肌苷注射液细菌内毒素检查法的研究
作者：王晓华 姚治
单位：浙江省药品检验所 杭州 310004
关键词：
中国现代应用药学000624 卫生部药品标准收载了肌苷注射液(2ml:100mg),并采用家兔法进行热源检查，随着鲎试剂法本身的发展和进步以及在我国的应用范围的扩大，用鲎试剂法实验取代家兔法进行细菌内毒素检查已是必然的趋势，本文采用了细菌内毒素定量分析技术-动态浊度法对肌苷注射液进行干扰试验，结果报告如下。
1 实验材料
1.1 仪器 BET16细菌内毒素测定仪(天津大学无线电厂)。
1.2 试剂 肌苷注射液(50mg/ml),批号971127,971128和980421,江苏武进制药厂，三批样品均经热原检查合格。鲎试剂，批号980419A,灵敏度为0.03Eu/ml,装量2.2ml,细菌内毒素检查用水(以下简称BET水)，批号981005,规格5ml,均由湛江安度斯生物有限公司提供。内毒素标准对照品，批号:9808,40Eu/支(中国药品生物制品检定所)。
, http://www.100md.com
2 实验方法和结果[1，2]
2.1 标准曲线的建立 取鲎试剂一支，加BET水2.2ml,轻轻振摇使其溶解。各取0.1ml分装于已去除内毒素的试管中，待用。取内毒素对照品一支(40Eu),加BET水1.0ml,于旋涡混合器上混合15min，按下列步骤配置成一系列的内毒素对照品溶液：取上述溶液0.2ml+BET水1.4ml,得①对照品溶液5.0Eu/ml；取①溶液0.4ml+BET水1.6ml,得②对照品溶液1.0Eu/ml；取②溶液1.0ml+BET水1.0ml,得③对照品溶液0.5Eu/ml；取③溶液1.0ml+BET水1.0ml,得④对照品溶液0.25Eu/ml；取④溶液1.0ml+BET水1.0ml,得⑤对照品溶液0.125Eu/ml；取⑤溶液1.0ml+BET水1.0ml,得⑥对照品溶液0.0625Eu/ml；取⑥溶液1.0ml+BET水1.0ml,得⑦对照品溶液0.03125Eu/ml。在稀释过程中，每稀释一步均需在旋涡混合器上混合30s。由低浓度至高浓度依次取0.03125,0.0625,0.125,0.5,1.0和5.0Eu/ml的内毒素对照品溶液各0.2ml,加入上述鲎试剂试管中，每个浓度平行2支，轻轻摇匀后置仪器中，由计算机控制反应，自动采集数据和处理数据。得到本批鲎试剂的反应标准曲线为:log T=2.83423-0.23475log C,r=-0.994,线性范围0.03～5.0Eu/ml,符合规定。
, 百拇医药
2.2 样品液的干扰预实验 用BET水将内毒素对照品配成不同浓度的溶液(Ⅰ)，同时用不同浓度的样品液(BET水稀释)同法配成含与(Ⅰ)相同浓度内毒素对照品的溶液(Ⅱ)即样品内毒素强化液。同1.3分别取Ⅰ、Ⅱ各0.2ml加入0.1ml鲎试剂试管中，各浓度平行2支，轻轻摇匀后置仪器中，由计算机控制反应，自动采集数据和处理数据，得到实测的内毒素浓度CⅠ和CⅡ。以CⅡ/CⅠ作为干扰系数F(内毒素回收率)。对批号971128的样品进行测定，结果见表1。
表1 肌苷注射液(原液)鲎试验干扰预实验结果 样品浓度
50/mg.ml-1
16/mg.ml-1
, 百拇医药 8/mg.ml-1
CⅠ
CⅡ
F
CⅠ
CⅡ
F
CⅠ
CⅡ
F
1.982
, 百拇医药
<0.03
<1%
2.011
0.986
0.490
1.876
1.882
1.00
0.936
<0.03
<1%
0.993
0.401
, http://www.100md.com
0.404
0.963
0.988
1.03
0.336
<0.03
<1%
0.332
0.145
0.450
0.336
0.352
1.05
, http://www.100md.com
2.113
<0.03
<1%
1.836
0.642
0.350
1.945
1.938
0.996
1.123
<0.03
<1%
0.897
, 百拇医药
0.313
0.349
0.997
1.023
1.03
0.362
<0.03
<1%
0.378
0.195
0.515
0.310
0.298
, http://www.100md.com
0.961
F±SD
<1%
0.425±0.07
1.01±0.03
从以上结果可以看出样品原液对鲎试验有较强抑制作用，其回收率小于1%，16mg/ml稀释液也有一定的抑制作用，回收率在50%以下，而8mg/ml的稀释液则无干扰作用。
2.3 样品8mg/ml稀释液的干扰确证实验 将样品液用BET水稀释成8mg/ml后用同2.2的方法进行试验。对三批样品进行试验，结果见表2。表2 肌苷注射液(8mg/ml稀释液)鲎试验干扰实验结果 批 号
971127
, http://www.100md.com
971128
980421
CⅠ
CⅡ
F
CⅠ
CⅡ
F
CⅠ
CⅡ
F
1.897
, 百拇医药
1.797
0.947
2.168
2.143
0.988
1.653
1.587
0.960
0.996
0.972
0.976
1.218
1.134
, 百拇医药
0.931
0.877
0.825
0.941
0.332
0.341
1.03
0.322
0.331
1.03
0.245
0.265
1.08
, 百拇医药
2.124
2.103
0.990
1.876
1.885
1.00
1.786
1.795
1.00
1.115
1.216
1.09
0.965
, http://www.100md.com
1.018
1.05
0.786
0.743
0.945
0.296
0.276
0.932
0.278
0.311
1.12
0.201
0.221
, 百拇医药
1.10
F±SD
0.994±0.06
1.02±0.06
1.00±0.07
