新西兰孕兔人轮状病毒Wa株宫内感染的初探
赵枫 谢孟坤 姚英民 何孔旺
摘 要：目的 观察孕兔人轮状病毒(HRV)血症是否会导致宫内感染。方法 在新西兰孕兔妊娠的不同阶段，经耳静脉注射人轮状病毒Wa株，造成孕兔的病毒血症(血浓度为5×107/L)，然后用RT/PCR技术，检测出生仔兔肠道组织内HRV抗原。结果 在孕兔妊娠的早、中、晚期，HRV都能通过血胎屏障进入宫内在仔兔肠道内定居。结论 提示仔兔存在RV宫内感染的可能性，这将为研究人类RV宫内感染提供依据。
关键词：新西兰孕兔 人轮状病毒 宫内感染
人轮状病毒(HRV)是婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体，近年来研究发现HRV可引起呼吸系统、中枢神经系统、肝胆系统等肠道外系统的感染[1～4]。更有意义的是，美国学者Sualsbury等[5]在部份免疫缺陷患者中发现了HRV血症，日本学者[6]在免疫功能正常的患者中也发现了HRV血症。为了进一步探索在发生HRV 病毒血症时，HRV是否也象风疹等病毒能通过血循环-血胎屏障-胎儿导致宫内感染，引起胎儿早产、死产、发育畸形。我们初步观察了新西兰孕兔HRV-Wa株病毒血症与宫内感染的关系及对胎儿的影响。
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1 材料与方法
1.1 毒株 HRV-Wa株MA104细胞培养液上清，毒价为1010/ L，由江苏省农科院畜牧兽医研究所提供。
1.2 实验动物 新西兰品系怀孕母兔8只，体质量(4 .5±0.25)kg，HRV特异性抗原检测为阴性。
1.3 主要试剂 引物取自A组轮状病毒第9基因片段VP7两个高度保守序列，由上海生物细胞研究所合成；逆转录试剂盒，裂解缓冲液成份均为Promega公司产品，PCR试剂为复旦大学产品。
1.4 实验方法
1.4.1 将体质量为(4.5±0.25) kg的新西兰品系怀孕母兔8只随机分为A、B、C、D四组，每组2只，A、B、C三组为实验组，D组为对照组。
, 百拇医药
1.4.2 在A组怀孕母兔的妊娠早期(妊娠10 d)，B组孕兔的妊娠中期(妊娠15 d)；C组孕兔的妊娠晚期(妊娠25 d)，分别从其耳静脉内注射HRV-Wa株细胞培养液上清2 ml (毒价1010 /L)；D组孕兔作为空白对照。
1.4.3 将上述孕兔分别置于饲养条件完全相同的环境下饲养，密切观察其妊娠期间的临床表现—腹泻、疾病发生及分娩情况。
1.4.4 待每只孕兔产下仔兔后，立即称重并随机取一半数量的仔兔，剖杀后取其小肠段，用生理盐水彻底冲洗干净肠腔，置-20 ℃保存。整个过程在无菌条件下操作，另一半数量的仔兔让其自然生长，饲养条件相同，观察其临床表现—腹泻、疾病发生及生长发育状况(出生后一月称体质量)
1.4.5 用RT-PCR方法检测仔兔小肠组织内HRV抗原 ⑴ HRV-RNA提取：取1 cm长的小肠组织标本，加入适量的1×TE缓冲液，充分均浆后4 000 r/min离心30 min，取上清15 000 r/min离心1.5 h，弃上清，沉淀加入裂体缓冲液30～50 μl，置55 ℃恒温水浴箱2～3 h，再95 ℃加热10 min后10 000 r/min离心10 min，取上清5 μl作逆转录模板。⑵ 逆转录：按试剂盒说明书操作，逆转录后的HRV CDNA置-20℃保存。⑶ PCR扩增：总反应体积为50 μl(10 mmol/L Tris-HCL pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，PrimerⅠⅡ各50 pmol，Taq DNA P 2 μmol/L)，先经95 ℃加热8 min，立即冰浴5 min使之变性的上述CDNA混合物5 μl)，混匀后以50 μl液体石腊油封顶，置PTC-51BDNA扩增仪上按93 ℃、45 s→55 ℃、45 s→72 ℃、90 s三温循环30周期。⑷ 琼脂糖电泳：上述PCR产物在微型电泳槽上以100 V/板进行1.5%琼脂糖电泳，然后在紫外透射仪上观察结果。⑸ 在RT-PCR过程中，设置阳性对照和阴性对照，反应条件均一致。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 ⑴χ2检验；⑵单因素方差分析。
2 结果
