双氯芬酸钠经皮电穿孔及电离子导入的研究
作者：陈文莉 高建青 包家立 梁文权 胡巧红
单位：包家立(浙江大学生物医学工程研究所 杭州 310031)；陈文莉(杭州新星制药厂 杭州 310015)；高建青 梁文权 胡巧红(浙江大学药学院)
关键词：双氯芬酸钠；经皮渗透；电穿孔；离子导入
中国现代应用药学000612 摘要 目的：考察离子导入和电穿孔对双氯芬酸钠经皮渗透的影 响。方法：采用双室扩散池和SD大鼠皮，进行双氯芬酸钠饱和水溶液经 皮被动扩散、离子导入(0.5mA/cm2)和电穿孔导入(130V,740ms或100ms,200个脉冲，方波 ，占空比1∶1)的研究。结果：电穿孔和离子导入均能显著促进双氯芬酸 钠的经皮渗透，其增渗倍数分别为25.1和7.5。延长脉冲时间将改善电穿孔的促渗效果，初 步研究表明本实验条件的电穿孔及离子导入未引起皮肤的损伤。结论： 电穿孔技术可用于促进小分子解离型药物的经皮渗透。
, 百拇医药
Study on transdermal electroporation and intophoresis of diclofenac sod ium in vitro
Chen Wenli(Chen WL),Gao Jianqing(Gao JQ),Bao Jiali (Bao JL),et al
(Hangzhou Xinxing Pharmaceutical Factory,Hangzhou 310015)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the influe nce of electroporation and iontophoresis on transdermal delivery of diclofenac s odium.METHOD:Valia-Chien two-chamber diffusion cells and SD rat sk in were employed.The experiments of passive diffusion,transdermal iontophoresis( 0.5mA/cm2) and electropbration(130V of voltage,740 ms or 100 ms of pulse time, 200 pulses,square weave,and on-off=1∶1) of diclofenac sodium saturated solutio n were carried out.RESULTS:Electroporation and iontophoresis could n otably promote the transdermal delivery of diclofenac sodium and the ERs were 25.1 and 7.5 respectively.The enhance effects was improved as the increasing o f pulse time.The primary investigation showed that electroporation and iontophor esis which under the conditions in this experiment might not create the damage f or skin.CONCLUSION:Electroporation can be used to enhance the transd ermal delivery of small molecule and charged drugs.
, 百拇医药
KEY WORDS diclofenac sodium,transdermal permeation,electroporation, iontophoresis
经皮离子导入技术是利用电场对药物与皮肤的作用而促进 药物尤其是离子型药物经皮渗透的方法[1]。电穿孔技术是将瞬间高压脉冲施加于 细胞或脂质双层膜，使之产生暂时性水性孔道，从而将药物导入细胞或膜内，该技术最先被 应用于DNA导入和酶导入等[2]。美国加州大学药学院、麻省理工学院和Cygnus公司 等将电穿孔技术应用于药物的经皮渗透，能显著促进一些药物尤其是多肽类药物通过皮肤的 转运，其促渗机制与普通的离子导入有较大的差异[3],但目前国内对电穿孔经皮给 药实验研究报道尚未出现，本文考察了双氯芬酸钠分别采用0.5mA/cm2电流强度的离子导 入和不同脉冲时间的高压电穿孔作用下的体外透皮速率，并与其被动扩散进行了比较。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药品与仪器
双氯芬酸钠(江苏卜 弋生化制药厂)；离子导入仪(自制);OX4-1型经皮给药电穿孔仪(浙江大学生物医学工程研 究所);DU-65分光光度计(Beckman公司Ag/Agcl电极(自制);Valia-Chien双室扩散池( 自制，有效扩散面积0.5cm2,按受室体积4ml);CS501型超级恒温水浴(重压试验设备厂);SD大 鼠(浙江大学实验动物中心)；其余试剂均为分析纯。
1.2 双氯芬酸钠标准曲线的制备
精密称取双氯芬酸钠100mg,用pH7.4磷 酸盐缓冲液溶解并稀释至1000ml,分别移取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0和6.0ml于50ml量瓶中 ，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，在λ276nm处测定吸收度，得标准曲线为:C(μg/ml)=32.4224A-0.6949,r=0.9993,n=3。
