高血压肝阳上亢证的分子机理研究
金益强 胡随瑜 鄢东红 刘爱平 唐发清 肖纯 谌兵来 王勇华
内容提要 目的：探讨高血压肝阳上亢证的分子机理。方法：应用高效液相色谱(HPLC)方法检测健康人、高血压病肝阳上亢证及肝肾阴虚证患者血浆去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)含量，并采用Southern Blot方法分析上述3组间酪氨酸羟化酶(TH)基因多态性；用PCR-SSCP方法分析高血压肝阳上亢证TH及单胺氧化酶A和B(MAOA，MAOB)基因相关微卫星多态性改变；同时，采用自发性高血压大鼠(SHR)加灌附子汤方法复制高血压肝阳上亢证动物模型，用免疫组织化学方法和原位杂交法分别测定该模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达水平。结果：高血压病肝阳上亢证患者血浆NE、E含量明显高于健康人组及肝肾阴虚组，其TH基因有显著扩增，且TH微卫星D11S4046中A1型明显增高；SHR肝阳上亢证模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达增强。结论：高血压肝阳上亢证具有TH基因显著扩增、TH mRNA及蛋白质表达增强的特点。提示TH基因的过度表达可能是高血压肝阳上亢证的分子机理。
, 百拇医药
关键词：高血压 肝阳上亢证 酪氨酸羟化酶 分子机理
肝阳上亢证是中医肝病主要证型之一，多见于高血压病(1)，其病理生理学基础已有较深入的研究(2，3)，但未见有关该证分子水平研究的报道。本研究在以往研究基础上探讨高血压肝阳上证的分子机理。
临床研究
1 临床资料 病例选自湖南医科大学附属湘雅医院，湖南省隆回县、绥宁县、新宁县、双牌县人民医院1997年10月～1998年5月的门诊和住院患者。采用病证结合方式选择研究对象100例。高血压病诊断标准按文献(4)，中医辨证标准参照文献(5)，其中Ⅰ期22例，Ⅱ期78例；肝阳上亢证70例，其中男38例，女32例；年龄38～75岁，平均(54.68±12.26)岁；肝肾阴虚证30例，其中男11例，女19例；年龄40～74岁，平均(59.67±8.83)岁；健康对照组选自本院职工及长沙市中心血站首次献血者，共30名，其中男14名，女16名；年龄29～65岁，平均(51.25±8.61)岁；经病史查询、体检、血象、胸透及心、肝、肾检查未发现异常。
, 百拇医药
2 方法
2.1 血样采集 受试者于清晨6：00～8：00空腹抽取肘静脉血，抽血前先休息15～30min，禁服影响单胺类代谢的血管活性药物及食物如香蕉、菠萝等。采血5ml，于4℃ 1000r/min离心20min，收集上清，存于-70℃冰箱中待测血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)；同时，另取2ml血用肝素抗凝，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，留作DNA提取。
2.2 NE、E的测定 采用Eisenhofer(6)方法。仪器用高效液相色谱仪(日本岛津公司产，LC-9A型)及电化学检测器(日本岛津公司产，L-ECD-6A型)。
2.3 DNA提取及Southern Blot分析 参照文献(7)。
2.4 高血压病肝阳上亢证酪氨酸羟化酶(TH)及单胺氧化酶(MAO)微卫星多态性分析 采用PCR-SSCP方法，参照文献(8)。
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2.5 统计学处理 计量资料结果用X±s表示，各组间比较采用方差分析及q检验，所有检验在SPSS统计软件包上完成，计数资料比较用χ2检验。
3 结果
3.1 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组血浆NE、E测定结果比较 见表1。说明肝阳上亢证组血浆NE、E明显高于健康人组和肝肾阴虚证组。
表1 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组血浆
NE、E测定结果 (pmol/L，X±s)
组 别
n
NE
E
, 百拇医药
健康人
30
1997.0±139.1
824.2±?61.3
肝阳上亢证
70
3922.4±716.7*△
1365.6±283.8*△
肝肾阴虚证
30
2271.3±360.3
, 百拇医药 773.1±135.7
注：与健康人组比较，*P<0.05；与肝肾阴虚证组比较，△P<0.05
