去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的作用
郭德玉 陈意生 杜林林 卞修武
提 要 目的：探讨去甲二氢愈创木酸(Nordihydrognaiaretic acid,NDGA)对恶性胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的作用。方法：采用光镜和电镜观察移植瘤细胞的形态变化；用流式细胞仪进行细胞周期分析；用免疫组化检测肿瘤细胞中GFAP、PCNA的蛋白表达情况。结果：①NDGA可明显降低裸鼠移植瘤的成瘤率；②NDGA能抑制移植瘤细胞的生长和诱导其分化，使细胞增殖受阻于G1→S期。结论：NDGA在体内与体外有相同的抗胶质瘤作用。
关键词：去甲二氢愈创木酸 胶质瘤 裸鼠 移植瘤
去甲二氢愈创木酸是从常青灌木中提取的一种天然成分，是脂氧化酶的抑制剂，近年来发现其对胶质瘤等多种体外培养的肿瘤细胞具有抗肿瘤作用[1～3]。但其对体内肿瘤的作用如何，文献报道较少。本实验旨在通过观察NDGA对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞裸鼠移植瘤生长和分化的影响，初步探讨其体内抗胶质瘤作用。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养
人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44(第110代)引自苏州医学院附属二院脑肿瘤研究室，按我室常规方法培养。
1.2 裸鼠移植瘤模型制作
按本室建立的裸鼠移植瘤模型和文献[4]的方法进行。采用第三军医大学实验动物中心引进的远交系BALB/C nu/nu无胸腺裸鼠。鼠龄5～7周，体重15～20 g，两性兼用，饲养于净化室内。
1.3 实验分组
将裸鼠随机分为NDGA治疗组、生理盐水对照组和无移植瘤空白对照组，每组各6只。前两组裸鼠均用第5代移植瘤细胞悬液在胸前皮下接种瘤细胞约1×107个。治疗组于接种后第2周开始按27 mg/kg腹腔注射10 mmol/L NDGA，生理盐水对照组注射同体积的生理盐水。每隔3 d同剂量注射上述液1次。空白对照组不接种瘤细胞，也不做任何处理。接种后第40天终止观察，活杀取材(移植瘤、脑、心、肝和肾)。
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1.4 观察指标
1.4.1 动物一般状况，移植瘤成瘤情况。
1.4.2 移植瘤生长特性 每周测量移植瘤短径(a)和长径(b)，按文献[4]方法计算瘤重(RW)，公式为：RW=a2×b/2。
1.4.3 细胞动力学检测 取移植瘤细胞悬液，常规流式细胞仪制样，FACStarplus型流式细胞仪(Becton Dickinson公司)检测。每个样本随机测定1×104个细胞，并求出细胞增殖指数。计算方法为：增殖指数(%)=(S+G2/M)/(G1+S+G2/M)×100%。
1.4.4 移植瘤形态学观察 取移植瘤组织进行常规光、电镜制样、观察。
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1.4.5 移植瘤免疫组化染色 取移植瘤组织进行胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein,GFAP)、增殖细胞核抗原(Proliferated cell nuclear antigen,PCNA)免疫组化染色(S-P法)。所有载玻片均经APES处理，石蜡切片者经微波抗原修复15 min。
1.5 统计学处理
采用本校数理统计教研室的统计程序，进行两样本均数比较。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。
2 结果
2.1 荷瘤裸鼠情况
接种后裸鼠行动表现无特殊，于接种后1周末见皮下有1皮丘，较硬，后渐消退，并重新再生长出移植瘤。生理盐水对照组裸鼠净体重于接种第2周末开始下降，第3周末与NDGA治疗组差异显著(P<0.05)，第4、5周末两者差异非常显著(P<0.01)。裸鼠净体重的变化情况见图1。
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图1 裸鼠净重的变化
Fig 1 Changes of net weight of nude mice
2.2 移植瘤成瘤和生长情况
生理盐水对照组于接种第2周末裸鼠移植瘤接种成瘤率为100%(6/6)，而NDGA治疗组为50%(3/6)，至第4周末NDGA治疗组仍为50%，至第5周末NDGA治疗组才发展为83%。空白对照组裸鼠均未见肿瘤发生。
移植瘤大小也明显不同，接种第2周末生理盐水对照组移植瘤最大达1.2 cm×1.2 cm×1.0 cm，平均重量为(622±327)mg，而NDGA治疗组移植瘤最大为0.4 cm×0.8 cm×1.0 cm，平均重量为(21±31)mg，至第4周末生理盐水对照组移植瘤平均重量为(8 970±2 565)mg，并见部分移植瘤表面形成溃疡，而NDGA治疗组移植瘤平均重量为(583±709)mg，两者差异非常显著(P<0.01)。裸鼠移植瘤重量的变化情况见图2。
