脑缺氧诱导的大鼠大脑皮层神经元大电导NMDA受体通道开放
王中峰黎海蒂 万子兵 罗全生
提 要 目的：研究缺氧对大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道的影响。方法：细胞贴附膜片箝记录法。结果：缺氧除显著增加35 pS和100 pS NMDA受体通道的开放概率外，记录到一种电导达258 pS的NMDA受体通道亚型开放，该通道至少有3种开放状态：长时间开放、短暂开放、长时间和短暂开放在同一膜片上出现。通道在整个记录过程中开放概率较低。结论：缺氧可诱导大鼠大脑皮层神经元出现一大电导NMDA受体通道开放，它可能在缺氧病理过程中起重要作用。
关键词：缺氧 神经元 NMDA受体 离子通道 膜片箝技术 大鼠
兴奋性氨基酸是哺乳类动物中枢神经系统内的主要兴奋性神经递质，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体是重要的兴奋性氨基酸受体，它形成阳离子选择性离子通道，即NMDA受体通道，介导广泛的生理和病理过程，包括兴奋性突触传递，突触可塑性和兴奋毒等[1～3]。NMDA通道复合体在结合了两分子的谷氨酸和两分子的甘氨酸后通道开放，产生阳离子的跨膜流动，其中以Ca2+为主[4～6]。通道开放呈多电导状态，其电导一般分为小电导和大电导两组[7]。作者在用膜片箝细胞贴附结构研究缺氧状态下大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道特性时，发现缺氧诱导的大电导NMDA受体通道亚型开放，并对其单通道特性进行了初步分析。
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1 材料与方法
1.1 大鼠大脑皮层神经元分离
参照文献[8]进行，将2～4周龄的Wistar大鼠断头取脑，分离脑皮层，并切成400～500 μm的冠状脑片，在通混合氧气(95%O2+5%CO2)的人工脑脊液(成分mmol.L-1：NaCl 126,KCl 5, NaH2PO4 1.25, NaHCO3 26, CaCl2 2,MgSO42，葡萄糖10，pH7.2)中孵育30min，后在含0.1%胰蛋白酶的2ml人工脑脊液中消化30min。用尖端火抛光的Pasteur吸管吹打，使组织分散。静置10 min后吸取上清液，滴加于事先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上使细胞贴壁。加入浴液即可进行记录。分离过程在室温(23±1)°C下进行。
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1.2 试剂
胰蛋白酶，多聚赖氨酸，NMDA和L-甘氨酸均为Sigma公司产品，其余均为国产分析纯。
1.3 溶液及缺氧模型
细胞浴液(mmol.L-1)：NaCl 140,CsCl25, CaCl21.8, HEPES 10, TTX 0.001，葡萄糖10，pH7.2。电极液：NMDA 20 μmol.L-1，L-甘氨酸1 μmol.L-1，不含葡萄糖，其余同正常浴液，将贴附有细胞的盖玻片放入培养皿中，加入细胞浴液，记录通道的电活动作为对照。去除细胞浴液中的葡萄糖，通混合氮气(95%N2+5%CO2)饱和1 h以上(氧分压9.16 kPa，美国LI-1620血气分析仪)。将此液加入放置有细胞的培养皿中，建立细胞缺氧模型[9]。
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1.4 单通道记录
采用膜片箝细胞贴附式结构记录通道电流[10]。用微电极拉制器(PP-83,Narishige, Japan)两步拉制微电极，电极尖端直径1～1.5 μm，经涂胶，热抛光和充灌电极液后，电极电阻4～6 MΩ。单通道电流经膜片箝放大器(CEZ-2200,Nihon Kohedn,Japan)放大，1 kHz低频滤波后，用Digidata 1200采集板和pClamp软件(6.02版，Axon Instrument,USA)将信号采入微机，用Fetchex程序不间断采样，采样频率20 kHz。细胞箝制电位-80 mV。所有实验在室温下进行(23～25°C)。
2 结果
在急性分离的大鼠大脑皮层神经元膜上，用细胞贴附式膜片箝记录结构，以NMDA和L-甘氨酸为激动剂，记录到的NMDA受体通道如图1所示，细胞箝制电位在-80 mV时，通道开放的电导值分别为10 pS(图1A，n=6)，20 pS(图1B，n=8),35、50 pS(图1C,n=6)和100 pS(图1D，n=8)等。相应的电流水平分别为：(0.78±0.09)pA，(1.63±0.16)pA, (2.79±0.14)pA, (4.12±0.71)pA，(7.97±0.05)pA。各种电导水平的开放以短暂开放模式为主，其中10 pS通道既有短暂开放，也有长时间簇状(Burst)开放，在簇状开放中有短暂的关闭状态。
