反相HPLC法测定六味安消胶囊及大黄药材中大黄素的含量
作者：杨延奎 周云喜 吴开波
单位：贵州省黔南自治州药品检验所 都匀 558000
关键词：大黄素；反相HPLC；六味安消胶囊；大黄药材
中国现代应用药学000620 摘要 目的：用反相HPLC法测定六味安消胶囊及大黄药材中大黄素的含量。方法：采用CLC-ODS C18色谱柱(5μm,4.6×150mm),流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液(85∶15),检测波长:438nm,流速:1.2ml/min,柱温25℃。结果：大黄素的平均回收率为98.56%(RSD=2.61%,n=12),线性范围为0.0798～0.638μg(r=0.9999)。结论：本法快速，准确，灵敏，简便易行。
Determination of emodin in Liuwei Anxiao capsules and radix rhei by RP-HPLC
, http://www.100md.com
Yang Yankui(Yang YK),Zhou Yunxi(Zhou YX),Wu Kaibo(Wu KB)
(Xinbang Pharmaceutical Company LTD.,Guiyang,Guizhou Province 558000)
ABSTRACT OBJECTIVE：To develop a RP-HPLC method for the determination of emodin in Liuwei Anxiao capsules and rhubarb radix.METHOD:Chromatographic conditions were:CLC-ODS C18(5μm,4.6×150mm),methanol-0.4% phosphoric acid(85∶15) as the mobile phase with flowe rate of 1.2ml/min.The column temperature was at 25℃ and the detection wavelength was set at 438nm.RESULTS:The average recovery were 98.56%(n=12,RSD=2.61%).The stadard curve was linear in the concentration range of 0.0798～0.638μg(r=0.9999).CONCLUSION:The proposed method is simple,rapid,accurate and reliable.
, 百拇医药
KEY WORDS emodin,RP-HPLC,Liuwei Anxiao capsules,rhubarb radix
原六味安消散由土木香、大黄、山柰、诃子、寒水石、碱花等六味中药组成，具有消积导滞、和胃健脾之功效。在蒙古、藏族地区广为流传。由于其疗效确切，组方奇特而被收载入《中国药典》85版、90版、95版。1995年由散剂改为胶囊剂后，为信邦公司独家生产。其部颁标准(试行)中，大黄素含量采用薄层扫描法测定。原方法提取时，多次回流，萃取转移，不易掌握，由于影响薄层扫描结果的因素众多[1],结果不甚准确。本文改用高效液相法测定，采取水解后直接进样的方法，为药厂提供一种快速、灵敏、操作简便的大黄素含量测定方法，结果令人满意。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪:LC-10AT高压泵,SPD-10AT紫外检测器,CLC-ODS C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)，C-R6A色谱处理机，均为日本岛津公司产品。
, http://www.100md.com
大黄素对照品(供含量测定用，中国药品生物制品检定所)；六味安消胶囊、大黄药材(经鉴别符合中国药典95版规定)均为信邦公司质检部提供。甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，超纯水。
2 色谱条件
ODS C18反相柱(5μm,4.6×150mm);流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液(85∶15);检测波长:438nm;流速:1.2ml/min,柱温25℃检测灵敏度:0.01AUFS;进样量10μl;纸速:3mm/min。
3 实验方法
3.1 空白对照试验 取药厂制备不含大黄药材的六味安消原药粉，按样品溶液制备项下制备空白对照溶液，按照样品测定项下方法测定，可见对照品峰与空白对照溶液峰没有重叠。见图1。
图1 色谱图
, 百拇医药
A-空白；B-对照品；C-样品；D-大黄药材；E-加样回收；1-大黄素
3.2 线性关系考察 准确配制每1ml含大黄素为31.9μg的甲醇溶液。精密吸取2.5,5.0,7.5,10,15和20μl,依次进样，按样品测定项下测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为:Y=1.059×106X+6.608×103,r=0.9999。线性范围(μg) 7.975×10-2μg～6.38×10-1μg。
3.3 样品精密度试验 精密吸取同一批号样品溶液，重复进样6次，每次10μl,结果：供试品中，大黄素峰面积积分值的RSD为0.14%(n=6)。
3.4 重现性试验 同一批号样品，分别取样6份，照样品测定项下方法操作，测得平均含量为0.8868mg/g,RSD=0.13%(n=6)。