3.2 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组TH基因Southern Blot杂交信号经MIAS300图像分析系统分析后结果比较 见表2。说明肝阳上亢证组TH基因扩增信号较其他两组明显增强。
表2 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组
TH基因杂交信号 (X±s)
组 别
n
TH cDNA杂交信号扫描
健康人
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10
128.63±17.63
肝阳上亢证
27
310.33±24.55*△
肝肾阴虚证
18
187.77±21.03
注：与健康人组比较，*P<0.05；与肝肾阴虚证组比较，△P<0.05
3.3 TH基因相关微卫星D11S4046位点扩增，检测出3种微卫星多态性A1、A2、A3，见图1。其在肝阳上亢证、肝肾阴虚证和健康人组分布，见表3。说明肝阳上亢证组TH相关微卫星D11S4046中A1型明显增加。
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表3 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾
阴虚证组D11S4046多态性分布
组别
n
A1
A2
A3
健康人
23
12(0.522)*
8(0.348)
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3(0.130)
肝阳上亢证
37
26(0.703)
6(0.162)
5(0.135)
肝肾阴虚证
30
11(0.367)*
10(0.333)
9(0.300)
注：与肝阳上亢证组比较，*P<0.05；( )内为基因频率
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图1 TH基因微卫星D11S4046
多态性分3型(A1，A2，A3)
3.4 MAOA基因相关微卫星DXS6810有3种多态性改变B1、B2、B3，见图2。其分布频率在健康人、肝阳上亢证及肝肾阴虚证3组间差异无显著性意义(P>0.05)。
图2 MAOA基因微卫星DXS6810
多态性分3型(B1，B2，B3)
, 百拇医药
3.5 MAOB基因相关微卫星DXS993亦有3种基因型，见图3。3组间分布频率差异无显著性意义(P>0.05)。
图3 MAOB基因微卫星DXS993
多态性分3型(C1，C2，C3)
实验研究
1 实验动物 正常Wistar大鼠10只，雌雄各半。3月龄，体重180～210g。由湖南医科大学实验动物中心提供；自发性高血压大鼠36只，雌雄各半，3月龄，体重180～210g，购自北京中国医学科学院阜外心血管病医院实验动物中心。
2 中药及制备 (1)附子汤：由单味制附子20g煎两次后，将药液合并浓缩为每毫升药液含0.1g生药。(2)潜阳方：由石决明、钩藤、黄芩、桑寄生、葛根、川牛膝等组成。煎两次后将药液合并浓缩为每毫升药液含1g生药。
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3 主要试剂及仪器 试剂：酪氨酸羟化酶单克隆抗体(一抗，鼠抗)：购自德国宝灵曼公司；TH寡核苷酸探针：由上海生物工程公司合成，其序列为：5’-CCTGCTTGGCATCCTGCTCTGAGA-3’；即用型ABC试剂盒：购自华美生物工程公司。NE、E、DHBA(内标)标准品均购自Sigma公司；微卫星引物设计均采用网上查阅：http://www.gdb.org/gdb-bin/genera。仪器：超低温冰箱(SANYO牌，日本产)；恒温冷冻切片机(SLEEMAINZ型，德国产)；高速台式离心机(5415C型，德国产)；显微镜(Olympus型，日本产)；图像分析系统(MIAS-300型，美国产)。
4 方法
4.1 自发性高血压大鼠(SHR)肝阳上亢证模型的复制 选用SHR加灌附子汤的方法造模(9)，每天20ml/kg体重灌胃，相当每天生药2g/kg体重，共4周。
, 百拇医药 4.2 动物分组与给药方法 (1)正常对照组(简称正常组，10只)：正常Wistar大鼠，普通饲养，不做处理。(2)自发性高血压组(简称SHR，8只)：SHR灌蒸馏水6周。(3)附子汤造模组(简称肝阳上亢组，8只)：SHR灌服附子汤4周，造模后不予治疗，从第5周开始灌服蒸馏水2周。(4)潜阳方治疗组(简称潜阳方组，10只)：SHR大鼠，灌服附子汤4周，第5周开始灌服中药潜阳方2周，每日灌服潜阳方煎剂20ml/kg，相当每天生药20g/kg体重，按动物体表面积系数折算，相当70kg成人临床剂量的1.9倍。