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在缺氧状态下，NMDA受体通道被显著激活，在所记录的21个细胞膜片上，35 pS和100 pS通道最常见，其开放概率比正常情况下显著增加(见图2，四条曲线为不间断记录，另文分析)。有趣的是在9个膜片上记录出一种开放电流达(20.7±1.5)pA，通道电导达(258±18)pS的亚型，该通道的开放有3种状态：①长时间开放状态，可被短暂的关闭所中断，其开放可与50 pS之间相互转换，见图3A；②短暂的开放状态，通道呈高频率短暂开放，即开关状态快速转化，见图3B和3C；③长时间开放和短暂开放在同一细胞上相继出现，见图3D。分析通道的开关状态发现，大多数情况下，该通道开放直接由关闭状态转换而来，在簇状开放的过程中，可与其它电导水平转化后关闭。长时间开放状态的出现并不是连续不断的，而是在开放一次经历较长时间后才会再次出现，短暂开放则可重复出现。
图1 缺氧状态下大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道258 pS单通道记录图 箝制电位-80 mV
此外，在实验过程中还记录到一例更大电导的NMDA受体通道开放，电流达42.5 pA，电导值为532 pS。在此细胞膜片上，缺氧诱导的其它电导开放显著减少，仅见到100 pS通道的短暂少量开放。因仅此一例，故没有作进一步分析，见图4。
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图2 缺氧状态下大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道532 pS单通道记录图 箝制电位-80 mV
3 讨论
本研究在急性分离的大鼠大脑皮层神经元膜上，用膜片箝单通道记录技术，研究缺氧对NMDA受体通道的影响，用20 μmol*L-1的NMDA和1 μmol*L-1的甘氨酸来激动NMDA受体，记录到多个电导水平的通道开放，包括小电导和大电导两大类，此与文献[7]报道的在海马神经元上记录结果基本一致。在缺氧状态下，NMDA受体通道开放概率显著增加，其中以大电导类的35 pS和100 pS为主，而非小电导通道亚型，由于大电导NMDA受体通道对Ca2+有选择性通透，故可导致Ca2+内流增加，参与胞内Ca2+聚集[11～13]。本实验记录到的电导达258 pS的NMDA受体通道亚型，是由缺氧诱导的，因为在正常浴液情况下，没有记录到此亚型的通道开放。在缺氧的过程中，其开放的概率不高，往往和其它亚型在同一膜片上诱发开放，而且可以和其它电导水平之间相互转换，但更多的是直接由关闭状态转化开放。出现此大电导开放的可能原因有：一是封接的膜片上有2个或更多的通道开放叠加所致；另一是新的亚型通道，而前一种可能性较小，因为所用的电极尖端直径较小，而且在正常情况下，没有观察到此电导水平的开放，因此，作者认为，这是由缺氧诱导的NMDA受体通道亚型开放，这种亚型通道的开放可能是加速胞内Ca2+增高的因素之一。由于在缺氧状态下胞内Ca2+聚集是导致细胞损伤的启动因素之一，因此，大电导NMDA受体通道的开放在缺氧细胞病理损伤中可能起有重要作用。但这还需要更多的实验来进一步证实。
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*重庆市中青年科技专家基金资助项目
**王中峰，男，34岁，讲师，博士，现为中国科学院上海生理研究所博士后 上海，200031
作者单位：王中峰黎海蒂 万子兵 罗全生 第三军医大学基础医学部生理学教研室 重庆，400038
参考文献
1 Choi D W, Rothman S M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annu Rev Neurosci,1990,13:171
2 Contantine-Paton M, Cline H T, Debski E. Patterned activity, synaptic convergence and NMDA receptor in develo-ping visual pathways.Annu Rev Neurosci,1990,13:129
, 百拇医药
3 Bliss TVP,Collingridge G L. A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus. Nature,1993,361(6407):31
4 Clements J D, Westbrook G L. Activation kinetics reveal the number of glutamate and glycine bingding sites on the N-methyl-D-aspartate receptor. Neuron,1991,7(4):605
5 Kohr G, Koninck Y D, Mody I. Properties of NMDA receptor channels in neurons acutely isolated from epileptic(kindled) rats. J Neurosci,1993,13(8):3612
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6 高天明，邹 飞，陈培熹.大脑皮层神经元NMDA受体的单通道特性.生理学报，1995，47(2)：133
