 mol/L浓度的尼古丁，每隔24 h取培养板内细胞2 孔,4℃离心(1 000 r/min×5 min)，PBS 1 ml 重悬细胞，取细胞悬液 95 μl 和荧光染色液5 μl，混匀，37 ℃静置 5 min，吸一滴混合液点于载玻片上,直接用盖片封片，荧光显微镜下观察，计数 200 个细胞，重复 3 次，取平均值。 (2) 流式细胞术观察[3]： 在已培养备用的细胞培养板内加入10-6 mol/L浓度的尼古丁,每隔24 h取培养板内细胞2 孔,4℃离心(1 000 r/min×5 min)，PBS 1 ml 重悬细胞。取细胞混悬液 0.9 ml 加纯乙醇2.1 ml 混匀，4℃保存过夜，碘化丙啶(PI) 染色法染色，上流式细胞仪检测 DNA 含量。
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1.3 统计学处理 实验数据以χ2检验。
2 结果
2.1 M体外存活率 M体外存活时间约为2 周，体外培养1 周后存活率为(40.1±1.9)% 。
2.2 尼古丁对M存活率的影响 从表1中可以看出，尼古丁能提高M体外存活率，且以10-6 mol/L 浓度时作用最明显，此浓度与嗜烟者体内尼古丁浓度相近[4]。
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表1 不同浓度尼古丁对巨噬细胞存活率的影响
Tab 1 The effect of nicotine on the survival rate of macrophages
(n=6，X±s,%)
Group
Treatment time (t/h)
24
48
72
96
120
144
, 百拇医药
Control
78.2±1.5
56.5±2.6
50.9±2.4
46.3±1.7
41.3±1.9
40.1±1.9
Nicotine(cB/mol.L-1)
10-2
30.6±1.5
10.9±1.9
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0
0
0
0
10-4
78.5±2.1
67.9±2.2*
64.2±2.0*
46.5±2.0
40.2±1.9
39.6±1.4
10-6
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82.6±2.3
72.5±1.6*
66.8±1.4*
54.3±2.0*
52.3±1.1*
43.9±1.2
10-8
80.1±1.3
60.8±1.7
58.7±1.6*
, 百拇医药
48.3±1.5
48.2±2.2
46.5±2.3
*P<0.05 vs control group
2.3 M凋亡的观察 (1)荧光染色观察凋亡细胞为橙色，体积缩小，核固缩裂解，核仁靠边；而正常细胞则为绿色(图1，图见封四)。细胞凋亡率见图2。(2) 流式细胞仪检测结果，尼古丁对M凋亡有抑制作用，72 h作用明显，被尼古丁作用的细胞凋亡减少(图3)。
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巨噬细胞荧光染色结果
Fig1 The results of fluorescence dye on macrophages
图2 巨噬细胞凋亡率
Fig 2 Apoptosis rate of macrophages
○:Control group; ●:Nicotine group
, 百拇医药
图3 流式细胞术检测10-6 mol/L尼古丁作用
72 h后巨噬细胞凋亡情况
Fig 3 Identification of flow cytometry (shows the different
apoptic rate between the two groups in 72 hours)
A: Nicotine group; B:Control group
3 讨论
本研究结果显示，尼古丁通过抑制M凋亡，延长了体外M的存活时间，该结果目前尚未见有报道。M存活时间的延长在肺气肿的发病中具有其重要的病理意义。众所周知，吸烟者肺泡内M、中性粒细胞增多，以往的观点认为这与烟雾刺激M在肺泡聚集有关,这种情况往往伴随着明显的炎症反应和M的坏死，但吸烟者肺部并无明显的炎症反应和M坏死。因此，无法完全解释肺气肿的发病机制。