, 百拇医药
1.3 模型皮肤的制备
取重约200g的雄性SD大鼠，断颈处死，剪去腹部 皮肤毛，剪取皮肤，剥离皮下组织，在生理盐水中浸洗30min后使用。
1.4 双氯芬酸钠饱和水溶液经皮渗透实验
采用Valia-Chien双室扩散 池，以大鼠皮为模型皮肤，夹于两室之间，角质层面向供应室，真皮层面向接受室，供应室 中放置双氯芬酸钠的饱和水溶液，接受室中放置pH7.4磷酸盐缓冲液，分别进行药物被动扩 散、离子导入和电穿孔实验。
离子导入时在供应室和接受室中都插入Ag/Agcl电极， 供应室电极接离子导入仪负极，接受室电极接离子导入仪正极，控制电流强度为0.5mA/cm 2。
电穿孔导入时在供应室和接受室亦都插入Ag/Agcl电极，供应室电极接电穿孔仪负极， 接受室电极接电穿孔仪正极，其工作条件为电压130V,波形为方波，占空比1∶1,脉冲持续时 间740ms或100ms,导入方式有连续给予200个脉冲或每半小时给予20个脉冲，共给予200个脉 冲。
, 百拇医药
实验中每隔一定时间将接受液全部取出，并补充等量新鲜pH7.4磷酸缓冲液。
1.5 分析与计算
取接受液，按双波长法分别在276nm和350nm处测定吸 收度，取差值根据标准曲线方程，计算接受液中药物浓度，再根据接受室容积及有效扩散面 积，计算各时间全单位面积累积渗透量，取直线段以单位面积累积渗透量与时间回归，其叙 率即为渗透速率J。
2 结果与讨论
2.1 电穿孔及离子导入时双氯芬酸钠经皮渗透的影响
双氯芬酸钠饱和水溶液经 皮被动扩散，离子导入及电穿孔透皮速率见表1，从表中可见直流电导入和电穿孔均能显著 促进双氯芬酸钠经过鼠皮的渗透，而且电穿孔导入的促渗效果更为显著，其增渗倍数达到 25.1倍。直流电离子导入主要利用电流的吸引和排斥作用从而促进解离型药物的经皮渗透 ，当然电流也可能会引起皮肤渗透性能的改变，如引起角质层脂质排列的混乱及所引起的电 渗流作用等，但对于象双氯芬酸钠这类小分子解离型药物，电场对药物的直接作用占有主导 地位。电穿孔的作用机制则主要表现为对皮肤的作用，在瞬间高压下引起脂质双层形成可逆 性孔道，国外有报道利用高达500～1000V的高压瞬间导入(ms或μs)肝素或美托洛尔等，其 促渗作用明显且不对皮肤造成不可逆的损失[4,5],本文的研究表明电穿孔也能显著 促进小分子离子型药物的经皮渗透，且与采用较高电流强度(0.5mA/cm2,超过此电流强度 可能会引起皮肤不可逆改变)的离子导入相对，其促渗作用更为明显。
, 百拇医药
表1 双氯芬酸钠饱和水溶液经皮被动扩散，离子导入及 电穿孔透皮速率/n=4
被动扩散
离子导入
电穿孔*1
透皮速率
(μg/h.cm2)
24.4±0.25
183±40.5
613±72.3
ER*2
1.0
, 百拇医药
7.5
25.1
注：*1电穿孔条件为电压130V，脉冲时间740ms，占空比1∶1； *2增渗倍数，为离子导入或电穿孔后药物的透皮速率与其被动扩散透皮速率之比
2.2 不同脉冲时间及不同脉冲形式对双氯芬酸钠经皮渗透的 影响
脉冲时间的长短不仅会影响药物的经皮渗透，也可能会影响模型皮肤的完整性及渗透 性，为了考察这方面的影响，采用脉冲时间分别为740ms和100ms的电穿孔导入及以两种方式 发放的200个脉冲，来观察对小分子离子型药物经皮渗透的影响结果见表2。从表中显示脉冲 时间延长，其促渗效果较为显著，若缩短脉冲时间如本文中100ms脉冲电穿孔其促渗作用与0 .5mA/cm2离子导入并无明显差异，这可能与其施加于皮肤表面的电量有关，同样200个脉 冲，脉冲时间延长则施加于皮肤的电量增加，其致孔作用较为强烈，从而使得药物能大量通 过。另外，一次给予200个脉冲和分次给予200个脉冲从药物透皮速率上无明显差别，这也证 明了上述论点即施加于皮肤上的电量是经皮电穿孔导入的一个重要指标。
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表2 不同脉冲方式及脉冲时间对双氯芬酸钠经皮电穿孔 影响/n=4 脉冲方式
脉冲时间
透皮速率(μg/h.cm2)
1*1
740
613±72.3
100
278±17.6
2*2
740
566±43.7
, 百拇医药
100
284±25.5
注：*1脉冲方式1为连续给予200个 脉冲；*2脉冲方式2为每半小时给予20个脉冲，共给予200个
2.3 电穿孔和离子导入对皮肤的影响
在实验中，离子导入和电穿孔结 束后均进行了皮肤刺激性的初步考察，主要从两个方面观察：一是观察外观有无红斑，水泡 及电灼伤现象；二是停止导入后看透皮速率是否明显下降并最终能恢复到被动扩散水平，结 果显示无论离子导入或电穿孔导入后均无肉眼可见的皮肤损伤出现，同时其渗透均在2～3h内恢复被动扩散水平，有关进一步刺激性研究将另文报道。国外有文献报道500～1000V,ms 或μs级电穿孔导入对皮肤的损伤并不比离子导入所导致的损伤更严重[3],而且根 据报道，事实上电穿孔时只有30%的外加脉冲电压可真正施加于皮肤上[6，7],就本 实验电穿孔导入条件下，电压仅为40V，所以对皮肤不致造成不可逆的损伤。
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国家自然科学基金资助项目(39670857)
参考文献
1，Hager DF,Laubach MJ,Sharkey JW,et al. In vitro iontophoretic delivery of CQA 206-291:influence of ethanol.J Controlle d Release,1993,23∶175.