三批样品的结果无显著性差异(P>0.05)。
由表2的结果可以看出，样品8mg/ml稀释液的内毒素回收率在100%左右，表明对鲎试验无干扰。
3 样品细菌内毒素检查理论限值L的计算和常规鲎试验法的建立[3～5]
95版药典确定的肌苷注射液热原检查剂量为家兔1.6ml/kg(80mg/kg),静脉注射用药的内毒素限值为5Eu/kg,因此肌苷注射液的内毒素理论限值L应为3.125Eu/ml(5÷1.6),或0.0625Eu/mg。常规检查计算样品最大可稀释倍数(MVD)时可按此限值计算。对于8mg/ml的样品稀释液，其L值折算为0.5Eu/ml。凝胶法和浊度法常用的鲎试剂(灵敏度λ为0.5,0.25,0.125,0.06和0.03Eu/ml等)都是适用的，样品检测时的最大可稀释倍数(MVD)均在1∶1(L÷λ)倍以上，所以用鲎试验法来检测肌苷注射液的内毒素是完全可行的。
, 百拇医药
4 讨 论
与凝胶法的试验相比，内毒素定量分析技术-动态法最大限度地消除了内毒素标准品对试验结果的影响，在标准曲线建立以后，试验结果不再受内毒素标准品准确性的影响。使试验结果的重现性得以保证。此外，建立在定量分析基础上的抑制/增强系数更具科学性，对样品的干扰行为的描述更为准确。这是凝胶法所不及的。本实验结果表明肌苷注射液原液以及稀释液(16mg/ml)的内毒素回收率在50%以下，表明对鲎试验有干扰，样品稀释至8mg/ml后干扰消除，可用鲎试验。
参考文献
1，胡冠时，苏桂兰，等.鲎试剂反应动力学.前卫药学杂志，1994，8∶20.
2，Michale E.Dawson inhibition or enhancement testing.Lalupdate,1997,15(1)(http//.www.acciusa.com).
3，USP.ⅩⅩⅢ∶1696.
4，European Pharmacopoeia Third Edition,Supplement,1998∶29.
5，中国药典.二部.2000∶附录86.
收稿日期：1999-07-26, 百拇医药
单位：浙江省药品检验所 杭州 310004
关键词：
中国现代应用药学000624 卫生部药品标准收载了肌苷注射液(2ml:100mg),并采用家兔法进行热源检查，随着鲎试剂法本身的发展和进步以及在我国的应用范围的扩大，用鲎试剂法实验取代家兔法进行细菌内毒素检查已是必然的趋势，本文采用了细菌内毒素定量分析技术-动态浊度法对肌苷注射液进行干扰试验，结果报告如下。
1 实验材料
1.1 仪器 BET16细菌内毒素测定仪(天津大学无线电厂)。
1.2 试剂 肌苷注射液(50mg/ml),批号971127,971128和980421,江苏武进制药厂，三批样品均经热原检查合格。鲎试剂，批号980419A,灵敏度为0.03Eu/ml,装量2.2ml,细菌内毒素检查用水(以下简称BET水)，批号981005,规格5ml,均由湛江安度斯生物有限公司提供。内毒素标准对照品，批号:9808,40Eu/支(中国药品生物制品检定所)。
, http://www.100md.com
2 实验方法和结果[1，2]
2.1 标准曲线的建立 取鲎试剂一支，加BET水2.2ml,轻轻振摇使其溶解。各取0.1ml分装于已去除内毒素的试管中，待用。取内毒素对照品一支(40Eu),加BET水1.0ml,于旋涡混合器上混合15min，按下列步骤配置成一系列的内毒素对照品溶液：取上述溶液0.2ml+BET水1.4ml,得①对照品溶液5.0Eu/ml；取①溶液0.4ml+BET水1.6ml,得②对照品溶液1.0Eu/ml；取②溶液1.0ml+BET水1.0ml,得③对照品溶液0.5Eu/ml；取③溶液1.0ml+BET水1.0ml,得④对照品溶液0.25Eu/ml；取④溶液1.0ml+BET水1.0ml,得⑤对照品溶液0.125Eu/ml；取⑤溶液1.0ml+BET水1.0ml,得⑥对照品溶液0.0625Eu/ml；取⑥溶液1.0ml+BET水1.0ml,得⑦对照品溶液0.03125Eu/ml。在稀释过程中，每稀释一步均需在旋涡混合器上混合30s。由低浓度至高浓度依次取0.03125,0.0625,0.125,0.5,1.0和5.0Eu/ml的内毒素对照品溶液各0.2ml,加入上述鲎试剂试管中，每个浓度平行2支，轻轻摇匀后置仪器中，由计算机控制反应，自动采集数据和处理数据。得到本批鲎试剂的反应标准曲线为:log T=2.83423-0.23475log C,r=-0.994,线性范围0.03～5.0Eu/ml,符合规定。
, 百拇医药
2.2 样品液的干扰预实验 用BET水将内毒素对照品配成不同浓度的溶液(Ⅰ)，同时用不同浓度的样品液(BET水稀释)同法配成含与(Ⅰ)相同浓度内毒素对照品的溶液(Ⅱ)即样品内毒素强化液。同1.3分别取Ⅰ、Ⅱ各0.2ml加入0.1ml鲎试剂试管中，各浓度平行2支，轻轻摇匀后置仪器中，由计算机控制反应，自动采集数据和处理数据，得到实测的内毒素浓度CⅠ和CⅡ。以CⅡ/CⅠ作为干扰系数F(内毒素回收率)。对批号971128的样品进行测定，结果见表1。
表1 肌苷注射液(原液)鲎试验干扰预实验结果 样品浓度
50/mg.ml-1
16/mg.ml-1
, 百拇医药 8/mg.ml-1
CⅠ
CⅡ
F
CⅠ
CⅡ
F
CⅠ
CⅡ
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1.982
, 百拇医药
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0.490
1.876
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1.00
0.936
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0.401