4.3 观测项目及检测方法
4.3.1 实验动物肾上腺组织TH蛋白质测定 采用免疫组织化学方法，参照文献(10)。
4.3.2 实验动物肾上腺组织TH mRNA表达 采用原位杂交方法，参照文献(11)。以上Southern Blot与TH mRNA及蛋白质表达结果均用MIAS-300型图像分析系统进行分析。
, 百拇医药
4.4 统计学处理 计量资料结果用X±s表示，各组间比较采用方差分析及q检验，所有检验在SPSS统计软件包上完成，计数资料比较用χ2检验。
5 结果
5.1 各组大鼠TH免疫组化阳性产物灰度扫描结果 见表4。灰度值是图像分析系统中用来表示图像透光率的参数。细胞内阳性产物浓度(或杂交信号)越高(深)，则透光率越低，灰度值亦低，反之则越大。肝阳上亢组灰度值最低，明显低于正常组及潜阳方组，均具有显著性差异(P<0.05)。表明肝阳上亢组TH免疫组化阳性产物最浓，即抗TH强阳性，说明TH蛋白水平明显增高；而经潜阳方治疗后，TH免疫组化阳性产物降低，TH蛋白水平下降。
表4 各组TH免疫组化阳性产物浓度灰度值比较 (X±s)
组 别
, 百拇医药 n
TH免疫组化阳性产物浓度灰度值
正 常
5
63.67±6.48
SHR
5
35.27±4.88**
肝阳上亢
5
24.96±8.34**
潜阳方
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5
50.96±5.29*△
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与肝阳上亢组比较，△P<0.01
5.2 各组大鼠TH原位杂交信号灰度扫描结果 见表5。肝阳上亢组TH基因原位杂交信号灰度值最低，明显低于正常组、SHR组及潜阳方组，均有显著性差异(P<0.05)；说明肝阳上亢组TH基因mRNA表达最强，TH基因mRNA明显上升，经中药潜阳方治疗后，TH mRNA下降。
表5 各组大鼠TH原位杂交信号灰度值比较 (X±s)
组 别
n
, 百拇医药
TH原位杂交信号灰度值
正 常
5
72.85±6.17
SHR
5
35.98±6.21**
肝阳上亢
5
22.16±1.48**
潜阳方
5
, 百拇医药
48.89±6.03*△
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与肝阳上亢组比较，△P<0.05
讨论
肝阳上亢证是中医肝病的主要证型之一，历代医家论理精详，平肝潜阳治法，方、药广泛应用于临床；本证的现代研究近10余年已取得很大进展，发现其病理生理学基础为外周交感—肾上腺髓质功能亢进，主要病理环节为外周血浆NE、E含量的增高(2)。儿茶酚胺(CA)包括NE、E、DA，在CA合成过程中，TH是起决定作用的限速酶，调节NE、E的合成。NE、E的含量间接反应TH活性，TH是高血压病因学的候选基因(12)。儿茶酚胺的分解则主要在MAOA和MAOB的作用下完成。本研究结果进一步验证了肝阳上亢证患者血浆NE、E含量明显高于健康人及肝肾阴虚证患者(P<0.05)；同时，经采用Southern Blot分析高血压病患者TH基因多态性，结果显示高血压病肝阳上亢证患者TH基因有明显扩增(P<0.05)。
, 百拇医药
微卫星(Microsatellite)即短串联重复序列(short tandem repeat, STR)，在人类基因组中广泛存在，约占真核生物基因组的5%，其基本单位是l～8bp的串联重复，多在基因编码区、内含子及非翻译区附近。人基因组中STR有(GT)n、(CA)n、(GA)n、(AA)n、(GG)n、(CAA)n和(CGG)n等，其中以(CA)n、(GT)n重复序列最多，大约分布着5～10万个散在的具有高度多态杂合性并符合孟德尔遗传的STR，即每30～60kb DNA就存在一个(CA)或(GT)重复序列，STR的产生一般认为是由于DNA复制和修复过程中DNA滑移及细胞分裂过程中染色体不等交换的结果。本研究选用(gdb)基因标准库中微卫星标志，D11S4046为酪氨酸羟化酶基因内含的微卫星标志，DXS6810及DXS993为单胺氧化酶内含的微卫星标志。D11S4046位于11pter-11qter为二核苷酸重复序列，扩增片段最小长度为187bp；DXS6810为四核苷酸重复，杂合度暂时不清楚，扩增最小片段为209bp；DXS993位于Xp11.4～Xp11.3之间，为(CT)n重复，杂合度为0.7921，扩增最长片段为312bp及292bp。本研究发现肝阳上亢证TH基因内含的微卫星D11S4046中A1型明显高于肝肾阴虚证组及健康人组；而MAOA与MAOB基因内含的微卫星标志在上述3组间无显著性差异，说明肝阳上亢证与TH有关，与MAOA及MAOB则关系不大。