2.1 孕兔感染HRV Wa 株后临床表现 三个实验组的孕兔在妊娠的不同时期经耳静脉感染HRV Wa株后，均未出现腹泻症状，大便形状、性质与对照组相同，生长无异常，妊娠期间未发生任何疾病，按时分娩，分娩过程顺利。
2.2 实验组和对照组剖杀的仔免小肠组织HRV检测 ⑴ RT-PCR结果：空白对照组(D组)，仔兔小肠组织HRV均为阴性，说明正常情况下新西兰孕免不存在HRV宫内感染；D组与其它三组HRV宫内感染率有显著差异(χ2=12.21，P <0.01)，A、B、C三组间宫内感染率无显著差异(P >0.5，表1)。
表1 RT-PCR检测剖杀仔兔小肠组织HRV的结果
, 百拇医药
Tab.1 HRV in the t intestinal tissue of the newborn rabbits by RT-PCR
Group
n
No. of HRV detected
%
A
8
6
75
B
7
5
, http://www.100md.com
71
C
9
6
67
D
8
0
0
2.3 四组存活仔兔临床表现 四组孕兔产下的仔兔均为活胎，外观无畸形，出生时体质量无显著差异(表2)。存活仔兔在出生一月内均未出现腹泻症状，大便形状，性质和对照组相同，生长发育无异常，未发生任何疾病。方差分析结果表明：四组存活仔兔满月时体质量无显著差异(F=0.0719，P >0.9)(表2)。 表2 仔兔出生时和满月时体质量的比较(X±s)
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Tab.2 Comparison of body weight in the newborn rabbits at birth and one month
Group
At birth*
After one month**
n
Body weight(g)
n
Body weight(g)
A
15
, 百拇医药 48.9937±2.7030
8
498.8125±36.1685
B
14
49.5857±3.5399
7
504.3571±39.5136
C
18
50.0778±3.3070
9
, 百拇医药
501.9444±39.3857
D
15
49.9750±3.6205
8
499.2500±33.6363
* F 0.3633,P>0.9 ** F 0.0719, P>0.9
3 讨论
近年来的研究证明，孕妇血清HRV抗体水平，不仅几何平均滴度明显低于下健康成人组，而且孕妇抗体检测结果揭示，有9.87%的缺乏HRV抗体[7]，这种情况也见于孕妇巨细胞病毒及风疹病毒抗体水平，提示孕期妇女同样易遭受HRV感染。我们选择状病毒特异性抗体的新西兰孕兔作动物模型， 模拟HRV抗体缺乏的孕妇。在预实验的基础上，选择合适的血浓度在孕兔妊娠的不同阶段，经其耳静脉注射HRV Wa株，造成孕兔的病毒血症(血浓度为5×107/L)，观察孕兔存在HRV病毒血症时，HRV是否能通过血胎屏障进入胎盘组织，是否进入仔兔体内，导致仔兔宫内感染。结果表明：在孕兔妊娠的早、中、晚期，HRV 都能通过血胎屏障进入仔兔体内，在仔兔小肠组织内定居，提示仔兔有HRV宫内感染的可能性，而且在孕兔妊娠早、中、晚期，仔兔HRV宫内感染率无显著差异。实验组孕兔存在HRV血症后，其临床表现与对照组孕兔相比，无何区别，说明HRV Wa株在新西兰孕兔中可能只导致隐性感染。
, 百拇医药
实验组孕兔发生HRV血症后，HRV能否最终导致仔兔宫内感染，取决于三个方面：(1)孕兔的免疫功能与病毒的数量和毒力：正常情况下，感染病毒后，机体产生抗病毒的体液免疫和细胞免疫，两者的共同作用可以起到消除病毒，限制病毒血症及阻止病毒侵犯组织的作用。一般情况下，妊娠期间机体免疫功能处于抑制状态，甚至部分HRV特异性抗体缺乏。当机体的体液免疫及细胞免疫应答低下，存在一定数量及毒力的病毒时，孕兔的免疫功能就不足以阻止病毒侵犯靶组织，这就为HRV进一步导致宫内感染提供了可能。(2) HRV能否通过血胎屏障进入胎盘：这与HRV Wa株颗粒的大小、妊娠不同阶段血胎屏障通透性大小等因素有关。已知HRV直径为60～70 nm，其大小与可造成宫内感染的风疹病毒和乙肝病毒相近似。本研究证明，在孕兔早、中、晚期血胎屏障不能阻止HRV进入胎盘。HRV病毒血症是否造成轮状病毒性胎盘炎，使之通透性增加，尚待进一步证实。(3) 胎盘感染病毒后是否侵袭胎儿：胎盘有自身的免疫防御调节机制，这种机制尚不十分确切，可能与胎盘细胞产生干扰素等因素有关。