2，Weaver JC.Electroporation:a general phenomenon fo r manipulating cell and tissue.J Cell Biochem,1993,51∶426.
3，Riviere JE,Monteiro-Riviere NA,Rogers RA,e t al.Pulsatile transdermal delivery of LHRH using electroporation:drug del ivery and skin toxicology.J Controlled Release,1995,36∶229.
, 百拇医药
4，Pransnitz MR,Edelman ER,Gimm JA,et al .Transdermal delivery of heparin by skin electroporation.Biol Techonology,1991,1 3∶1205.
5，Vanbever R,Lecouturier N,Preat V.Transdermal deli very of metoprolol by electroporation.Pharm Res,1994,11∶1657.
6，Vanbever R,Boulenge EL,Preat V.Transdermal delive ry of fentany by electroporation I.influence of electrical factors.Pharm Res,199 6,13∶559.
7，胡巧红，高建青，梁文权，等.电穿孔技术促进萘普生经 皮渗透的研究.中国现代应用药学，2000，17(5)∶377.
收稿日期：1999-11-03, http://www.100md.com
单位：包家立(浙江大学生物医学工程研究所 杭州 310031)；陈文莉(杭州新星制药厂 杭州 310015)；高建青 梁文权 胡巧红(浙江大学药学院)
关键词：双氯芬酸钠；经皮渗透；电穿孔；离子导入
中国现代应用药学000612 摘要 目的：考察离子导入和电穿孔对双氯芬酸钠经皮渗透的影 响。方法：采用双室扩散池和SD大鼠皮，进行双氯芬酸钠饱和水溶液经 皮被动扩散、离子导入(0.5mA/cm2)和电穿孔导入(130V,740ms或100ms,200个脉冲，方波 ，占空比1∶1)的研究。结果：电穿孔和离子导入均能显著促进双氯芬酸 钠的经皮渗透，其增渗倍数分别为25.1和7.5。延长脉冲时间将改善电穿孔的促渗效果，初 步研究表明本实验条件的电穿孔及离子导入未引起皮肤的损伤。结论： 电穿孔技术可用于促进小分子解离型药物的经皮渗透。
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Study on transdermal electroporation and intophoresis of diclofenac sod ium in vitro
Chen Wenli(Chen WL),Gao Jianqing(Gao JQ),Bao Jiali (Bao JL),et al
(Hangzhou Xinxing Pharmaceutical Factory,Hangzhou 310015)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the influe nce of electroporation and iontophoresis on transdermal delivery of diclofenac s odium.METHOD:Valia-Chien two-chamber diffusion cells and SD rat sk in were employed.The experiments of passive diffusion,transdermal iontophoresis( 0.5mA/cm2) and electropbration(130V of voltage,740 ms or 100 ms of pulse time, 200 pulses,square weave,and on-off=1∶1) of diclofenac sodium saturated solutio n were carried out.RESULTS:Electroporation and iontophoresis could n otably promote the transdermal delivery of diclofenac sodium and the ERs were 25.1 and 7.5 respectively.The enhance effects was improved as the increasing o f pulse time.The primary investigation showed that electroporation and iontophor esis which under the conditions in this experiment might not create the damage f or skin.CONCLUSION:Electroporation can be used to enhance the transd ermal delivery of small molecule and charged drugs.