, 百拇医药
本研究所复制的SHR肝阳上亢证模型具有血压稳定升高，易激惹程度增加，饮水量增加，旋转时间缩短，痛阈降低，肾小动脉硬化等近似人类高血压病肝阳上亢证的特征(9)；取不同组动物的肾上腺组织用免疫组织化学方法和原位杂交法进行TH基因表达研究，结果显示肝阳上亢组大鼠TH免疫组化阳性产物增高；TH基因原位杂交信号明显增强，说明该模型肾上腺组织TH mRNA及蛋白质水平均明显增加，进一步验证了肝阳上亢证与TH的关系。
因此，依据上述各点，笔者认为高血压肝阳上亢证的形成是因TH基因扩增导致TH基因mRNA及蛋白质过度表达，引起TH活性增加，使血浆NE、E增加所致，TH基因的过度表达可能是肝阳上亢证形成的分子机理，今后拟采取异病同证方式选择研究对象，进一步深入研究。
国家自然科学基金资助项目(No.39670890)
金益强(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
, 百拇医药
胡随瑜(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
鄢东红(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
刘爱平(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
唐发清(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
肖纯(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
谌兵来(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
王勇华(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
, 百拇医药 参考文献
1.陈国林，李 炜，胡随瑜，等.通过肝阳上亢证的辨证标准探讨证的研究方法.中国医药学报 1988；3(5)∶67—68.
2.金益强，黎杏群，陈国林，等.肝阳上亢证本质研究.中西医结合杂志 1988；8(3)∶136—140.
3.胡随瑜，刘湘华，刘尚明.经颅多谱勒超声扫描术对肝阳上亢证患者辨证诊断的初步评价.湖南医科大学学报 1997；22(2)∶131—133.
4.戴自英主编.实用内科学.第9版.北京：人民卫生出版社，1993∶1176—1177.
5.陈国林，潘其明，赵玉秋，等.中医肝病证候临床辨证标准的研究.中国医药学报 1990；5(1)∶66—73.
6.Eisenhofer G, Goldstein DS, Stult R, et al. Simutaneous Liq-uid Chromatographic determination of 3,4-dihydroxypheny-lglycal, catecholamines, and 3,4-dihydroxyphenylalamine in plasma, and their response to inhibition of monoamine oxidase. Clin Chem 1986;32(11)∶2030—2033.
, http://www.100md.com
7.姜 泊，张亚历，周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996∶137—139.
8.刘爱平，胡立宪.微卫星多态性检测时银染色和同位素技术比较.湖南医科大学学报 1996；21(2)∶169—171.
9.鄢东红，金益强，肖 纯，等.自发性高血压大鼠肝阳上亢证模型的复制.湖南中医学院学报 1999；19(4)∶37—39.
10.王 键，鞠 躬.大鼠垂体前叶中的TH-，ChAT-免疫阳性神经纤维.中国组织化学与细胞化学杂志 1997；6(2)∶129—132.
11.Dumas S, Pequignot JM, Ghilini G, et al. Plasticity of tyrosine hydroxylase gene expression in the rat nucleus tractus solitarius after ventilatory acclimatization to hypoxia. Mol Brain Res 1996；40∶188—194.