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图2 裸鼠移植瘤重量的变化
Fig 2 Changes of weight of xenograft
移植瘤细胞周期测定结果表明，NDGA治疗组第40天(S+G2/M)期细胞比例显著低于同时相点生理盐水对照组，而G0/G1期细胞比例则高于生理盐水对照组，细胞增殖指数明显降低(49.0%→30.2%)，细胞增殖受阻于G1→S期。各组移植瘤细胞周期分析结果见表1。
表1 移植瘤细胞周期分析(%)
Tab 1 Analysis of cell cycle of xenograft cells(%)
Groups
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Cell cycle
G1
S
G2/M
NDGA
69.9±1.61*
26.9±1.03*
3.3±0.16
Control
50.9±1.35
45.0±1.17
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4.0±0.12
*：P<0.01 vs control group
2.3 移植瘤形态学观察
对照组：移植瘤肿块较大，与皮肤粘连紧密，部分肿块表面见溃疡形成，见图3，光镜下见移植瘤组织由密集的成束排列的瘤细胞组成，瘤细胞呈粗梭形，平行或交织状排列，核大深染，以单核为主，病理性核分裂象常见。间质较少，仅有薄壁微血管。瘤细胞向周围包膜内浸润性生长。部分瘤组织中央区域出现一些变性、坏死。移植瘤不同区域瘤细胞形态和分化程度基本一致。电镜下见瘤细胞核膜内陷形成核内小管及核内假包涵体，核仁易见，大部分瘤细胞胞浆内胶质细丝稀疏而短或缺乏。细胞突起较少，有少量微绒毛。
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图3 接种后40天部分裸鼠
上排：NDGA治疗组；下排：生理盐水对照组
Fig 3 Parts of nude mice, 40 d after implantation
Upper:NDGA group； Lower: Control group
治疗组：移植瘤肿块较小，与皮肤粘连不如对照组紧密，表面未见溃疡形成，见图3，光镜下见瘤细胞排列较对照组稀疏，呈细梭形，出现大片和灶性高分化区。胞浆较丰富、红染，核细长，分裂象少见。电镜下见瘤细胞的胞浆内出现成束的胶质细丝，有些胞浆线粒体嵴断裂、空泡化和髓鞘样结构形成。细胞外间隙内见很多细长的胞突和不规则的微绒毛交织在一起，并见一些细小伪足形成。部分瘤组织区域内见瘤细胞核异染色质边集、结块或核固缩，胞浆内细胞器稀少。
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2.4 免疫组化染色结果
对照组移植瘤细胞GFAP弱阳性，PCNA标记指数较高，平均为62.4%。治疗组瘤细胞GFAP增强，PCNA标记指数降低为43.6%，两组比较差异显著(P<0.05)，见图4。
图4 移植瘤细胞PCNA蛋白表达情况
左：NDGA治疗组；右：生理盐水对照组 (S-P×200)
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Fig 4 Protein expression of PCNA in xenograft cells
Left:NDGA group; Right: Control group (S-P×200)
2.5 荷瘤裸鼠主要脏器观察
光镜下未发现心、肝、脑和肾有明显病变。
3 讨论
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，因其位置特殊和侵袭性生长，手术很难切净，复发率高，预后极差，因此，化疗常是必不可少的治疗措施。而传统的化疗方法毒副作用大，且易产生抗药性，所以，寻找低毒高效的药物新疗法对临床治疗恶性胶质瘤十分有意义，其中诱导分化治疗是一种特别有吸引力的治疗策略[5～7]。
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肿瘤的诱导分化治疗不同于传统的化疗，它不直接杀伤癌细胞，而是诱导其重新获得向成熟细胞分化的能力。最近发现NDGA能抑制体外培养的多种肿瘤细胞的增殖和诱导其分化，但到目前为止，对体内肿瘤细胞生长、分化作用的报道较少。本实验结果表明，NDGA有抑制人脑胶质瘤裸鼠移植瘤的形成、生长和诱导其分化的作用，主要表现为裸鼠移植瘤成瘤率降低、所形成的肿瘤生长缓慢、瘤细胞异型性减小、胞浆中胶质细丝增多，瘤细胞增殖活性减弱、细胞增殖受阻于G1→S期等。这些改变与体外实验结果一致，且对荷瘤裸鼠主要脏器无明显毒性。结果初步证实了NDGA不仅对体外培养的胶质瘤细胞有增殖抑制和诱导分化作用，而且对裸鼠体内移植瘤细胞具有相同的抗胶质瘤作用，为NDGA的临床应用提供了实验依据。
*国家自然科学基金资助项目，No.39670296