如果胎盘自身免疫防御调节功能足够强，进入胎盘内的HRV数量少，毒力弱，那么就能对HRV起到抑制作用，使仔兔免受HRV感染；反之，则导致仔兔感染HRV。本实验表明，在HRV Wa株血浓度达5×107/L时，胎盘组织的免疫防御功能不足以使仔兔免受HRV感染。妊娠期间，仔兔细胞分裂增殖活跃，各器官发育不完善，防御机制不成熟，给病毒提供了生存环境。毒力强的病毒对仔兔细胞产生毒性作用，造成仔兔宫内营养障碍、畸形、死胎或流产；反之，病毒对细胞毒性作用轻，则仔兔仍可存活，表现为隐性感染；有些病毒引起宫内感染后，引起子代体液免疫和细胞免疫功能的下降，而继发其它感染。本实验中实验组孕兔产下的仔兔均为活胎，无畸形，体质量与对照组相比，无显著性差异，出生后一月内无疾病发生，临床表现与对照组仔兔无任何区别，提示仔兔宫内感染HRV Wa株为隐性感染，对生后生长发育无显著影响。
, 百拇医药
我们的前期工作，证实人类新生儿脐血中这HRV特异性IgM检出率为1.5%，新生儿生后第一天大便中RV抗原检出率为4.5%，提示人类存在HRV宫内感染的可能性。孕兔宫内感染的初步研究证实，HRV可经血胎屏障进入胎儿体内，且不能被胎儿的免疫系统所清除，这为深入研究人类RV宫内感染存在的可能性提供了依据。
*国家自然科学基金资助(9270694)
作者简介：赵枫，女，1966年出生，硕士，主治医师
作者单位：赵枫 谢孟坤 姚英民：第一军医大学南方医院儿科，广州，510515
何孔旺：江苏农科院畜牧兽医研究所，南京，210004
参考文献
1 Novikova NA, Altova EE, Noskova NN et al. The detection of rotavirus RNA in nasopharyngeal smears by molecular hybridization. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 1991,4:23
, http://www.100md.com
2 Ushijima H, Honma H, Mukoyama A. Rotavirus encephalitis in Japan, Brain Dev,1990,12:628
3 Kaidam I, Shif L, Keren G. Rotavirus encephalopathy evidence of central nervous system involvement during rotavirus infection. Pediatr Infect Dis, 1992,11:773
4 Gilger MA, Matson DO, Conner ME. Extraintestinal rotavirus infections in children with immunodeficiency. J Pediatric,1992,120(6):912
5 Saulsbury FT, Winkelstein JA, Yolken RH. Chronic rotavirus infection in immunodeficiency. J Pediatr,1992,97:61
6 Ushijima H, Xin KQ, Nishimura S. Detection and sequencing of rotavirus VP gene from human materials(stools, sera, cerebrospinal fluids and throat swabs) by reverse transcription and PCR. J Clin Microbiol, 1994, 32(12):2893
7 谢孟坤,宋静澄,林全胜等，母婴配对血清的人轮状病毒抗体研究.中华流行病学杂志,1986,7(3)：142, 百拇医药
摘 要：目的 观察孕兔人轮状病毒(HRV)血症是否会导致宫内感染。方法 在新西兰孕兔妊娠的不同阶段，经耳静脉注射人轮状病毒Wa株，造成孕兔的病毒血症(血浓度为5×107/L)，然后用RT/PCR技术，检测出生仔兔肠道组织内HRV抗原。结果 在孕兔妊娠的早、中、晚期，HRV都能通过血胎屏障进入宫内在仔兔肠道内定居。结论 提示仔兔存在RV宫内感染的可能性，这将为研究人类RV宫内感染提供依据。