12.Sharma P, Hingorani A, Jia H, et al. Positive association of tyrosine hydroxylase microsatellite marker to essential hypertension. Hypertension 1998;32(4)∶676—682., http://www.100md.com
内容提要 目的：探讨高血压肝阳上亢证的分子机理。方法：应用高效液相色谱(HPLC)方法检测健康人、高血压病肝阳上亢证及肝肾阴虚证患者血浆去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)含量，并采用Southern Blot方法分析上述3组间酪氨酸羟化酶(TH)基因多态性；用PCR-SSCP方法分析高血压肝阳上亢证TH及单胺氧化酶A和B(MAOA，MAOB)基因相关微卫星多态性改变；同时，采用自发性高血压大鼠(SHR)加灌附子汤方法复制高血压肝阳上亢证动物模型，用免疫组织化学方法和原位杂交法分别测定该模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达水平。结果：高血压病肝阳上亢证患者血浆NE、E含量明显高于健康人组及肝肾阴虚组，其TH基因有显著扩增，且TH微卫星D11S4046中A1型明显增高；SHR肝阳上亢证模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达增强。结论：高血压肝阳上亢证具有TH基因显著扩增、TH mRNA及蛋白质表达增强的特点。提示TH基因的过度表达可能是高血压肝阳上亢证的分子机理。
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关键词：高血压 肝阳上亢证 酪氨酸羟化酶 分子机理
肝阳上亢证是中医肝病主要证型之一，多见于高血压病(1)，其病理生理学基础已有较深入的研究(2，3)，但未见有关该证分子水平研究的报道。本研究在以往研究基础上探讨高血压肝阳上证的分子机理。
临床研究
1 临床资料 病例选自湖南医科大学附属湘雅医院，湖南省隆回县、绥宁县、新宁县、双牌县人民医院1997年10月～1998年5月的门诊和住院患者。采用病证结合方式选择研究对象100例。高血压病诊断标准按文献(4)，中医辨证标准参照文献(5)，其中Ⅰ期22例，Ⅱ期78例；肝阳上亢证70例，其中男38例，女32例；年龄38～75岁，平均(54.68±12.26)岁；肝肾阴虚证30例，其中男11例，女19例；年龄40～74岁，平均(59.67±8.83)岁；健康对照组选自本院职工及长沙市中心血站首次献血者，共30名，其中男14名，女16名；年龄29～65岁，平均(51.25±8.61)岁；经病史查询、体检、血象、胸透及心、肝、肾检查未发现异常。
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2 方法
2.1 血样采集 受试者于清晨6：00～8：00空腹抽取肘静脉血，抽血前先休息15～30min，禁服影响单胺类代谢的血管活性药物及食物如香蕉、菠萝等。采血5ml，于4℃ 1000r/min离心20min，收集上清，存于-70℃冰箱中待测血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)；同时，另取2ml血用肝素抗凝，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，留作DNA提取。
2.2 NE、E的测定 采用Eisenhofer(6)方法。仪器用高效液相色谱仪(日本岛津公司产，LC-9A型)及电化学检测器(日本岛津公司产，L-ECD-6A型)。
2.3 DNA提取及Southern Blot分析 参照文献(7)。
2.4 高血压病肝阳上亢证酪氨酸羟化酶(TH)及单胺氧化酶(MAO)微卫星多态性分析 采用PCR-SSCP方法，参照文献(8)。
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2.5 统计学处理 计量资料结果用X±s表示，各组间比较采用方差分析及q检验，所有检验在SPSS统计软件包上完成，计数资料比较用χ2检验。
3 结果
3.1 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组血浆NE、E测定结果比较 见表1。说明肝阳上亢证组血浆NE、E明显高于健康人组和肝肾阴虚证组。
表1 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组血浆
NE、E测定结果 (pmol/L，X±s)
组 别
n
NE
E
, 百拇医药
健康人
30
1997.0±139.1
824.2±?61.3
肝阳上亢证
70
3922.4±716.7*△
1365.6±283.8*△
肝肾阴虚证
30
2271.3±360.3
, 百拇医药 773.1±135.7