作者简介：郭德玉，男，32岁，讲师，博士
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作者单位：郭德玉 陈意生 杜林林 卞修武(第三军医大学基础医学部病理学教研室) 重庆，400038
参考文献
1 Wilson D E, Di Gianfilippo A, Orey F G, et al. Effect of nordihydroguaiaretic acid on culture rat and human glioma cell proliferation. J Neurosurg,1989,71(4):551
2 Wilson D E, Anderson K M, Seed T M, et al. Ultrastructural evidece for differentiation in a human glioblastoma cell line treated with inhibitor of eicosanoid metabolism. Neurosurgery,1990,27(4):523
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3 郭德玉，陈意生，史景泉，等.去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞增殖和分化的影响.第三军医大学学报，1999，21(1)：9
4 黄 强，杜子威，徐庚达，等.人脑胶质瘤细胞系裸小鼠实体瘤模型NHG-1的建立及其特征的研究.中华肿瘤杂志，1987，9(4)：269
5 Ebert P S,Salcman M.Differentiation therapy is potentiated by chemotherapy and hyperthermia in human and canine brain tumor cells in vitro. Neurosurgery,1994,34(4):657
6 Beere H M, Hickman J A. Differentiation: A suitable strategy for cancer therapy? Anticancer Drug Des,1993,8(4):299
7 Engelhard H H, Duncan H A, Canto M D. Molecular characterization of glioblastoma cell differentiation. Neurosurgery,1997,41(4):886, http://www.100md.com
提 要 目的：探讨去甲二氢愈创木酸(Nordihydrognaiaretic acid,NDGA)对恶性胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的作用。方法：采用光镜和电镜观察移植瘤细胞的形态变化；用流式细胞仪进行细胞周期分析；用免疫组化检测肿瘤细胞中GFAP、PCNA的蛋白表达情况。结果：①NDGA可明显降低裸鼠移植瘤的成瘤率；②NDGA能抑制移植瘤细胞的生长和诱导其分化，使细胞增殖受阻于G1→S期。结论：NDGA在体内与体外有相同的抗胶质瘤作用。
关键词：去甲二氢愈创木酸 胶质瘤 裸鼠 移植瘤
去甲二氢愈创木酸是从常青灌木中提取的一种天然成分，是脂氧化酶的抑制剂，近年来发现其对胶质瘤等多种体外培养的肿瘤细胞具有抗肿瘤作用[1～3]。但其对体内肿瘤的作用如何，文献报道较少。本实验旨在通过观察NDGA对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞裸鼠移植瘤生长和分化的影响，初步探讨其体内抗胶质瘤作用。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养
人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44(第110代)引自苏州医学院附属二院脑肿瘤研究室，按我室常规方法培养。
1.2 裸鼠移植瘤模型制作
按本室建立的裸鼠移植瘤模型和文献[4]的方法进行。采用第三军医大学实验动物中心引进的远交系BALB/C nu/nu无胸腺裸鼠。鼠龄5～7周，体重15～20 g，两性兼用，饲养于净化室内。
1.3 实验分组
将裸鼠随机分为NDGA治疗组、生理盐水对照组和无移植瘤空白对照组，每组各6只。前两组裸鼠均用第5代移植瘤细胞悬液在胸前皮下接种瘤细胞约1×107个。治疗组于接种后第2周开始按27 mg/kg腹腔注射10 mmol/L NDGA，生理盐水对照组注射同体积的生理盐水。每隔3 d同剂量注射上述液1次。空白对照组不接种瘤细胞，也不做任何处理。接种后第40天终止观察，活杀取材(移植瘤、脑、心、肝和肾)。
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1.4 观察指标
1.4.1 动物一般状况，移植瘤成瘤情况。