关键词：新西兰孕兔 人轮状病毒 宫内感染
人轮状病毒(HRV)是婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体，近年来研究发现HRV可引起呼吸系统、中枢神经系统、肝胆系统等肠道外系统的感染[1～4]。更有意义的是，美国学者Sualsbury等[5]在部份免疫缺陷患者中发现了HRV血症，日本学者[6]在免疫功能正常的患者中也发现了HRV血症。为了进一步探索在发生HRV 病毒血症时，HRV是否也象风疹等病毒能通过血循环-血胎屏障-胎儿导致宫内感染，引起胎儿早产、死产、发育畸形。我们初步观察了新西兰孕兔HRV-Wa株病毒血症与宫内感染的关系及对胎儿的影响。
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1 材料与方法
1.1 毒株 HRV-Wa株MA104细胞培养液上清，毒价为1010/ L，由江苏省农科院畜牧兽医研究所提供。
1.2 实验动物 新西兰品系怀孕母兔8只，体质量(4 .5±0.25)kg，HRV特异性抗原检测为阴性。
1.3 主要试剂 引物取自A组轮状病毒第9基因片段VP7两个高度保守序列，由上海生物细胞研究所合成；逆转录试剂盒，裂解缓冲液成份均为Promega公司产品，PCR试剂为复旦大学产品。
1.4 实验方法
1.4.1 将体质量为(4.5±0.25) kg的新西兰品系怀孕母兔8只随机分为A、B、C、D四组，每组2只，A、B、C三组为实验组，D组为对照组。
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1.4.2 在A组怀孕母兔的妊娠早期(妊娠10 d)，B组孕兔的妊娠中期(妊娠15 d)；C组孕兔的妊娠晚期(妊娠25 d)，分别从其耳静脉内注射HRV-Wa株细胞培养液上清2 ml (毒价1010 /L)；D组孕兔作为空白对照。
1.4.3 将上述孕兔分别置于饲养条件完全相同的环境下饲养，密切观察其妊娠期间的临床表现—腹泻、疾病发生及分娩情况。
1.4.4 待每只孕兔产下仔兔后，立即称重并随机取一半数量的仔兔，剖杀后取其小肠段，用生理盐水彻底冲洗干净肠腔，置-20 ℃保存。整个过程在无菌条件下操作，另一半数量的仔兔让其自然生长，饲养条件相同，观察其临床表现—腹泻、疾病发生及生长发育状况(出生后一月称体质量)
1.4.5 用RT-PCR方法检测仔兔小肠组织内HRV抗原 ⑴ HRV-RNA提取：取1 cm长的小肠组织标本，加入适量的1×TE缓冲液，充分均浆后4 000 r/min离心30 min，取上清15 000 r/min离心1.5 h，弃上清，沉淀加入裂体缓冲液30～50 μl，置55 ℃恒温水浴箱2～3 h，再95 ℃加热10 min后10 000 r/min离心10 min，取上清5 μl作逆转录模板。⑵ 逆转录：按试剂盒说明书操作，逆转录后的HRV CDNA置-20℃保存。⑶ PCR扩增：总反应体积为50 μl(10 mmol/L Tris-HCL pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，PrimerⅠⅡ各50 pmol，Taq DNA P 2 μmol/L)，先经95 ℃加热8 min，立即冰浴5 min使之变性的上述CDNA混合物5 μl)，混匀后以50 μl液体石腊油封顶，置PTC-51BDNA扩增仪上按93 ℃、45 s→55 ℃、45 s→72 ℃、90 s三温循环30周期。⑷ 琼脂糖电泳：上述PCR产物在微型电泳槽上以100 V/板进行1.5%琼脂糖电泳，然后在紫外透射仪上观察结果。⑸ 在RT-PCR过程中，设置阳性对照和阴性对照，反应条件均一致。
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1.6 统计学处理 ⑴χ2检验；⑵单因素方差分析。
2 结果
2.1 孕兔感染HRV Wa 株后临床表现 三个实验组的孕兔在妊娠的不同时期经耳静脉感染HRV Wa株后，均未出现腹泻症状，大便形状、性质与对照组相同，生长无异常，妊娠期间未发生任何疾病，按时分娩，分娩过程顺利。
2.2 实验组和对照组剖杀的仔免小肠组织HRV检测 ⑴ RT-PCR结果：空白对照组(D组)，仔兔小肠组织HRV均为阴性，说明正常情况下新西兰孕免不存在HRV宫内感染；D组与其它三组HRV宫内感染率有显著差异(χ2=12.21，P <0.01)，A、B、C三组间宫内感染率无显著差异(P >0.5，表1)。