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细胞凋亡( apoptosis )，又称程序性细胞死亡(programed cell death, PCD)，是指有核细胞在一定条件下,启动其自身内部机制,主要是通过内源性DNA内切酶的激活，发生细胞自然死亡的过程。凋亡不同于坏死,其特征表现为:线粒体和溶酶体变化不大，但细胞核内很早就可见核内染色质凝集，进而核碎裂 细胞质固缩，细胞膜呈泡状。由于这种死亡没有溶酶体的破裂，细胞内涵物不外泄，故不引起炎症反应及明显的组织学改变，长期以来一直被人忽视。细胞发生自然死亡是生物体以一种与有丝分裂相反的方式调节细胞群体的方法，在生理情况下，它保证了生物体的正常发生、发展及其生命过程的顺利进行；在病理情况下,它是细胞群体平衡失调，导致一些疾病发生的重要原因[5]。因此，无论凋亡增加还是减少，都会给机体带来不利影响。M凋亡被抑制，肺泡内的M相对增加,并可释放出更多的蛋白酶和趋化因子，募集更多的中性粒细胞，中性粒细胞释放的蛋白酶同样对肺泡壁有破坏作用,二者共同作用，导致了肺气肿的发生。
, 百拇医药
近年的研究发现，尼古丁能抑制多种细胞的凋亡，其中肺癌的发生与尼古丁抑制细胞的凋亡有密切的关系[6]，尼古丁对M凋亡的抑制作用，其机制与抑制肿瘤细胞的凋亡有可能具有相似之处。尼古丁通过对细胞凋亡的抑制，在肺气肿以及其他疾病的发病中起重要作用。进一步研究抑制凋亡的机制，对防治肺气肿以及其他疾病的发病具有重要意义。
*国家自然科学基金资助项目，批准号3790066
作者简介：王昌惠，男，1963年9月生，博士生，主治医师
作者单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433
李莉 第二医大学长征医院检验科
, 百拇医药
钟晓松 上海肿瘤研究所
参考文献
1 John RH, Dennis EN. Pathogenesis of emphysema[J]. Chest, 1983,83(4): 679
2 钟晓松,童善庆,张希衡,等. 细胞凋亡荧光染色法检测肿瘤药物敏感性并与 MTT法的比较[J].中国肿瘤生物治疗杂志,1997,4(2):125
3 Hotz MA，Gong JP,Tragance F, et al. Flow cytometric dection of apoptosis: comparison of the assays of in situ DNA degradation and chromatin changes[J]. Cytometry, 1994,15(4):237
, 百拇医药
4 Aoshiba K,Nagai A,Yasui S,et al. Nicotine prolongs neutrophil survival by suppressing apoptosis[J].J Lab Clin Med， 1996，127(2): 186
5 Hetts SW. To die or not to die: an overview of apoptosis and its role in disease[J]. JAMA ,1998,279(4):300
6 Heusch WL, Maneckjee R. Signalling pathways involved in nicotine regulation of apoptosis of human lung cancer cells[J].Carcinogenesis， 1998，19(4):551, 百拇医药
摘 要 目的: 研究尼古丁对小鼠巨噬细胞(M
)凋亡的影响。方法:用不同浓度(10-8～10-2 mol/L)的尼古丁与小鼠腹腔M体外共同培养，测定M存活率；采用荧光染色和流式细胞术观察M凋亡的发生情况。结果:一定浓度(10-4～10-8 mol/L)的尼古丁对M凋亡具有抑制作用。结论:尼古丁可能通过抑制M凋亡在肺气肿的发病中起重要作用。, http://www.100md.com
关键词：巨噬细胞 凋亡 尼古丁
吸烟可引起肺气肿已成为共识，但其发生机制尚不完全明了。目前的观点认为：肺组织内的蛋白酶-抗蛋白酶系统的失衡对肺气肿的形成具有重要意义。蛋白酶主要由中性粒细胞和巨噬细胞(M
)产生，而吸烟者肺泡内M明显增多，M释放的多种趋化因子可募集大量中性粒细胞，在肺气肿的发病中起重要作用[1]。因此研究肺泡M增多的原因，对了解吸烟引起肺气肿的机制，具有重要意义。本实验拟通过观察尼古丁对小鼠M凋亡的影响，阐述肺M增多的原因。, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 M