1.4.2 移植瘤生长特性 每周测量移植瘤短径(a)和长径(b)，按文献[4]方法计算瘤重(RW)，公式为：RW=a2×b/2。
1.4.3 细胞动力学检测 取移植瘤细胞悬液，常规流式细胞仪制样，FACStarplus型流式细胞仪(Becton Dickinson公司)检测。每个样本随机测定1×104个细胞，并求出细胞增殖指数。计算方法为：增殖指数(%)=(S+G2/M)/(G1+S+G2/M)×100%。
1.4.4 移植瘤形态学观察 取移植瘤组织进行常规光、电镜制样、观察。
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1.4.5 移植瘤免疫组化染色 取移植瘤组织进行胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein,GFAP)、增殖细胞核抗原(Proliferated cell nuclear antigen,PCNA)免疫组化染色(S-P法)。所有载玻片均经APES处理，石蜡切片者经微波抗原修复15 min。
1.5 统计学处理
采用本校数理统计教研室的统计程序，进行两样本均数比较。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。
2 结果
2.1 荷瘤裸鼠情况
接种后裸鼠行动表现无特殊，于接种后1周末见皮下有1皮丘，较硬，后渐消退，并重新再生长出移植瘤。生理盐水对照组裸鼠净体重于接种第2周末开始下降，第3周末与NDGA治疗组差异显著(P<0.05)，第4、5周末两者差异非常显著(P<0.01)。裸鼠净体重的变化情况见图1。
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图1 裸鼠净重的变化
Fig 1 Changes of net weight of nude mice
2.2 移植瘤成瘤和生长情况
生理盐水对照组于接种第2周末裸鼠移植瘤接种成瘤率为100%(6/6)，而NDGA治疗组为50%(3/6)，至第4周末NDGA治疗组仍为50%，至第5周末NDGA治疗组才发展为83%。空白对照组裸鼠均未见肿瘤发生。
移植瘤大小也明显不同，接种第2周末生理盐水对照组移植瘤最大达1.2 cm×1.2 cm×1.0 cm，平均重量为(622±327)mg，而NDGA治疗组移植瘤最大为0.4 cm×0.8 cm×1.0 cm，平均重量为(21±31)mg，至第4周末生理盐水对照组移植瘤平均重量为(8 970±2 565)mg，并见部分移植瘤表面形成溃疡，而NDGA治疗组移植瘤平均重量为(583±709)mg，两者差异非常显著(P<0.01)。裸鼠移植瘤重量的变化情况见图2。
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图2 裸鼠移植瘤重量的变化
Fig 2 Changes of weight of xenograft
移植瘤细胞周期测定结果表明，NDGA治疗组第40天(S+G2/M)期细胞比例显著低于同时相点生理盐水对照组，而G0/G1期细胞比例则高于生理盐水对照组，细胞增殖指数明显降低(49.0%→30.2%)，细胞增殖受阻于G1→S期。各组移植瘤细胞周期分析结果见表1。
表1 移植瘤细胞周期分析(%)
Tab 1 Analysis of cell cycle of xenograft cells(%)
Groups
, 百拇医药
Cell cycle
G1
S
G2/M
NDGA
69.9±1.61*
26.9±1.03*
3.3±0.16
Control
50.9±1.35
45.0±1.17
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4.0±0.12
*：P<0.01 vs control group
2.3 移植瘤形态学观察
对照组：移植瘤肿块较大，与皮肤粘连紧密，部分肿块表面见溃疡形成，见图3，光镜下见移植瘤组织由密集的成束排列的瘤细胞组成，瘤细胞呈粗梭形，平行或交织状排列，核大深染，以单核为主，病理性核分裂象常见。间质较少，仅有薄壁微血管。瘤细胞向周围包膜内浸润性生长。部分瘤组织中央区域出现一些变性、坏死。移植瘤不同区域瘤细胞形态和分化程度基本一致。电镜下见瘤细胞核膜内陷形成核内小管及核内假包涵体，核仁易见，大部分瘤细胞胞浆内胶质细丝稀疏而短或缺乏。细胞突起较少，有少量微绒毛。
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图3 接种后40天部分裸鼠
上排：NDGA治疗组；下排：生理盐水对照组
Fig 3 Parts of nude mice, 40 d after implantation
Upper:NDGA group； Lower: Control group
治疗组：移植瘤肿块较小，与皮肤粘连不如对照组紧密，表面未见溃疡形成，见图3，光镜下见瘤细胞排列较对照组稀疏，呈细梭形，出现大片和灶性高分化区。胞浆较丰富、红染，核细长，分裂象少见。电镜下见瘤细胞的胞浆内出现成束的胶质细丝，有些胞浆线粒体嵴断裂、空泡化和髓鞘样结构形成。细胞外间隙内见很多细长的胞突和不规则的微绒毛交织在一起，并见一些细小伪足形成。部分瘤组织区域内见瘤细胞核异染色质边集、结块或核固缩，胞浆内细胞器稀少。