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KEY WORDS diclofenac sodium,transdermal permeation,electroporation, iontophoresis
经皮离子导入技术是利用电场对药物与皮肤的作用而促进 药物尤其是离子型药物经皮渗透的方法[1]。电穿孔技术是将瞬间高压脉冲施加于 细胞或脂质双层膜，使之产生暂时性水性孔道，从而将药物导入细胞或膜内，该技术最先被 应用于DNA导入和酶导入等[2]。美国加州大学药学院、麻省理工学院和Cygnus公司 等将电穿孔技术应用于药物的经皮渗透，能显著促进一些药物尤其是多肽类药物通过皮肤的 转运，其促渗机制与普通的离子导入有较大的差异[3],但目前国内对电穿孔经皮给 药实验研究报道尚未出现，本文考察了双氯芬酸钠分别采用0.5mA/cm2电流强度的离子导 入和不同脉冲时间的高压电穿孔作用下的体外透皮速率，并与其被动扩散进行了比较。
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1 材料与方法
1.1 药品与仪器
双氯芬酸钠(江苏卜 弋生化制药厂)；离子导入仪(自制);OX4-1型经皮给药电穿孔仪(浙江大学生物医学工程研 究所);DU-65分光光度计(Beckman公司Ag/Agcl电极(自制);Valia-Chien双室扩散池( 自制，有效扩散面积0.5cm2,按受室体积4ml);CS501型超级恒温水浴(重压试验设备厂);SD大 鼠(浙江大学实验动物中心)；其余试剂均为分析纯。
1.2 双氯芬酸钠标准曲线的制备
精密称取双氯芬酸钠100mg,用pH7.4磷 酸盐缓冲液溶解并稀释至1000ml,分别移取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0和6.0ml于50ml量瓶中 ，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，在λ276nm处测定吸收度，得标准曲线为:C(μg/ml)=32.4224A-0.6949,r=0.9993,n=3。
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1.3 模型皮肤的制备
取重约200g的雄性SD大鼠，断颈处死，剪去腹部 皮肤毛，剪取皮肤，剥离皮下组织，在生理盐水中浸洗30min后使用。
1.4 双氯芬酸钠饱和水溶液经皮渗透实验
采用Valia-Chien双室扩散 池，以大鼠皮为模型皮肤，夹于两室之间，角质层面向供应室，真皮层面向接受室，供应室 中放置双氯芬酸钠的饱和水溶液，接受室中放置pH7.4磷酸盐缓冲液，分别进行药物被动扩 散、离子导入和电穿孔实验。
离子导入时在供应室和接受室中都插入Ag/Agcl电极， 供应室电极接离子导入仪负极，接受室电极接离子导入仪正极，控制电流强度为0.5mA/cm 2。
电穿孔导入时在供应室和接受室亦都插入Ag/Agcl电极，供应室电极接电穿孔仪负极， 接受室电极接电穿孔仪正极，其工作条件为电压130V,波形为方波，占空比1∶1,脉冲持续时 间740ms或100ms,导入方式有连续给予200个脉冲或每半小时给予20个脉冲，共给予200个脉 冲。
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实验中每隔一定时间将接受液全部取出，并补充等量新鲜pH7.4磷酸缓冲液。
1.5 分析与计算
取接受液，按双波长法分别在276nm和350nm处测定吸 收度，取差值根据标准曲线方程，计算接受液中药物浓度，再根据接受室容积及有效扩散面 积，计算各时间全单位面积累积渗透量，取直线段以单位面积累积渗透量与时间回归，其叙 率即为渗透速率J。
2 结果与讨论
2.1 电穿孔及离子导入时双氯芬酸钠经皮渗透的影响
双氯芬酸钠饱和水溶液经 皮被动扩散，离子导入及电穿孔透皮速率见表1，从表中可见直流电导入和电穿孔均能显著 促进双氯芬酸钠经过鼠皮的渗透，而且电穿孔导入的促渗效果更为显著，其增渗倍数达到 25.1倍。直流电离子导入主要利用电流的吸引和排斥作用从而促进解离型药物的经皮渗透 ，当然电流也可能会引起皮肤渗透性能的改变，如引起角质层脂质排列的混乱及所引起的电 渗流作用等，但对于象双氯芬酸钠这类小分子解离型药物，电场对药物的直接作用占有主导 地位。电穿孔的作用机制则主要表现为对皮肤的作用，在瞬间高压下引起脂质双层形成可逆 性孔道，国外有报道利用高达500～1000V的高压瞬间导入(ms或μs)肝素或美托洛尔等，其 促渗作用明显且不对皮肤造成不可逆的损失[4,5],本文的研究表明电穿孔也能显著 促进小分子离子型药物的经皮渗透，且与采用较高电流强度(0.5mA/cm2,超过此电流强度 可能会引起皮肤不可逆改变)的离子导入相对，其促渗作用更为明显。
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表1 双氯芬酸钠饱和水溶液经皮被动扩散，离子导入及 电穿孔透皮速率/n=4
被动扩散
离子导入