, http://www.100md.com
3.5 稳定性试验 取同一批号样品溶液3份，分别在0,12,24,36和48h,按样品测定项下方法测定，取每次含量平均值计算，结果：5次测定含量值的RSD为0.7%。可见样品溶液在48h内较稳定。
3.6 回收率试验 取已知含量的4个批号样品，每批取样3份，每份约1g,精密称定，分别加入大黄素对照品溶液10,15和20ml(0.0319～0.1033mg/ml),加甲醇适量。照“样品测定”项下方法测定，结果见表1。
表1 回收率试验结果 批号
对照品加
入量/mg
实际测得
量/mg
回收率
, http://www.100md.com
/%
平均回收
率/%
RSD
/%
970305
0.3190
0.3286
103.01
0.4785
0.4755
99.37
0.6380
, 百拇医药
0.6447
101.05
971121
0.6030
0.6065
100.58
0.9045
0.9148
101.14
1.2060
1.1620
96.35
, http://www.100md.com 98.56
2.61
980113
0.8420
0.8342
99.07
1.2630
1.2228
96.82
1.6840
1.6448
97.67
980318
, 百拇医药
1.0330
1.0034
97.13
1.5495
1.4950
96.48
2.0660
1.9439
94.09
4 样品测定
4.1 对照品溶液的制备 取减压干燥至恒重的大黄素对照品(含量测定用)约10mg，精密称定，置250ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
, http://www.100md.com
4.2 胶囊样品溶液的制备 取本品20粒的内容物，精密称定，混合均匀，精密称取适量(约2g),置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml,称定重量(准确到0.01g)，超声提取2h,放冷，称定重量，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液。精密量取续滤液10ml,置100ml烧瓶中，加入2.5mol/L的硫酸溶液5ml,置水浴中加热回流3h,放冷，移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45μm滤膜滤过，即得。
4.3 大黄药材样品溶液的制备 取大黄药材粉末(过三号筛)约0.4g,精密称定，置具塞锥形瓶中，以下按胶囊样品溶液的制备方法操作，即得。
4.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与样品溶液和大黄药材溶液各10μl,注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积(见图，色谱图)，以外标法计算，即得。并与薄层扫描法结果比较，结果见表2，3。
表2 六味安消大黄素含量测定结果/n=3 批号
, 百拇医药
薄层扫描法
/mg.g-1
高效液相法
/mg.g-1
批号
薄层扫描法
/mg.g-1
高效液相法
/mg.g-1
961023
, 百拇医药 0.52
0.67
971211
0.62
0.90
961209
0.49
0.61
980120
0.86
1.15
970305
0.42
, 百拇医药
0.73
980224
0.95
1.25
970602
0.59
0.80
980302
0.69
0.97
971018
0.46
0.68
, 百拇医药
980318
0.97
1.24
971121
0.70
0.91
980408
0.92
1.34
表3 大黄药材大黄素含量结果/n=3 大黄药材/批次
1
2
, 百拇医药 3
4
5
6
大黄素含量/mg.g-1
7.12
4.68
3.29
6.70
4.31
5.75
5 讨 论
5.1 方法中，水解大黄素苷，改盐酸为硫酸，以免仪器受损[2],实验证明，用2.0mol/L的硫酸溶液水解2h,大黄素苷基本水解完全，为保证水解完全，采用加2.5mol/L硫酸水解3h。
, 百拇医药
5.2 在大黄素(以流动相为溶剂)的吸收度波长扫描中，有五个最大吸收峰437.4,288.4,265.8,252.6和222.0nm,由于中药成分复杂，前四个峰干扰较大，故选择438nm为吸收波长。结果：分离度大，且基线平直，在方法规定的条件下，线性良好，供试品的精密度、回收率、稳定性与重现性也较好。故本法用于六味安消胶囊的质量控制，切实可行。
5.3 由于本品处方中，所有药材经直接粉碎过筛而得，大黄未经提取，实验证明，超声提取1个半小时以上，大黄素测得量不再增加，为保证提取完全，采用超声提取2h。
5.4 具报道，样品提取时，因多次回流，萃取转移，在蒸发、干燥过程中，大黄素含量会逐步降低[3]。由此，笔者还作了如下实验，依照原标准和本文中的前处理方法作同一批号样品，并上机用本法测定大黄素含量，结果平均含量分别为0.64和0.84mg/g(n=3)。可见由于本法简便易行，避免了萃取转移，蒸发，干燥过程中大黄素的损失，故测定结果较高。
参考文献
1，中国药典.一部.1995∶附录ⅥB 36.
2，赵陆华主编.高效液相色谱法分析中药成分手册.北京：中国医药科技出版社，1992∶44.
3，苏子仁，周华，刘中秋，等.大黄在提取精制工艺中的化学成分变化研究(Ⅰ) 大黄素的湿热降解机理探讨.药物分析杂志，1998，18(2)∶83.