注：与健康人组比较，*P<0.05；与肝肾阴虚证组比较，△P<0.05
3.2 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组TH基因Southern Blot杂交信号经MIAS300图像分析系统分析后结果比较 见表2。说明肝阳上亢证组TH基因扩增信号较其他两组明显增强。
表2 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组
TH基因杂交信号 (X±s)
组 别
n
TH cDNA杂交信号扫描
健康人
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10
128.63±17.63
肝阳上亢证
27
310.33±24.55*△
肝肾阴虚证
18
187.77±21.03
注：与健康人组比较，*P<0.05；与肝肾阴虚证组比较，△P<0.05
3.3 TH基因相关微卫星D11S4046位点扩增，检测出3种微卫星多态性A1、A2、A3，见图1。其在肝阳上亢证、肝肾阴虚证和健康人组分布，见表3。说明肝阳上亢证组TH相关微卫星D11S4046中A1型明显增加。
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表3 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾
阴虚证组D11S4046多态性分布
组别
n
A1
A2
A3
健康人
23
12(0.522)*
8(0.348)
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3(0.130)
肝阳上亢证
37
26(0.703)
6(0.162)
5(0.135)
肝肾阴虚证
30
11(0.367)*
10(0.333)
9(0.300)
注：与肝阳上亢证组比较，*P<0.05；( )内为基因频率
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图1 TH基因微卫星D11S4046
多态性分3型(A1，A2，A3)
3.4 MAOA基因相关微卫星DXS6810有3种多态性改变B1、B2、B3，见图2。其分布频率在健康人、肝阳上亢证及肝肾阴虚证3组间差异无显著性意义(P>0.05)。
图2 MAOA基因微卫星DXS6810
多态性分3型(B1，B2，B3)
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3.5 MAOB基因相关微卫星DXS993亦有3种基因型，见图3。3组间分布频率差异无显著性意义(P>0.05)。
图3 MAOB基因微卫星DXS993
多态性分3型(C1，C2，C3)
实验研究
1 实验动物 正常Wistar大鼠10只，雌雄各半。3月龄，体重180～210g。由湖南医科大学实验动物中心提供；自发性高血压大鼠36只，雌雄各半，3月龄，体重180～210g，购自北京中国医学科学院阜外心血管病医院实验动物中心。
2 中药及制备 (1)附子汤：由单味制附子20g煎两次后，将药液合并浓缩为每毫升药液含0.1g生药。(2)潜阳方：由石决明、钩藤、黄芩、桑寄生、葛根、川牛膝等组成。煎两次后将药液合并浓缩为每毫升药液含1g生药。
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3 主要试剂及仪器 试剂：酪氨酸羟化酶单克隆抗体(一抗，鼠抗)：购自德国宝灵曼公司；TH寡核苷酸探针：由上海生物工程公司合成，其序列为：5’-CCTGCTTGGCATCCTGCTCTGAGA-3’；即用型ABC试剂盒：购自华美生物工程公司。NE、E、DHBA(内标)标准品均购自Sigma公司；微卫星引物设计均采用网上查阅：http://www.gdb.org/gdb-bin/genera。仪器：超低温冰箱(SANYO牌，日本产)；恒温冷冻切片机(SLEEMAINZ型，德国产)；高速台式离心机(5415C型，德国产)；显微镜(Olympus型，日本产)；图像分析系统(MIAS-300型，美国产)。
4 方法
4.1 自发性高血压大鼠(SHR)肝阳上亢证模型的复制 选用SHR加灌附子汤的方法造模(9)，每天20ml/kg体重灌胃，相当每天生药2g/kg体重，共4周。
, 百拇医药 4.2 动物分组与给药方法 (1)正常对照组(简称正常组，10只)：正常Wistar大鼠，普通饲养，不做处理。(2)自发性高血压组(简称SHR，8只)：SHR灌蒸馏水6周。(3)附子汤造模组(简称肝阳上亢组，8只)：SHR灌服附子汤4周，造模后不予治疗，从第5周开始灌服蒸馏水2周。(4)潜阳方治疗组(简称潜阳方组，10只)：SHR大鼠，灌服附子汤4周，第5周开始灌服中药潜阳方2周，每日灌服潜阳方煎剂20ml/kg，相当每天生药20g/kg体重，按动物体表面积系数折算，相当70kg成人临床剂量的1.9倍。
4.3 观测项目及检测方法
4.3.1 实验动物肾上腺组织TH蛋白质测定 采用免疫组织化学方法，参照文献(10)。