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2.4 免疫组化染色结果
对照组移植瘤细胞GFAP弱阳性，PCNA标记指数较高，平均为62.4%。治疗组瘤细胞GFAP增强，PCNA标记指数降低为43.6%，两组比较差异显著(P<0.05)，见图4。
图4 移植瘤细胞PCNA蛋白表达情况
左：NDGA治疗组；右：生理盐水对照组 (S-P×200)
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Fig 4 Protein expression of PCNA in xenograft cells
Left:NDGA group; Right: Control group (S-P×200)
2.5 荷瘤裸鼠主要脏器观察
光镜下未发现心、肝、脑和肾有明显病变。
3 讨论
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，因其位置特殊和侵袭性生长，手术很难切净，复发率高，预后极差，因此，化疗常是必不可少的治疗措施。而传统的化疗方法毒副作用大，且易产生抗药性，所以，寻找低毒高效的药物新疗法对临床治疗恶性胶质瘤十分有意义，其中诱导分化治疗是一种特别有吸引力的治疗策略[5～7]。
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肿瘤的诱导分化治疗不同于传统的化疗，它不直接杀伤癌细胞，而是诱导其重新获得向成熟细胞分化的能力。最近发现NDGA能抑制体外培养的多种肿瘤细胞的增殖和诱导其分化，但到目前为止，对体内肿瘤细胞生长、分化作用的报道较少。本实验结果表明，NDGA有抑制人脑胶质瘤裸鼠移植瘤的形成、生长和诱导其分化的作用，主要表现为裸鼠移植瘤成瘤率降低、所形成的肿瘤生长缓慢、瘤细胞异型性减小、胞浆中胶质细丝增多，瘤细胞增殖活性减弱、细胞增殖受阻于G1→S期等。这些改变与体外实验结果一致，且对荷瘤裸鼠主要脏器无明显毒性。结果初步证实了NDGA不仅对体外培养的胶质瘤细胞有增殖抑制和诱导分化作用，而且对裸鼠体内移植瘤细胞具有相同的抗胶质瘤作用，为NDGA的临床应用提供了实验依据。
*国家自然科学基金资助项目，No.39670296
作者简介：郭德玉，男，32岁，讲师，博士
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作者单位：郭德玉 陈意生 杜林林 卞修武(第三军医大学基础医学部病理学教研室) 重庆，400038
参考文献
1 Wilson D E, Di Gianfilippo A, Orey F G, et al. Effect of nordihydroguaiaretic acid on culture rat and human glioma cell proliferation. J Neurosurg,1989,71(4):551
2 Wilson D E, Anderson K M, Seed T M, et al. Ultrastructural evidece for differentiation in a human glioblastoma cell line treated with inhibitor of eicosanoid metabolism. Neurosurgery,1990,27(4):523
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3 郭德玉，陈意生，史景泉，等.去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞增殖和分化的影响.第三军医大学学报，1999，21(1)：9
4 黄 强，杜子威，徐庚达，等.人脑胶质瘤细胞系裸小鼠实体瘤模型NHG-1的建立及其特征的研究.中华肿瘤杂志，1987，9(4)：269
5 Ebert P S,Salcman M.Differentiation therapy is potentiated by chemotherapy and hyperthermia in human and canine brain tumor cells in vitro. Neurosurgery,1994,34(4):657
6 Beere H M, Hickman J A. Differentiation: A suitable strategy for cancer therapy? Anticancer Drug Des,1993,8(4):299
7 Engelhard H H, Duncan H A, Canto M D. Molecular characterization of glioblastoma cell differentiation. Neurosurgery,1997,41(4):886, http://www.100md.com