收稿日期：1999-06-23, http://www.100md.com
单位：贵州省黔南自治州药品检验所 都匀 558000
关键词：大黄素；反相HPLC；六味安消胶囊；大黄药材
中国现代应用药学000620 摘要 目的：用反相HPLC法测定六味安消胶囊及大黄药材中大黄素的含量。方法：采用CLC-ODS C18色谱柱(5μm,4.6×150mm),流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液(85∶15),检测波长:438nm,流速:1.2ml/min,柱温25℃。结果：大黄素的平均回收率为98.56%(RSD=2.61%,n=12),线性范围为0.0798～0.638μg(r=0.9999)。结论：本法快速，准确，灵敏，简便易行。
Determination of emodin in Liuwei Anxiao capsules and radix rhei by RP-HPLC
, http://www.100md.com
Yang Yankui(Yang YK),Zhou Yunxi(Zhou YX),Wu Kaibo(Wu KB)
(Xinbang Pharmaceutical Company LTD.,Guiyang,Guizhou Province 558000)
ABSTRACT OBJECTIVE：To develop a RP-HPLC method for the determination of emodin in Liuwei Anxiao capsules and rhubarb radix.METHOD:Chromatographic conditions were:CLC-ODS C18(5μm,4.6×150mm),methanol-0.4% phosphoric acid(85∶15) as the mobile phase with flowe rate of 1.2ml/min.The column temperature was at 25℃ and the detection wavelength was set at 438nm.RESULTS:The average recovery were 98.56%(n=12,RSD=2.61%).The stadard curve was linear in the concentration range of 0.0798～0.638μg(r=0.9999).CONCLUSION:The proposed method is simple,rapid,accurate and reliable.
, 百拇医药
KEY WORDS emodin,RP-HPLC,Liuwei Anxiao capsules,rhubarb radix
原六味安消散由土木香、大黄、山柰、诃子、寒水石、碱花等六味中药组成，具有消积导滞、和胃健脾之功效。在蒙古、藏族地区广为流传。由于其疗效确切，组方奇特而被收载入《中国药典》85版、90版、95版。1995年由散剂改为胶囊剂后，为信邦公司独家生产。其部颁标准(试行)中，大黄素含量采用薄层扫描法测定。原方法提取时，多次回流，萃取转移，不易掌握，由于影响薄层扫描结果的因素众多[1],结果不甚准确。本文改用高效液相法测定，采取水解后直接进样的方法，为药厂提供一种快速、灵敏、操作简便的大黄素含量测定方法，结果令人满意。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪:LC-10AT高压泵,SPD-10AT紫外检测器,CLC-ODS C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)，C-R6A色谱处理机，均为日本岛津公司产品。
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大黄素对照品(供含量测定用，中国药品生物制品检定所)；六味安消胶囊、大黄药材(经鉴别符合中国药典95版规定)均为信邦公司质检部提供。甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，超纯水。
2 色谱条件
ODS C18反相柱(5μm,4.6×150mm);流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液(85∶15);检测波长:438nm;流速:1.2ml/min,柱温25℃检测灵敏度:0.01AUFS;进样量10μl;纸速:3mm/min。
3 实验方法
3.1 空白对照试验 取药厂制备不含大黄药材的六味安消原药粉，按样品溶液制备项下制备空白对照溶液，按照样品测定项下方法测定，可见对照品峰与空白对照溶液峰没有重叠。见图1。
图1 色谱图
, 百拇医药
A-空白；B-对照品；C-样品；D-大黄药材；E-加样回收；1-大黄素
3.2 线性关系考察 准确配制每1ml含大黄素为31.9μg的甲醇溶液。精密吸取2.5,5.0,7.5,10,15和20μl,依次进样，按样品测定项下测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为:Y=1.059×106X+6.608×103,r=0.9999。线性范围(μg) 7.975×10-2μg～6.38×10-1μg。
3.3 样品精密度试验 精密吸取同一批号样品溶液，重复进样6次，每次10μl,结果：供试品中，大黄素峰面积积分值的RSD为0.14%(n=6)。
3.4 重现性试验 同一批号样品，分别取样6份，照样品测定项下方法操作，测得平均含量为0.8868mg/g,RSD=0.13%(n=6)。