7 Jahr C E, Stevens C F. Glutamate activates multiple single channel conductances in hippocampal neurons.Nature,1987,325(5):522
8 唐向东，佟振清，杨文俊.一种改进的适用膜片箝记录的急性神经元分离方法.生理学通报，1994，11(1)：60
9 Harata N, Wu J, Ishibashi H, et al. Run-down of the GABAA response under experimental ischemia in acutely dissociated CA1 pyramidal neurones of the rat. J Physiol,1997,500:673
, 百拇医药
10 Hamill O P, Marty A, Neher E, et al. Improved patch-clamp technique for high-resolution current recording from cell and cell-free membrane patches. Pflugers Arch,1981,391(1):85
11 Salinska E, Pluta R, Puka M, et al. Blockade of N-methyl-D-aspartate-sensitive excitatory amino acid receptors with 2-amino-5-phosphovalerate reduces ischemia-evoked calcium redistribution in rabbit hippocampus. Exp Neurol,1991,112(1):89
12 Xia Y X, Zacharias E, Hoff P, et al. Ion channel involvement in anoxic depolarization induced by cardiac arrest in rat brain. J Cereb Blood Fluid Metab,1995,15(4):587
13 Mitani A, Yanase H, Sakai K, et al. Origin of intracellular Ca2+ elevation induced by in vitro ischemia-like condition in hippocampal slices. Brain Res,1993,601(1):103, 百拇医药(王中峰黎海蒂 万子兵 罗全生)
提 要 目的：研究缺氧对大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道的影响。方法：细胞贴附膜片箝记录法。结果：缺氧除显著增加35 pS和100 pS NMDA受体通道的开放概率外，记录到一种电导达258 pS的NMDA受体通道亚型开放，该通道至少有3种开放状态：长时间开放、短暂开放、长时间和短暂开放在同一膜片上出现。通道在整个记录过程中开放概率较低。结论：缺氧可诱导大鼠大脑皮层神经元出现一大电导NMDA受体通道开放，它可能在缺氧病理过程中起重要作用。
关键词：缺氧 神经元 NMDA受体 离子通道 膜片箝技术 大鼠
兴奋性氨基酸是哺乳类动物中枢神经系统内的主要兴奋性神经递质，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体是重要的兴奋性氨基酸受体，它形成阳离子选择性离子通道，即NMDA受体通道，介导广泛的生理和病理过程，包括兴奋性突触传递，突触可塑性和兴奋毒等[1～3]。NMDA通道复合体在结合了两分子的谷氨酸和两分子的甘氨酸后通道开放，产生阳离子的跨膜流动，其中以Ca2+为主[4～6]。通道开放呈多电导状态，其电导一般分为小电导和大电导两组[7]。作者在用膜片箝细胞贴附结构研究缺氧状态下大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道特性时，发现缺氧诱导的大电导NMDA受体通道亚型开放，并对其单通道特性进行了初步分析。
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1 材料与方法
1.1 大鼠大脑皮层神经元分离
参照文献[8]进行，将2～4周龄的Wistar大鼠断头取脑，分离脑皮层，并切成400～500 μm的冠状脑片，在通混合氧气(95%O2+5%CO2)的人工脑脊液(成分mmol.L-1：NaCl 126,KCl 5, NaH2PO4 1.25, NaHCO3 26, CaCl2 2,MgSO42，葡萄糖10，pH7.2)中孵育30min，后在含0.1%胰蛋白酶的2ml人工脑脊液中消化30min。用尖端火抛光的Pasteur吸管吹打，使组织分散。静置10 min后吸取上清液，滴加于事先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上使细胞贴壁。加入浴液即可进行记录。分离过程在室温(23±1)°C下进行。