的制备 取2 月龄 BALB/c 小鼠(本校实验动物中心提供，体质量15～20 g)，处死后腹腔内注射RPMI 1640 10 ml，轻轻按摩后将腹腔内液体抽出，4℃离心(1 000 r/min×5 min)，PBS 液冲洗2 次。加入RPMI 1640+15%小牛血清，制成细胞密度为2 ×106个/ml的细胞悬液，加样于12孔培养板内，每孔1 ml，置于5% CO2培养箱中37℃培养24 h。取出培养板, 吸去培养液，加入RPMI 1640 1 ml , 用吸管轻轻吹打，吸去培养液，重复两次，贴壁生长的为M。再次加入RPMI 1640 +15 %小牛血清，5% CO2 37℃ 培养, 备用。, 百拇医药
1.2 观察指标
1.2.1 M
体外存活率测定 每隔24 h取备用培养板内细胞2孔，锥虫蓝染色，用细胞计数板计数,计算每孔存活细胞数。取2孔平均值，重复3次，计算细胞存活率。1.2.2 尼古丁对M
存活率的影响 在培养备用的细胞培养板内加入不同浓度(10-8～10-2 mol/L)的尼古丁(Sigma 产品),每种浓度 12 孔。每隔2 4 h取不同浓度培养板内细胞2孔，锥虫蓝染色，计数，取2孔的平均值，并重复3次。, 百拇医药
1.2.3 尼古丁对M
凋亡的影响 (1) 荧光染色观察[2]： 在已培养备用的细胞培养板内加入10-6 mol/L浓度的尼古丁，每隔24 h取培养板内细胞2 孔,4℃离心(1 000 r/min×5 min)，PBS 1 ml 重悬细胞，取细胞悬液 95 μl 和荧光染色液5 μl，混匀，37 ℃静置 5 min，吸一滴混合液点于载玻片上,直接用盖片封片，荧光显微镜下观察，计数 200 个细胞，重复 3 次，取平均值。 (2) 流式细胞术观察[3]： 在已培养备用的细胞培养板内加入10-6 mol/L浓度的尼古丁,每隔24 h取培养板内细胞2 孔,4℃离心(1 000 r/min×5 min)，PBS 1 ml 重悬细胞。取细胞混悬液 0.9 ml 加纯乙醇2.1 ml 混匀，4℃保存过夜，碘化丙啶(PI) 染色法染色，上流式细胞仪检测 DNA 含量。, http://www.100md.com
1.3 统计学处理 实验数据以χ2检验。
2 结果
2.1 M
体外存活率 M体外存活时间约为2 周，体外培养1 周后存活率为(40.1±1.9)% 。2.2 尼古丁对M
存活率的影响 从表1中可以看出，尼古丁能提高M体外存活率，且以10-6 mol/L 浓度时作用最明显，此浓度与嗜烟者体内尼古丁浓度相近[4]。, http://www.100md.com
表1 不同浓度尼古丁对巨噬细胞存活率的影响
Tab 1 The effect of nicotine on the survival rate of macrophages
(n=6，X±s,%)
Group
Treatment time (t/h)
24
48
72
96
120
144
, 百拇医药
Control
78.2±1.5
56.5±2.6
50.9±2.4
46.3±1.7
41.3±1.9
40.1±1.9
Nicotine(cB/mol.L-1)
10-2
30.6±1.5
10.9±1.9
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0
0
0
0
10-4
78.5±2.1
67.9±2.2*
64.2±2.0*
46.5±2.0
40.2±1.9
39.6±1.4
10-6
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82.6±2.3
72.5±1.6*
66.8±1.4*
54.3±2.0*
52.3±1.1*
43.9±1.2
10-8
80.1±1.3
60.8±1.7
58.7±1.6*
, 百拇医药
48.3±1.5
48.2±2.2
46.5±2.3
*P<0.05 vs control group
2.3 M
凋亡的观察 (1)荧光染色观察凋亡细胞为橙色，体积缩小，核固缩裂解，核仁靠边；而正常细胞则为绿色(图1，图见封四)。细胞凋亡率见图2。(2) 流式细胞仪检测结果，尼古丁对M凋亡有抑制作用，72 h作用明显，被尼古丁作用的细胞凋亡减少(图3)。, 百拇医药
巨噬细胞荧光染色结果
Fig1 The results of fluorescence dye on macrophages
图2 巨噬细胞凋亡率