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3.5 稳定性试验 取同一批号样品溶液3份，分别在0,12,24,36和48h,按样品测定项下方法测定，取每次含量平均值计算，结果：5次测定含量值的RSD为0.7%。可见样品溶液在48h内较稳定。
3.6 回收率试验 取已知含量的4个批号样品，每批取样3份，每份约1g,精密称定，分别加入大黄素对照品溶液10,15和20ml(0.0319～0.1033mg/ml),加甲醇适量。照“样品测定”项下方法测定，结果见表1。
表1 回收率试验结果 批号
对照品加
入量/mg
实际测得
量/mg
回收率
, http://www.100md.com
/%
平均回收
率/%
RSD
/%
970305
0.3190
0.3286
103.01
0.4785
0.4755
99.37
0.6380
, 百拇医药
0.6447
101.05
971121
0.6030
0.6065
100.58
0.9045
0.9148
101.14
1.2060
1.1620
96.35
, http://www.100md.com 98.56
2.61
980113
0.8420
0.8342
99.07
1.2630
1.2228
96.82
1.6840
1.6448
97.67
980318
, 百拇医药
1.0330
1.0034
97.13
1.5495
1.4950
96.48
2.0660
1.9439
94.09
4 样品测定
4.1 对照品溶液的制备 取减压干燥至恒重的大黄素对照品(含量测定用)约10mg，精密称定，置250ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
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4.2 胶囊样品溶液的制备 取本品20粒的内容物，精密称定，混合均匀，精密称取适量(约2g),置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml,称定重量(准确到0.01g)，超声提取2h,放冷，称定重量，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液。精密量取续滤液10ml,置100ml烧瓶中，加入2.5mol/L的硫酸溶液5ml,置水浴中加热回流3h,放冷，移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45μm滤膜滤过，即得。
4.3 大黄药材样品溶液的制备 取大黄药材粉末(过三号筛)约0.4g,精密称定，置具塞锥形瓶中，以下按胶囊样品溶液的制备方法操作，即得。
4.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与样品溶液和大黄药材溶液各10μl,注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积(见图，色谱图)，以外标法计算，即得。并与薄层扫描法结果比较，结果见表2，3。
表2 六味安消大黄素含量测定结果/n=3 批号
, 百拇医药
薄层扫描法
/mg.g-1
高效液相法
/mg.g-1
批号
薄层扫描法
/mg.g-1
高效液相法
/mg.g-1
961023
, 百拇医药 0.52
0.67
971211
0.62
0.90
961209
0.49
0.61
980120
0.86
1.15
970305
0.42
, 百拇医药
0.73
980224
0.95
1.25
970602
0.59
0.80
980302
0.69
0.97
971018
0.46
0.68
, 百拇医药
980318
0.97
1.24
971121
0.70
0.91
980408
0.92
1.34
表3 大黄药材大黄素含量结果/n=3 大黄药材/批次
1
2
, 百拇医药 3
4
5
6
大黄素含量/mg.g-1
7.12
4.68
3.29
6.70
4.31
5.75
5 讨 论
5.1 方法中，水解大黄素苷，改盐酸为硫酸，以免仪器受损[2],实验证明，用2.0mol/L的硫酸溶液水解2h,大黄素苷基本水解完全，为保证水解完全，采用加2.5mol/L硫酸水解3h。
, 百拇医药
5.2 在大黄素(以流动相为溶剂)的吸收度波长扫描中，有五个最大吸收峰437.4,288.4,265.8,252.6和222.0nm,由于中药成分复杂，前四个峰干扰较大，故选择438nm为吸收波长。结果：分离度大，且基线平直，在方法规定的条件下，线性良好，供试品的精密度、回收率、稳定性与重现性也较好。故本法用于六味安消胶囊的质量控制，切实可行。
5.3 由于本品处方中，所有药材经直接粉碎过筛而得，大黄未经提取，实验证明，超声提取1个半小时以上，大黄素测得量不再增加，为保证提取完全，采用超声提取2h。
5.4 具报道，样品提取时，因多次回流，萃取转移，在蒸发、干燥过程中，大黄素含量会逐步降低[3]。由此，笔者还作了如下实验，依照原标准和本文中的前处理方法作同一批号样品，并上机用本法测定大黄素含量，结果平均含量分别为0.64和0.84mg/g(n=3)。可见由于本法简便易行，避免了萃取转移，蒸发，干燥过程中大黄素的损失，故测定结果较高。
参考文献
1，中国药典.一部.1995∶附录ⅥB 36.
2，赵陆华主编.高效液相色谱法分析中药成分手册.北京：中国医药科技出版社，1992∶44.
3，苏子仁，周华，刘中秋，等.大黄在提取精制工艺中的化学成分变化研究(Ⅰ) 大黄素的湿热降解机理探讨.药物分析杂志，1998，18(2)∶83.
收稿日期：1999-06-23, http://www.100md.com