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1.2 试剂
胰蛋白酶，多聚赖氨酸，NMDA和L-甘氨酸均为Sigma公司产品，其余均为国产分析纯。
1.3 溶液及缺氧模型
细胞浴液(mmol.L-1)：NaCl 140,CsCl25, CaCl21.8, HEPES 10, TTX 0.001，葡萄糖10，pH7.2。电极液：NMDA 20 μmol.L-1，L-甘氨酸1 μmol.L-1，不含葡萄糖，其余同正常浴液，将贴附有细胞的盖玻片放入培养皿中，加入细胞浴液，记录通道的电活动作为对照。去除细胞浴液中的葡萄糖，通混合氮气(95%N2+5%CO2)饱和1 h以上(氧分压9.16 kPa，美国LI-1620血气分析仪)。将此液加入放置有细胞的培养皿中，建立细胞缺氧模型[9]。
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1.4 单通道记录
采用膜片箝细胞贴附式结构记录通道电流[10]。用微电极拉制器(PP-83,Narishige, Japan)两步拉制微电极，电极尖端直径1～1.5 μm，经涂胶，热抛光和充灌电极液后，电极电阻4～6 MΩ。单通道电流经膜片箝放大器(CEZ-2200,Nihon Kohedn,Japan)放大，1 kHz低频滤波后，用Digidata 1200采集板和pClamp软件(6.02版，Axon Instrument,USA)将信号采入微机，用Fetchex程序不间断采样，采样频率20 kHz。细胞箝制电位-80 mV。所有实验在室温下进行(23～25°C)。
2 结果
在急性分离的大鼠大脑皮层神经元膜上，用细胞贴附式膜片箝记录结构，以NMDA和L-甘氨酸为激动剂，记录到的NMDA受体通道如图1所示，细胞箝制电位在-80 mV时，通道开放的电导值分别为10 pS(图1A，n=6)，20 pS(图1B，n=8),35、50 pS(图1C,n=6)和100 pS(图1D，n=8)等。相应的电流水平分别为：(0.78±0.09)pA，(1.63±0.16)pA, (2.79±0.14)pA, (4.12±0.71)pA，(7.97±0.05)pA。各种电导水平的开放以短暂开放模式为主，其中10 pS通道既有短暂开放，也有长时间簇状(Burst)开放，在簇状开放中有短暂的关闭状态。
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在缺氧状态下，NMDA受体通道被显著激活，在所记录的21个细胞膜片上，35 pS和100 pS通道最常见，其开放概率比正常情况下显著增加(见图2，四条曲线为不间断记录，另文分析)。有趣的是在9个膜片上记录出一种开放电流达(20.7±1.5)pA，通道电导达(258±18)pS的亚型，该通道的开放有3种状态：①长时间开放状态，可被短暂的关闭所中断，其开放可与50 pS之间相互转换，见图3A；②短暂的开放状态，通道呈高频率短暂开放，即开关状态快速转化，见图3B和3C；③长时间开放和短暂开放在同一细胞上相继出现，见图3D。分析通道的开关状态发现，大多数情况下，该通道开放直接由关闭状态转换而来，在簇状开放的过程中，可与其它电导水平转化后关闭。长时间开放状态的出现并不是连续不断的，而是在开放一次经历较长时间后才会再次出现，短暂开放则可重复出现。
图1 缺氧状态下大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道258 pS单通道记录图 箝制电位-80 mV
此外，在实验过程中还记录到一例更大电导的NMDA受体通道开放，电流达42.5 pA，电导值为532 pS。在此细胞膜片上，缺氧诱导的其它电导开放显著减少，仅见到100 pS通道的短暂少量开放。因仅此一例，故没有作进一步分析，见图4。
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图2 缺氧状态下大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道532 pS单通道记录图 箝制电位-80 mV
3 讨论
本研究在急性分离的大鼠大脑皮层神经元膜上，用膜片箝单通道记录技术，研究缺氧对NMDA受体通道的影响，用20 μmol*L-1的NMDA和1 μmol*L-1的甘氨酸来激动NMDA受体，记录到多个电导水平的通道开放，包括小电导和大电导两大类，此与文献[7]报道的在海马神经元上记录结果基本一致。在缺氧状态下，NMDA受体通道开放概率显著增加，其中以大电导类的35 pS和100 pS为主，而非小电导通道亚型，由于大电导NMDA受体通道对Ca2+有选择性通透，故可导致Ca2+内流增加，参与胞内Ca2+聚集[11～13]。本实验记录到的电导达258 pS的NMDA受体通道亚型，是由缺氧诱导的，因为在正常浴液情况下，没有记录到此亚型的通道开放。在缺氧的过程中，其开放的概率不高，往往和其它亚型在同一膜片上诱发开放，而且可以和其它电导水平之间相互转换，但更多的是直接由关闭状态转化开放。出现此大电导开放的可能原因有：一是封接的膜片上有2个或更多的通道开放叠加所致；另一是新的亚型通道，而前一种可能性较小，因为所用的电极尖端直径较小，而且在正常情况下，没有观察到此电导水平的开放，因此，作者认为，这是由缺氧诱导的NMDA受体通道亚型开放，这种亚型通道的开放可能是加速胞内Ca2+增高的因素之一。由于在缺氧状态下胞内Ca2+聚集是导致细胞损伤的启动因素之一，因此，大电导NMDA受体通道的开放在缺氧细胞病理损伤中可能起有重要作用。但这还需要更多的实验来进一步证实。