电穿孔*1
透皮速率
(μg/h.cm2)
24.4±0.25
183±40.5
613±72.3
ER*2
1.0
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7.5
25.1
注：*1电穿孔条件为电压130V，脉冲时间740ms，占空比1∶1； *2增渗倍数，为离子导入或电穿孔后药物的透皮速率与其被动扩散透皮速率之比
2.2 不同脉冲时间及不同脉冲形式对双氯芬酸钠经皮渗透的 影响
脉冲时间的长短不仅会影响药物的经皮渗透，也可能会影响模型皮肤的完整性及渗透 性，为了考察这方面的影响，采用脉冲时间分别为740ms和100ms的电穿孔导入及以两种方式 发放的200个脉冲，来观察对小分子离子型药物经皮渗透的影响结果见表2。从表中显示脉冲 时间延长，其促渗效果较为显著，若缩短脉冲时间如本文中100ms脉冲电穿孔其促渗作用与0 .5mA/cm2离子导入并无明显差异，这可能与其施加于皮肤表面的电量有关，同样200个脉 冲，脉冲时间延长则施加于皮肤的电量增加，其致孔作用较为强烈，从而使得药物能大量通 过。另外，一次给予200个脉冲和分次给予200个脉冲从药物透皮速率上无明显差别，这也证 明了上述论点即施加于皮肤上的电量是经皮电穿孔导入的一个重要指标。
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表2 不同脉冲方式及脉冲时间对双氯芬酸钠经皮电穿孔 影响/n=4 脉冲方式
脉冲时间
透皮速率(μg/h.cm2)
1*1
740
613±72.3
100
278±17.6
2*2
740
566±43.7
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100
284±25.5
注：*1脉冲方式1为连续给予200个 脉冲；*2脉冲方式2为每半小时给予20个脉冲，共给予200个
2.3 电穿孔和离子导入对皮肤的影响
在实验中，离子导入和电穿孔结 束后均进行了皮肤刺激性的初步考察，主要从两个方面观察：一是观察外观有无红斑，水泡 及电灼伤现象；二是停止导入后看透皮速率是否明显下降并最终能恢复到被动扩散水平，结 果显示无论离子导入或电穿孔导入后均无肉眼可见的皮肤损伤出现，同时其渗透均在2～3h内恢复被动扩散水平，有关进一步刺激性研究将另文报道。国外有文献报道500～1000V,ms 或μs级电穿孔导入对皮肤的损伤并不比离子导入所导致的损伤更严重[3],而且根 据报道，事实上电穿孔时只有30%的外加脉冲电压可真正施加于皮肤上[6，7],就本 实验电穿孔导入条件下，电压仅为40V，所以对皮肤不致造成不可逆的损伤。
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国家自然科学基金资助项目(39670857)
参考文献
1，Hager DF,Laubach MJ,Sharkey JW,et al. In vitro iontophoretic delivery of CQA 206-291:influence of ethanol.J Controlle d Release,1993,23∶175.
2，Weaver JC.Electroporation:a general phenomenon fo r manipulating cell and tissue.J Cell Biochem,1993,51∶426.
3，Riviere JE,Monteiro-Riviere NA,Rogers RA,e t al.Pulsatile transdermal delivery of LHRH using electroporation:drug del ivery and skin toxicology.J Controlled Release,1995,36∶229.
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4，Pransnitz MR,Edelman ER,Gimm JA,et al .Transdermal delivery of heparin by skin electroporation.Biol Techonology,1991,1 3∶1205.
5，Vanbever R,Lecouturier N,Preat V.Transdermal deli very of metoprolol by electroporation.Pharm Res,1994,11∶1657.
6，Vanbever R,Boulenge EL,Preat V.Transdermal delive ry of fentany by electroporation I.influence of electrical factors.Pharm Res,199 6,13∶559.
7，胡巧红，高建青，梁文权，等.电穿孔技术促进萘普生经 皮渗透的研究.中国现代应用药学，2000，17(5)∶377.
收稿日期：1999-11-03, http://www.100md.com