4.3.2 实验动物肾上腺组织TH mRNA表达 采用原位杂交方法，参照文献(11)。以上Southern Blot与TH mRNA及蛋白质表达结果均用MIAS-300型图像分析系统进行分析。
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4.4 统计学处理 计量资料结果用X±s表示，各组间比较采用方差分析及q检验，所有检验在SPSS统计软件包上完成，计数资料比较用χ2检验。
5 结果
5.1 各组大鼠TH免疫组化阳性产物灰度扫描结果 见表4。灰度值是图像分析系统中用来表示图像透光率的参数。细胞内阳性产物浓度(或杂交信号)越高(深)，则透光率越低，灰度值亦低，反之则越大。肝阳上亢组灰度值最低，明显低于正常组及潜阳方组，均具有显著性差异(P<0.05)。表明肝阳上亢组TH免疫组化阳性产物最浓，即抗TH强阳性，说明TH蛋白水平明显增高；而经潜阳方治疗后，TH免疫组化阳性产物降低，TH蛋白水平下降。
表4 各组TH免疫组化阳性产物浓度灰度值比较 (X±s)
组 别
, 百拇医药 n
TH免疫组化阳性产物浓度灰度值
正 常
5
63.67±6.48
SHR
5
35.27±4.88**
肝阳上亢
5
24.96±8.34**
潜阳方
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5
50.96±5.29*△
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与肝阳上亢组比较，△P<0.01
5.2 各组大鼠TH原位杂交信号灰度扫描结果 见表5。肝阳上亢组TH基因原位杂交信号灰度值最低，明显低于正常组、SHR组及潜阳方组，均有显著性差异(P<0.05)；说明肝阳上亢组TH基因mRNA表达最强，TH基因mRNA明显上升，经中药潜阳方治疗后，TH mRNA下降。
表5 各组大鼠TH原位杂交信号灰度值比较 (X±s)
组 别
n
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TH原位杂交信号灰度值
正 常
5
72.85±6.17
SHR
5
35.98±6.21**
肝阳上亢
5
22.16±1.48**
潜阳方
5
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48.89±6.03*△
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与肝阳上亢组比较，△P<0.05
讨论
肝阳上亢证是中医肝病的主要证型之一，历代医家论理精详，平肝潜阳治法，方、药广泛应用于临床；本证的现代研究近10余年已取得很大进展，发现其病理生理学基础为外周交感—肾上腺髓质功能亢进，主要病理环节为外周血浆NE、E含量的增高(2)。儿茶酚胺(CA)包括NE、E、DA，在CA合成过程中，TH是起决定作用的限速酶，调节NE、E的合成。NE、E的含量间接反应TH活性，TH是高血压病因学的候选基因(12)。儿茶酚胺的分解则主要在MAOA和MAOB的作用下完成。本研究结果进一步验证了肝阳上亢证患者血浆NE、E含量明显高于健康人及肝肾阴虚证患者(P<0.05)；同时，经采用Southern Blot分析高血压病患者TH基因多态性，结果显示高血压病肝阳上亢证患者TH基因有明显扩增(P<0.05)。
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微卫星(Microsatellite)即短串联重复序列(short tandem repeat, STR)，在人类基因组中广泛存在，约占真核生物基因组的5%，其基本单位是l～8bp的串联重复，多在基因编码区、内含子及非翻译区附近。人基因组中STR有(GT)n、(CA)n、(GA)n、(AA)n、(GG)n、(CAA)n和(CGG)n等，其中以(CA)n、(GT)n重复序列最多，大约分布着5～10万个散在的具有高度多态杂合性并符合孟德尔遗传的STR，即每30～60kb DNA就存在一个(CA)或(GT)重复序列，STR的产生一般认为是由于DNA复制和修复过程中DNA滑移及细胞分裂过程中染色体不等交换的结果。本研究选用(gdb)基因标准库中微卫星标志，D11S4046为酪氨酸羟化酶基因内含的微卫星标志，DXS6810及DXS993为单胺氧化酶内含的微卫星标志。D11S4046位于11pter-11qter为二核苷酸重复序列，扩增片段最小长度为187bp；DXS6810为四核苷酸重复，杂合度暂时不清楚，扩增最小片段为209bp；DXS993位于Xp11.4～Xp11.3之间，为(CT)n重复，杂合度为0.7921，扩增最长片段为312bp及292bp。本研究发现肝阳上亢证TH基因内含的微卫星D11S4046中A1型明显高于肝肾阴虚证组及健康人组；而MAOA与MAOB基因内含的微卫星标志在上述3组间无显著性差异，说明肝阳上亢证与TH有关，与MAOA及MAOB则关系不大。