表1 RT-PCR检测剖杀仔兔小肠组织HRV的结果
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Tab.1 HRV in the t intestinal tissue of the newborn rabbits by RT-PCR
Group
n
No. of HRV detected
%
A
8
6
75
B
7
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71
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2.3 四组存活仔兔临床表现 四组孕兔产下的仔兔均为活胎，外观无畸形，出生时体质量无显著差异(表2)。存活仔兔在出生一月内均未出现腹泻症状，大便形状，性质和对照组相同，生长发育无异常，未发生任何疾病。方差分析结果表明：四组存活仔兔满月时体质量无显著差异(F=0.0719，P >0.9)(表2)。 表2 仔兔出生时和满月时体质量的比较(X±s)
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Tab.2 Comparison of body weight in the newborn rabbits at birth and one month
Group
At birth*
After one month**
n
Body weight(g)
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Body weight(g)
A
15
, 百拇医药 48.9937±2.7030
8
498.8125±36.1685
B
14
49.5857±3.5399
7
504.3571±39.5136
C
18
50.0778±3.3070
9
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501.9444±39.3857
D
15
49.9750±3.6205
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499.2500±33.6363
* F 0.3633,P>0.9 ** F 0.0719, P>0.9
3 讨论
近年来的研究证明，孕妇血清HRV抗体水平，不仅几何平均滴度明显低于下健康成人组，而且孕妇抗体检测结果揭示，有9.87%的缺乏HRV抗体[7]，这种情况也见于孕妇巨细胞病毒及风疹病毒抗体水平，提示孕期妇女同样易遭受HRV感染。我们选择状病毒特异性抗体的新西兰孕兔作动物模型， 模拟HRV抗体缺乏的孕妇。在预实验的基础上，选择合适的血浓度在孕兔妊娠的不同阶段，经其耳静脉注射HRV Wa株，造成孕兔的病毒血症(血浓度为5×107/L)，观察孕兔存在HRV病毒血症时，HRV是否能通过血胎屏障进入胎盘组织，是否进入仔兔体内，导致仔兔宫内感染。结果表明：在孕兔妊娠的早、中、晚期，HRV 都能通过血胎屏障进入仔兔体内，在仔兔小肠组织内定居，提示仔兔有HRV宫内感染的可能性，而且在孕兔妊娠早、中、晚期，仔兔HRV宫内感染率无显著差异。实验组孕兔存在HRV血症后，其临床表现与对照组孕兔相比，无何区别，说明HRV Wa株在新西兰孕兔中可能只导致隐性感染。
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实验组孕兔发生HRV血症后，HRV能否最终导致仔兔宫内感染，取决于三个方面：(1)孕兔的免疫功能与病毒的数量和毒力：正常情况下，感染病毒后，机体产生抗病毒的体液免疫和细胞免疫，两者的共同作用可以起到消除病毒，限制病毒血症及阻止病毒侵犯组织的作用。一般情况下，妊娠期间机体免疫功能处于抑制状态，甚至部分HRV特异性抗体缺乏。当机体的体液免疫及细胞免疫应答低下，存在一定数量及毒力的病毒时，孕兔的免疫功能就不足以阻止病毒侵犯靶组织，这就为HRV进一步导致宫内感染提供了可能。(2) HRV能否通过血胎屏障进入胎盘：这与HRV Wa株颗粒的大小、妊娠不同阶段血胎屏障通透性大小等因素有关。已知HRV直径为60～70 nm，其大小与可造成宫内感染的风疹病毒和乙肝病毒相近似。