Fig 2 Apoptosis rate of macrophages
○:Control group; ●:Nicotine group
, 百拇医药
图3 流式细胞术检测10-6 mol/L尼古丁作用
72 h后巨噬细胞凋亡情况
Fig 3 Identification of flow cytometry (shows the different
apoptic rate between the two groups in 72 hours)
A: Nicotine group; B:Control group
3 讨论
本研究结果显示，尼古丁通过抑制M
凋亡，延长了体外M的存活时间，该结果目前尚未见有报道。M存活时间的延长在肺气肿的发病中具有其重要的病理意义。众所周知，吸烟者肺泡内M、中性粒细胞增多，以往的观点认为这与烟雾刺激M在肺泡聚集有关,这种情况往往伴随着明显的炎症反应和M的坏死，但吸烟者肺部并无明显的炎症反应和M坏死。因此，无法完全解释肺气肿的发病机制。, http://www.100md.com
细胞凋亡( apoptosis )，又称程序性细胞死亡(programed cell death, PCD)，是指有核细胞在一定条件下,启动其自身内部机制,主要是通过内源性DNA内切酶的激活，发生细胞自然死亡的过程。凋亡不同于坏死,其特征表现为:线粒体和溶酶体变化不大，但细胞核内很早就可见核内染色质凝集，进而核碎裂 细胞质固缩，细胞膜呈泡状。由于这种死亡没有溶酶体的破裂，细胞内涵物不外泄，故不引起炎症反应及明显的组织学改变，长期以来一直被人忽视。细胞发生自然死亡是生物体以一种与有丝分裂相反的方式调节细胞群体的方法，在生理情况下，它保证了生物体的正常发生、发展及其生命过程的顺利进行；在病理情况下,它是细胞群体平衡失调，导致一些疾病发生的重要原因[5]。因此，无论凋亡增加还是减少，都会给机体带来不利影响。M
凋亡被抑制，肺泡内的M相对增加,并可释放出更多的蛋白酶和趋化因子，募集更多的中性粒细胞，中性粒细胞释放的蛋白酶同样对肺泡壁有破坏作用,二者共同作用，导致了肺气肿的发生。, 百拇医药
近年的研究发现，尼古丁能抑制多种细胞的凋亡，其中肺癌的发生与尼古丁抑制细胞的凋亡有密切的关系[6]，尼古丁对M
凋亡的抑制作用，其机制与抑制肿瘤细胞的凋亡有可能具有相似之处。尼古丁通过对细胞凋亡的抑制，在肺气肿以及其他疾病的发病中起重要作用。进一步研究抑制凋亡的机制，对防治肺气肿以及其他疾病的发病具有重要意义。*国家自然科学基金资助项目，批准号3790066
作者简介：王昌惠，男，1963年9月生，博士生，主治医师
作者单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433
李莉 第二医大学长征医院检验科
, 百拇医药
钟晓松 上海肿瘤研究所
参考文献
1 John RH, Dennis EN. Pathogenesis of emphysema[J]. Chest, 1983,83(4): 679
2 钟晓松,童善庆,张希衡,等. 细胞凋亡荧光染色法检测肿瘤药物敏感性并与 MTT法的比较[J].中国肿瘤生物治疗杂志,1997,4(2):125
3 Hotz MA，Gong JP,Tragance F, et al. Flow cytometric dection of apoptosis: comparison of the assays of in situ DNA degradation and chromatin changes[J]. Cytometry, 1994,15(4):237
, 百拇医药
4 Aoshiba K,Nagai A,Yasui S,et al. Nicotine prolongs neutrophil survival by suppressing apoptosis[J].J Lab Clin Med， 1996，127(2): 186
5 Hetts SW. To die or not to die: an overview of apoptosis and its role in disease[J]. JAMA ,1998,279(4):300
6 Heusch WL, Maneckjee R. Signalling pathways involved in nicotine regulation of apoptosis of human lung cancer cells[J].Carcinogenesis， 1998，19(4):551, 百拇医药