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本研究所复制的SHR肝阳上亢证模型具有血压稳定升高，易激惹程度增加，饮水量增加，旋转时间缩短，痛阈降低，肾小动脉硬化等近似人类高血压病肝阳上亢证的特征(9)；取不同组动物的肾上腺组织用免疫组织化学方法和原位杂交法进行TH基因表达研究，结果显示肝阳上亢组大鼠TH免疫组化阳性产物增高；TH基因原位杂交信号明显增强，说明该模型肾上腺组织TH mRNA及蛋白质水平均明显增加，进一步验证了肝阳上亢证与TH的关系。
因此，依据上述各点，笔者认为高血压肝阳上亢证的形成是因TH基因扩增导致TH基因mRNA及蛋白质过度表达，引起TH活性增加，使血浆NE、E增加所致，TH基因的过度表达可能是肝阳上亢证形成的分子机理，今后拟采取异病同证方式选择研究对象，进一步深入研究。
国家自然科学基金资助项目(No.39670890)
金益强(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
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胡随瑜(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
鄢东红(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
刘爱平(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
唐发清(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
肖纯(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
谌兵来(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
王勇华(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
, 百拇医药 参考文献
1.陈国林，李 炜，胡随瑜，等.通过肝阳上亢证的辨证标准探讨证的研究方法.中国医药学报 1988；3(5)∶67—68.
2.金益强，黎杏群，陈国林，等.肝阳上亢证本质研究.中西医结合杂志 1988；8(3)∶136—140.
3.胡随瑜，刘湘华，刘尚明.经颅多谱勒超声扫描术对肝阳上亢证患者辨证诊断的初步评价.湖南医科大学学报 1997；22(2)∶131—133.
4.戴自英主编.实用内科学.第9版.北京：人民卫生出版社，1993∶1176—1177.
5.陈国林，潘其明，赵玉秋，等.中医肝病证候临床辨证标准的研究.中国医药学报 1990；5(1)∶66—73.
6.Eisenhofer G, Goldstein DS, Stult R, et al. Simutaneous Liq-uid Chromatographic determination of 3,4-dihydroxypheny-lglycal, catecholamines, and 3,4-dihydroxyphenylalamine in plasma, and their response to inhibition of monoamine oxidase. Clin Chem 1986;32(11)∶2030—2033.
, http://www.100md.com
7.姜 泊，张亚历，周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996∶137—139.
8.刘爱平，胡立宪.微卫星多态性检测时银染色和同位素技术比较.湖南医科大学学报 1996；21(2)∶169—171.
9.鄢东红，金益强，肖 纯，等.自发性高血压大鼠肝阳上亢证模型的复制.湖南中医学院学报 1999；19(4)∶37—39.
10.王 键，鞠 躬.大鼠垂体前叶中的TH-，ChAT-免疫阳性神经纤维.中国组织化学与细胞化学杂志 1997；6(2)∶129—132.
11.Dumas S, Pequignot JM, Ghilini G, et al. Plasticity of tyrosine hydroxylase gene expression in the rat nucleus tractus solitarius after ventilatory acclimatization to hypoxia. Mol Brain Res 1996；40∶188—194.
12.Sharma P, Hingorani A, Jia H, et al. Positive association of tyrosine hydroxylase microsatellite marker to essential hypertension. Hypertension 1998;32(4)∶676—682., http://www.100md.com