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*重庆市中青年科技专家基金资助项目
**王中峰，男，34岁，讲师，博士，现为中国科学院上海生理研究所博士后 上海，200031
作者单位：王中峰黎海蒂 万子兵 罗全生 第三军医大学基础医学部生理学教研室 重庆，400038
参考文献
1 Choi D W, Rothman S M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annu Rev Neurosci,1990,13:171
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3 Bliss TVP,Collingridge G L. A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus. Nature,1993,361(6407):31
4 Clements J D, Westbrook G L. Activation kinetics reveal the number of glutamate and glycine bingding sites on the N-methyl-D-aspartate receptor. Neuron,1991,7(4):605
5 Kohr G, Koninck Y D, Mody I. Properties of NMDA receptor channels in neurons acutely isolated from epileptic(kindled) rats. J Neurosci,1993,13(8):3612
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6 高天明，邹 飞，陈培熹.大脑皮层神经元NMDA受体的单通道特性.生理学报，1995，47(2)：133
7 Jahr C E, Stevens C F. Glutamate activates multiple single channel conductances in hippocampal neurons.Nature,1987,325(5):522
8 唐向东，佟振清，杨文俊.一种改进的适用膜片箝记录的急性神经元分离方法.生理学通报，1994，11(1)：60
9 Harata N, Wu J, Ishibashi H, et al. Run-down of the GABAA response under experimental ischemia in acutely dissociated CA1 pyramidal neurones of the rat. J Physiol,1997,500:673
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10 Hamill O P, Marty A, Neher E, et al. Improved patch-clamp technique for high-resolution current recording from cell and cell-free membrane patches. Pflugers Arch,1981,391(1):85
11 Salinska E, Pluta R, Puka M, et al. Blockade of N-methyl-D-aspartate-sensitive excitatory amino acid receptors with 2-amino-5-phosphovalerate reduces ischemia-evoked calcium redistribution in rabbit hippocampus. Exp Neurol,1991,112(1):89
12 Xia Y X, Zacharias E, Hoff P, et al. Ion channel involvement in anoxic depolarization induced by cardiac arrest in rat brain. J Cereb Blood Fluid Metab,1995,15(4):587
13 Mitani A, Yanase H, Sakai K, et al. Origin of intracellular Ca2+ elevation induced by in vitro ischemia-like condition in hippocampal slices. Brain Res,1993,601(1):103, 百拇医药(王中峰黎海蒂 万子兵 罗全生)