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0.404
0.963
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0.336
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2.113
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1.836
0.642
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<0.03
<1%
0.897
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0.313
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0.997
1.023
1.03
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<0.03
<1%
0.378
0.195
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0.310
0.298
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0.961
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<1%
0.425±0.07
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从以上结果可以看出样品原液对鲎试验有较强抑制作用，其回收率小于1%，16mg/ml稀释液也有一定的抑制作用，回收率在50%以下，而8mg/ml的稀释液则无干扰作用。
2.3 样品8mg/ml稀释液的干扰确证实验 将样品液用BET水稀释成8mg/ml后用同2.2的方法进行试验。对三批样品进行试验，结果见表2。表2 肌苷注射液(8mg/ml稀释液)鲎试验干扰实验结果 批 号
971127
, http://www.100md.com
971128
980421
CⅠ
CⅡ
F
CⅠ
CⅡ
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CⅠ
CⅡ
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1.897
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1.797
0.947
2.168
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1.653
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1.134
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0.931
0.877
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0.322
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1.12
0.201
0.221
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1.10
F±SD
0.994±0.06
1.02±0.06
1.00±0.07
三批样品的结果无显著性差异(P>0.05)。
由表2的结果可以看出，样品8mg/ml稀释液的内毒素回收率在100%左右，表明对鲎试验无干扰。
3 样品细菌内毒素检查理论限值L的计算和常规鲎试验法的建立[3～5]
95版药典确定的肌苷注射液热原检查剂量为家兔1.6ml/kg(80mg/kg),静脉注射用药的内毒素限值为5Eu/kg,因此肌苷注射液的内毒素理论限值L应为3.125Eu/ml(5÷1.6),或0.0625Eu/mg。常规检查计算样品最大可稀释倍数(MVD)时可按此限值计算。对于8mg/ml的样品稀释液，其L值折算为0.5Eu/ml。凝胶法和浊度法常用的鲎试剂(灵敏度λ为0.5,0.25,0.125,0.06和0.03Eu/ml等)都是适用的，样品检测时的最大可稀释倍数(MVD)均在1∶1(L÷λ)倍以上，所以用鲎试验法来检测肌苷注射液的内毒素是完全可行的。
, 百拇医药
4 讨 论
与凝胶法的试验相比，内毒素定量分析技术-动态法最大限度地消除了内毒素标准品对试验结果的影响，在标准曲线建立以后，试验结果不再受内毒素标准品准确性的影响。使试验结果的重现性得以保证。此外，建立在定量分析基础上的抑制/增强系数更具科学性，对样品的干扰行为的描述更为准确。这是凝胶法所不及的。本实验结果表明肌苷注射液原液以及稀释液(16mg/ml)的内毒素回收率在50%以下，表明对鲎试验有干扰，样品稀释至8mg/ml后干扰消除，可用鲎试验。
参考文献
1，胡冠时，苏桂兰，等.鲎试剂反应动力学.前卫药学杂志，1994，8∶20.
2，Michale E.Dawson inhibition or enhancement testing.Lalupdate,1997,15(1)(http//.www.acciusa.com).
3，USP.ⅩⅩⅢ∶1696.
4，European Pharmacopoeia Third Edition,Supplement,1998∶29.
5，中国药典.二部.2000∶附录86.
收稿日期：1999-07-26, 百拇医药