本研究证明，在孕兔早、中、晚期血胎屏障不能阻止HRV进入胎盘。HRV病毒血症是否造成轮状病毒性胎盘炎，使之通透性增加，尚待进一步证实。(3) 胎盘感染病毒后是否侵袭胎儿：胎盘有自身的免疫防御调节机制，这种机制尚不十分确切，可能与胎盘细胞产生干扰素等因素有关。如果胎盘自身免疫防御调节功能足够强，进入胎盘内的HRV数量少，毒力弱，那么就能对HRV起到抑制作用，使仔兔免受HRV感染；反之，则导致仔兔感染HRV。本实验表明，在HRV Wa株血浓度达5×107/L时，胎盘组织的免疫防御功能不足以使仔兔免受HRV感染。妊娠期间，仔兔细胞分裂增殖活跃，各器官发育不完善，防御机制不成熟，给病毒提供了生存环境。毒力强的病毒对仔兔细胞产生毒性作用，造成仔兔宫内营养障碍、畸形、死胎或流产；反之，病毒对细胞毒性作用轻，则仔兔仍可存活，表现为隐性感染；有些病毒引起宫内感染后，引起子代体液免疫和细胞免疫功能的下降，而继发其它感染。本实验中实验组孕兔产下的仔兔均为活胎，无畸形，体质量与对照组相比，无显著性差异，出生后一月内无疾病发生，临床表现与对照组仔兔无任何区别，提示仔兔宫内感染HRV Wa株为隐性感染，对生后生长发育无显著影响。
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我们的前期工作，证实人类新生儿脐血中这HRV特异性IgM检出率为1.5%，新生儿生后第一天大便中RV抗原检出率为4.5%，提示人类存在HRV宫内感染的可能性。孕兔宫内感染的初步研究证实，HRV可经血胎屏障进入胎儿体内，且不能被胎儿的免疫系统所清除，这为深入研究人类RV宫内感染存在的可能性提供了依据。
*国家自然科学基金资助(9270694)
作者简介：赵枫，女，1966年出生，硕士，主治医师
作者单位：赵枫 谢孟坤 姚英民：第一军医大学南方医院儿科，广州，510515
何孔旺：江苏农科院畜牧兽医研究所，南京，210004
参考文献
1 Novikova NA, Altova EE, Noskova NN et al. The detection of rotavirus RNA in nasopharyngeal smears by molecular hybridization. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 1991,4:23
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2 Ushijima H, Honma H, Mukoyama A. Rotavirus encephalitis in Japan, Brain Dev,1990,12:628
3 Kaidam I, Shif L, Keren G. Rotavirus encephalopathy evidence of central nervous system involvement during rotavirus infection. Pediatr Infect Dis, 1992,11:773
4 Gilger MA, Matson DO, Conner ME. Extraintestinal rotavirus infections in children with immunodeficiency. J Pediatric,1992,120(6):912
5 Saulsbury FT, Winkelstein JA, Yolken RH. Chronic rotavirus infection in immunodeficiency. J Pediatr,1992,97:61
6 Ushijima H, Xin KQ, Nishimura S. Detection and sequencing of rotavirus VP gene from human materials(stools, sera, cerebrospinal fluids and throat swabs) by reverse transcription and PCR. J Clin Microbiol, 1994, 32(12):2893
7 谢孟坤,宋静澄,林全胜等，母婴配对血清的人轮状病毒抗体研究.中华流行病学杂志,1986,7(3)：142, 百拇医药